相关申请的交叉引用
该申请要求于2002年8月9日提交的，美国临时申请号为60/402,228的申请的优先权，其公开内容在此整体引入作为参考。
联邦政府资助的声明
本发明的研究得到美国农业部小商业改革研究基金第2002-33610-11850号的部分资助。政府对本发明拥有一定的权利。
发明领域
本发明涉及促进未成熟和正发育动物的生长特性的方法，该动物为获得同样的效果正接受动物饲料和饲料添加剂。
发明背景
肉鸡(broiler chick)开食料(starter diets)含有相当数量的粗蛋白。大部分粗蛋白从传统的饲料组分如大豆粗粉中获得。大豆粗粉(48％粗蛋白含量)中约90％的粗蛋白对于家禽是高度可消化的(国家研究理事会(1994)。家禽的营养需求。9th修订版。国家研究院出版社.华盛顿区)。虽然传统的谷类-大豆粗粉开食料被认为是高度可消化的，但他们常含有多种复杂蛋白，由于雏鸡在生命早期缺乏必要的固有酶而不容易被消化(Uni等，(1999)家禽科学.78：215-222)。已建议在肉鸡食料中加入蛋白酶，但将蛋白酶加入谷物类基础的食料中的许多早期工作在禽类生长特性中没有带来任何改进(Jensen等，家禽科学.36：919-921)。
最近，用酶混合物，包括蛋白酶和淀粉酶添加到家禽食料中已在生长特性中产生了一些改进(Greenwood等(2002)，家禽科学.81(增刊.1)：25；Burrows等(2002)，家禽科学.81(增刊.1)：29；Short等(2002)，家禽科学.81(增刊.1)：136)。用含有木聚糖酶、蛋白酶和淀粉酶混合物的酶制剂添加谷类-大豆肉鸡开食料导致在14天和42天体重的促进，而对饲料转化率没有显著影响(Greenwood等，(2002)见前)。用同样的酶混合物添加谷物-大豆为基础的鸭食料，酶的添加导致促进体重增加以及饲料转化率(Burrows等，(2002)见前)。
家禽饲料进一步包含一些复杂的抗营养的和/或抗消化的化合物。一些化合物，如非淀粉多糖，吸收水到食糜的黏性物质中，其中营养物不会轻易被吸收(Odetallah，2000；Odetallah等.(2002)见前)。由于食糜粘度增加，消化酶和养分的扩散率降低，因此通过肠细胞阻碍养分的吸收。由于食糜粘度增加，脂分子形成和吸收也降低，因此减少了许多脂溶性化合物的吸收，包括脂溶性维生素，色素和脂类(Ferket和Veldkamp(1999)在：1998世界家禽科学协会论文集，p43-52)。因此，通过内溶酶活性达到的粘度降低在喂食高粘度谷类的雏鸡中起着可见的促进作用，并且多种酶的相对效力显示与其降低粘度的能力相关(Rotter等，(1990)J Sci.Food Agric.50：19-27)。
PWD-1角蛋白酶是一种最初从地衣芽孢杆菌PWD-1的生长培养基中纯化得到的酶(Williams等，(1990)Appl.Environ.Microbiol.56：1509-1515；Lin等，(1992)Appl.Environ.Microbiol.58：3271-3275)。PWD-1角蛋白酶水解宽范围的蛋白底物，包括酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白(Shih(2001)在：农业科学与技术国际会议论文集，北京，中国，p244-247)。PWD-1角蛋白酶已用于通过将商业化的羽毛(feather)粉和无细胞的角蛋白酶孵育过夜生产水解的羽毛粉(Carter(1998)细菌角蛋白酶：测定法的发展和养分的应用。博士论文，美国北卡罗来纳州大学，Raleigh，NC)。也可参见美国专利No.4,908,220；No.5,186,961；以及Shih的No.5,063,161 Shih等。
尽管如前所述，仍然需要另外的提高肉鸡生长特性的方法和达到同样目的的动物饲料添加剂。
发明概述
本发明提供提高接受动物饲料的未成熟和正发育动物生长特性的方法和组合物。
本发明一方面涉及一种养殖肉型家禽的方法，包括将谷类-大豆粗粉作为家禽食料喂养肉型家禽，其中饲料进一步包括对提高肉型家禽体重有效的一定数量的角蛋白酶。
本发明的另一方面涉及一种养殖肉型家禽的方法，包括将谷类-大 豆粗粉作为家禽开食料喂养肉型家禽，其中饲料进一步包括对提高肉型家禽体重有效的一定数量的角蛋白酶。
本发明更进一步的方面涉及促进肉型家禽中动物饲料饲料利用率的方法，包括将谷类-大豆粗粉作为家禽食料喂养肉型家禽，其中饲料进一步包括对促进肉型家禽中动物饲料饲料利用率有效的一定数量的角蛋白酶。
本发明另外的方面涉及提高肉型家禽中动物饲料消化率的方法，包括将谷类-大豆粗粉作为家禽食料喂养肉型家禽，其中饲料进一步包括对提高肉型家禽中动物饲料消化率有效的一定数量的角蛋白酶。
本发明的另一方面涉及减少肉型家禽中死亡率的方法，包括将谷类-大豆粗粉作为家禽开食料喂养肉型家禽，其中饲料进一步包括对减少肉型家禽中死亡率有效的一定数量的角蛋白酶。
本发明更进一步的方面涉及一种基本上由角蛋白酶、蛋白和碳水化合物组成的动物饲料。
本发明另外的方面涉及生产粗角蛋白酶酶提取物的方法。
本发明进一步涉及促进人工孵化禽类的营养状况，且因而增强未成熟禽类疾病抵抗力和生存力以获得更高水平生长特性肉型家禽。
发明详述
本发明上面所述以及其他方面将由此处描述的其他实施方案进行更详细的描述。可以理解的是，本发明可以不同方式实施，不得解释为受此处所述实施方案的限制。提供这些实施方案是为了使说明书全面而透彻，且向本领域技术人员全面传达本发明的范围。
此处本发明说明书中使用的术语仅是为了描述特定的实施方案而不是试图限制本发明。如本发明说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一”，“一个”和“这个”试图同样包括复数形式，除非上下文另外清楚地指出。
除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有作为本发明所属技术领域中普通技术人员通常理解的同样的含义。
所有出版物，美国专利申请、美国专利和此处引用的其他参考物整体引用作为参考。
如此处使用的，术语“肉型家禽”指本领域技术人员所理解的被生产或用于肉类消耗的任何禽类。该禽类的实施例包括，但不限于，鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、平胸类鸟等。
如此处使用的，术语“未成熟禽类”指缺乏完全的生长、分化或发育的一些禽类。该类别具有达到确定的成熟形态或状态的潜能。未成熟禽类可以是从约1天至50天大小的，优选约1天至21天大小的，更优选约1天至5天大小的，或具有与这些范围内禽类可比体重的。
如此处使用的，术语“正发育的禽类”指比未成熟禽类年龄更大或体重更重的一些禽类。
如此处使用的，术语“成熟禽类”指比正发育的禽类年龄更大或体重更重的一些禽类。
如此处使用的，术语“肉鸡”指生产或最终用于肉类消耗的未成熟鸡。
如此处使用的，术语“家禽食料”指能给予一些禽类以促进和维持家禽生长的食料。家禽食料可包含蛋白、维生素、矿物质、能量物质如脂肪、碳水化合物源，和添加的蛋白、抗生素，以及其他已知包括在动物饲料，尤其是，家禽食料中的物质和复合物。家禽食料包括，但不限于，开食料、生长型(grower-type)食料和育肥型(finisher-type)食料。“开食料”指可从出生或孵化出开始给予动物直到达到期望的年龄和/或体重的食料。“生长型食料”指可在完成起始生长阶段后给予动物的食料。“育肥型食料”指可在发育期间直到屠宰时给予动物的食料。
如此处使用的，术语“生长”或“生长特性”指在体重和/或体型(如，高度、宽度，直径、胸围，等等)上的增加超过在没有实施本方法和/或给予本发明的组合物时。生长可以指在整个动物或具体组织(如，通常为肌肉组织或特定肌肉)的质量(如，体重或体型)上的增加。备选地，生长可以指示一种组织对于另一组织质量的相对增加，尤其是，肌肉组织相对于其他组织的增加(如，脂肪组织)。生长进一步涉及营养状况和疾病抵抗力，其中营养状况的改进和/或疾病抵抗力的增强也表明生长特性的改进。
通过上面所述，按照本发明的实施方案涉及养殖肉型家禽的方法，包括喂养肉型家禽动物饲料家禽食料，其中饲料进一步包括角蛋 白酶且以对提高肉型家禽体重的有效量加入到家禽食料中。家禽食料可以是动物饲料，其包括蛋白质源，例如，大豆粉。鱼粉、血粉、家禽副产品(磨碎的家禽内脏)、肉粉、麦粉、油菜籽、芸苔和其组合。动物饲料进一步包括碳水化合物，例如，谷物、燕麦、大麦、高梁或其组合，可被磨成粉用于动物饲料。另外，动物饲料可包括维生素、矿物质、脂肪、抗生素和其他必要的或期望的物质或化合物。动物饲料家禽食料的非限制性实施例包括以谷类为基础的饲料，包括谷类，如大麦、谷物、大豆、小麦、麦属和黑麦。谷物-大豆、小麦-大豆和小麦-谷物-大豆、高梁-大豆和谷物-高梁-大豆代表按照本发明合适动物饲料的其他非限制性实施例。当家禽食料为谷物-大豆粉饲料时，谷物-大豆粉饲料包括约60％至约70％重量的谷物和约20％至约30％重量的大豆。
家禽食料可进一步分为开食料、生长型食料或育肥型食料。动物饲料，及家禽食料的精确组分和物理特性，将依赖于饲料所给予的动物种类、动物年龄和/或体重，以及饲养的延续时间，且可由本领域技术人员很容易地确定。
按照本发明的实施方案，养殖肉型家禽的方法不需要和角蛋白酶一起同时提供特异的含有角蛋白的底物。例如，在本发明的实施方案中，与Carter，1998中所述生产水解的羽毛粉不同，角蛋白酶可作为饲料添加剂直接添加入家禽食料中。因此，动物饲料可基本上不含角蛋白(如，不超过1％或2％重量的角蛋白)。
适于实现本发明的角蛋白酶可从地衣芽孢杆菌菌株PWD-1中获得，其在美国专利No.4,908,220和4,959,311中描述(在此引用的所有专利文献的说明书整体引入作为参考)。按照布达佩斯条约，该菌于1988年3月23日保藏于美国Rockville，MD的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，获得ATCC登记号No.53757。其他用于实现本发明的角蛋白酶可从多种细菌来源获得，如链霉菌。一般参见Nickerson的美国专利No.2,988,487；也可参见Goktan，D，“经特定微生物利用的角质材料的分解率”(No.207369b摘要)，Microbial Biochem.101，333(1984)；Daniels，G，“人毛发角蛋白经犬小孢子菌的消化”，J.Gen.Microbiol.8，289(1953)；Koh，W等，“黄曲霉和黑曲霉来源的角蛋白水解酶”，Bacillus.Aust.J.Biol.Sci.274 (1959)；Molyneaux，G.S，“羊毛经角蛋白水解杆菌的消化”，Aust.J.Biol.Sci.274(1959)；)；Noval，J和Nickerson，W，“天然角蛋白经链霉菌的分解”，J.Bacteriol.77，251(1959)；Kapica，L和Blank，F，“角蛋白作为唯一氮源的近平滑假丝酵母的生长”，Dermatologica 117，433(1958)；Kapica，L和Blank，F，“角蛋白作为唯一氮源的白色酵母的生长”，Dermatologica 115，81(1957)。
用于实现本发明的角蛋白酶可通过如下方式获得：在允许编码的角蛋白酶表达的条件下，培育细胞，过滤培养基以去除细胞及通过超滤法收集和浓缩所留上清而获得角蛋白酶。
虽然此处以地衣芽孢杆菌菌株作为例证，可以想到的是其他含有编码角蛋白酶核酸序列的真核和原核微生物对于生产本发明的动物饲料添加剂也是有用的。含有编码角蛋白酶核酸序列的真核和原核微生物可包括天然产生该酶的菌株与经遗传修饰表达角蛋白酶的菌株。
一般而言，蛋白重组产物的生产需要编码所述蛋白的核酸序列以适合蛋白在宿主细胞中表达的形式插入重组表达载体中。适合表达的形式指重组表达载体含有一个或多个以允许核酸转录为mRNA且mRNA翻译为蛋白的方式可操作地连接到编码角蛋白酶蛋白的核酸的调节序列。调节序列可包括启动子、增强子和其他表达控制元件(如，多腺苷酸化信号)。该调节序列为本领域技术人员所知，且在Goeddel D.D，ed.基因表达技术，圣地亚哥学校出版社，加拿大(1991)中描述。应当理解表达载体的构建将依赖于一些因素如所要转染的宿主细胞的选择和/或所需的表达水平。核酸序列或含有编码角蛋白酶蛋白核酸序列的表达载体通过转化细胞的标准技术导入宿主细胞，其可能是真核或原核来源的。转化宿主细胞的合适方法可在Sambrook等(分子克隆：实验手册，第3版，冷泉港实验室出版社(2000))以及其他实验室手册中找到。用编码角蛋白酶蛋白核酸序列转化的宿主细胞的数目将至少部分依赖于所用重组表达载体和转化技术的类型。核酸可导入宿主细胞进行角蛋白酶蛋白的瞬时表达，或更常见地，进行角蛋白酶蛋白的长期表达，其中核酸序列稳定整合到宿主细胞基因组中或在宿主细胞中以稳定附加体存在。一旦表达，角蛋白酶蛋白可作为分泌肽从培养基中回收，当直接表达没有分泌信号时，也可从宿主细胞裂解物中回收。
真核微生物如酵母培养物可用携带编码角蛋白酶的核酸序列的载体转化。参见，如，美国专利No.4,745,057。虽然许多其他菌株通常是可用的，酿酒酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。酵母载体含有2μ酵母质粒复制起点或自主复制序列(ARS)、启动子、如美国专利No.5,712,147提供的编码角蛋白酶的DNA、聚腺苷酸化序列以及转录终止子和所选择的基因。示例性的质粒为YRp7(Stinchcomb等，(1979)Nature 282：39；Kingsman等，(1979)Gene 7：141；Tschemper等，(1980)Gene 10：157)。酵母载体中合适的启动序列包括金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，(1980)JBiol.Chem.255：2073)或其他糖分解酶(Hess等，(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7：149；Holland等，(1978)Biochemistry 17：4900)的启动子。用于酵母表达的合适载体和启动子在EPO公开专利No.73,657中进一步描述。更进一步，真菌菌株如木霉属(如，T.Longibrachiatum、里氏木霉或绿色木霉)在表达分泌酶中尤其有用。
用于生产角蛋白酶的原核宿主细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性菌，例如，大肠杆菌(E.coli)或芽孢杆菌属。典型的宿主细胞有E.coliW3110(ATCC 27，325)、E.coli B，E.coli X1776(ATCC 31，537)、E.coli 294(ATCC 31，446)。合适的真核和微生物载体的大量变体也是可利用的。E.coli一般用pBR 322转化。重组微生物表达载体中最常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和半乳糖启动子系统(Chang等，(1978)Nature 275：615；Goeddel等(1979)Nature 281：544)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，(1980)Nucleic AcidsRes.8：4057；EPO公开专利No.36,776)和tac启动子(De Boer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21)。启动子和SD序列(用于原核宿主表达)可操作地连接在编码角蛋白酶的DNA上，即，它们定位于能启动角蛋白酶信使RNA从DNA的转录。芽胞杆菌属优选用于角蛋白酶的产生。用于芽孢杆菌属的重组表达载体是本领域技术人员熟知的。芽孢杆菌菌株可以是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。在一优选的实 施方案中，利用地衣芽胞杆菌.在某些实施方案中，利用地衣芽胞杆菌菌株T399D或PWD-1。
如此处提供的，角蛋白酶可通过在上述条件下培养宿主细胞而生产，其允许编码的角蛋白酶的表达和收集表达的角蛋白酶。宿主细胞在细胞生长的条件下培养，然后在引起编码的角蛋白酶表达的条件下培养，或细胞同时生长和表达编码的角蛋白酶。所述条件对于本领域技术人员是熟知的且可随着宿主细胞和期望的酶表达水平的量而改变。
在某些实施方案中，培养转化宿主细胞的培养基可以是任何适于角蛋白酶生产的培养基。角蛋白酶通过常规技术从培养基中回收，包括细胞通过离心或过滤从培养基中的分离，和上清或滤液中蛋白通过超滤法或蒸发作用的浓缩，随后通过冷冻干燥或喷雾干燥冻干。
备选地，培养物上清可在未经浓缩的分离后喷雾干燥或冷冻干燥。
角蛋白酶至少应以达到预期效果的量呈现，但角蛋白酶量的上限可基于达到的预期效果来确定.在某些实施方案中，动物饲料包括约0.01％至约20％重量的地衣芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶。另外，用于实现本发明的角蛋白酶可以是粗制形式或纯化形式。选择性地，细胞可在液体生长培养基中裂解(以化学方法或物理方法)以生产粗制的，无细胞提取物。制备该提取物的其他方法对于本领域技术人员是显而易见的。粗制角蛋白酶可以任何合适的形式加入到饲料中，如以含水形式或冻干形式。在某些实施方案中，粗制角蛋白酶为冻干形式。
纯化的(或基本纯化的)角蛋白酶可通过按照已知技术将上述粗制角蛋白酶分离为其单一组分而获得。通常参见W.Jakoby，Ed，酶纯化和相关技术，酶学方法，第22卷(1971)和第104卷，pt.C(1984)，学院出版社，纽约。许多合适的分离方法，如柱层析，都是本领域技术人员所知的。单一组分的蛋白可由其降解角质材料的能力而得到筛选，且最能降解角质材料的组分则包含角蛋白酶。如粗制角蛋白酶一样，纯化的角蛋白酶可以任何形式应用，包括含水形式和冻干形式。
本发明的实施方案进一步涉及在肉型家禽中促进动物饲料利用率的方法，包括喂养肉型家禽动物饲料家禽食料，其中饲料进一步包括有效量的角蛋白酶，其能促进提供给肉型家禽的动物饲料的饲料利用 率。动物饲料可包括上述动物饲料和，在特定实施方案中，可以是谷物-大豆粉。角蛋白酶可包括上述角蛋白酶，其包括，但不限于，地衣芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶。如上所述，角蛋白酶可以是粗制提取物或纯化形式的酶。
促进饲料利用率指相对于在没有实施该方法和/或给予本发明组合物时所呈现的饲料转化率(FCR)的降低。FCR是饲料消耗总量相对于动物体重增加的比率.在本发明的一个实施方案中，改进的饲料利用率可通过在不伴随肠能量消耗时提高胃肠养分吸收而实现。在本发明另外的实施方案中，改进的饲料利用率可通过提高动物饲料的可消化性而实现。在本发明另外的实施方案中，改进的饲料利用率可通过降低动物饲料粘度而实现。在特定的实施方案中，本发明涉及在肉型家禽中提高动物饲料可消化性的方法，包括喂养肉型家禽动物饲料家禽食料，其中饲料进一步包括有效量的地衣芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶，其能提高肉型家禽中动物饲料的可消化性。动物饲料可包括上述的动物饲料和，在特定的实施方案中，可以是谷物-大豆粉。角蛋白酶可包括上述角蛋白酶，其包括，但不限于，地衣芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶。如上所述，角蛋白酶可以是粗制提取物或纯化形式的酶。提高动物饲料的可消化性指在不提高饲料摄取和养分摄入时提高动物肠中养分吸收的有效性。在本发明某些实施方案中，动物肠中物质的粘度或助消化剂的粘度降低。在另外的实施方案中，让养分不可利用的养分的包埋被减少。
在其他实施方案中，本发明涉及在肉型家禽中降低死亡率的方法，包括喂养肉型家禽动物饲料家禽食料，其中饲料进一步包括有效量的角蛋白酶，其能降低肉型家禽的死亡率，例如，未成熟禽类，更具体地，肉鸡。动物饲料可包括上述动物饲料和，在特定实施方案中，可以是谷物-大豆粉。角蛋白酶可包括上述角蛋白酶，其包括，但不限于，地衣芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶。如上所述，角蛋白酶可以是粗制提取物或纯化形式的酶。降低死亡率指在动物中出生和孵育后相对于没有实施该方法和/或给予本发明组合物时所呈现的存活率增加或死亡率减少。死亡率可由任何因素引起，尤其是，压力、发育不良、“饥饿(starveouts)”和疾病。在某些实施方案中，本发明在未成熟禽类中降低死亡率。在其他的实施方案中，禽类为约1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、31、32、33、34或35天大小，优选约1至21天大小，更优选约1至5天大小。
在某些实施方案中，本发明涉及动物饲料，包括蛋白、碳水化合物和角蛋白酶作为主要组分。角蛋白酶为添加到动物饲料的主要成分。动物饲料可包括上述动物饲料和，在特定的实施方案中，可以是谷物-大豆粉。角蛋白酶可包括上述角蛋白酶，其包括，但不限于，地衣芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶。如上所述，角蛋白酶可以是粗提取物或纯化形式的酶。
由本发明提供的动物饲料添加剂可与动物饲料直接混合，如包含大麦的饲料，以制备终饲料。可选择性地，动物饲料添加剂可与一种或多种其他的动物饲料添加剂如维生素动物饲料添加剂、矿物质动物饲料添加剂和氨基酸动物饲料添加剂混合。所得到的包含多种不同类型成分的动物饲料添加剂可随后以合适的量与动物饲料混合。
本发明的动物饲料包括至少足够达到预期效果量的角蛋白酶，其中角蛋白酶量的上限可基于达到的预期效果来确定。预期效果包括，但不限于，增强动物生长特性，如体重增加、促进饲料利用率、提高饲料可消化性和降低死亡率。加入到动物饲料的动物饲料添加剂可包含直至100％重量的角蛋白酶。包含添加剂的动物饲料包括从约5％至约25％重量的角蛋白酶。在某些实施方案中，角蛋白酶为地衣芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶。
任何动物都是本发明的合适受试者，包括牛、羊、猪、猫、狗、貂和禽类，然而本发明优选使用单胃动物。合适的受试者可以是任何年龄范围的包括新生期动物、发育期动物和成熟动物。在某些实施方案中，合适的受试者可以是禽类，优选鸡，以及更优选肉鸡。在其他的实施方案中，合适的受试者为鸡。在仍是其他的实施方案中，合适的受试者可以是来成熟的、正发育的或成熟的禽类。在其他的实施方案中，合适的受试者可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65天大小的鸡，或该数值任何 范围内的鸡．因此，本发明提供了许多种不同的饲料，包括宠物饲料、家禽饲料和猪饲料。
本发明的动物饲料添加剂还能通过减少其能量，和/或蛋白，和/或氨基酸含量而同时维持对于动物可利用的能量、蛋白和氨基酸相同营养水平来改变传统动物饲料．因此，相对于传统饲料，一般包含在动物饲料中的昂贵的能量和蛋白添加剂可得到减少。
下列实施例用于例证本发明，而不应解释为对其的限制。
实施例1
从重组地衣芽胞杆菌PWD-1菌株中生产角蛋白酶
使用野生型地衣芽胞杆菌菌株PWD-1，设计发酵规模扩大方法用于角蛋白酶的生产。
用LB培养基的烧瓶培养．烧瓶培养在Luria-Bortani(LB)培养基中进行，其按照操作说明书制备，含有：1.0L蒸馏水，15g 琼脂，10gNaCl，10g 胰蛋白胨，和5g酵母提取物．地衣芽胞杆菌菌株PWD-1从甘油菌种挑出在LB平板上划线且在50℃生长8-12小时。随后，地衣芽胞杆菌茵株PWD-1单克隆从LB平板转入烧瓶，其含有500mlLB培养基，且在50℃生长6小时．
菌种培养．地衣芽胞杆菌菌株PWD-1的茵种培养在培养基中进行，其含有：0.7g/L KH2PO4，1.4g/L K2HPO4，0.1g/L MgSO4·7H2O，10g/L脱脂大豆粉，和0.1g/L除泡剂。菌种培养的起始pH通过加入1M HCl或NaOH调节至7.0。
500ml烧瓶培养物转入约10L至20L的第一阶段菌种发酵罐，其含有菌种培养基，且在其中50℃生长8-12小时以达到2.5％至5％接种物的容量。第一阶段菌种培养物随后转入100L、250L或800L的第二阶段发酵罐中，且在其中50℃生长8小时，随后调至37℃。
对于菌种培养，细胞密度在培养过程约8或10小时的时候达到至少3×108CFU/mL。
生产培养基.用于地衣芽胞杆菌菌株PWD-1的生产培养基含有0.7g/L KH2PO4，1.4g/L K2HPO4，0.1g/L MgSO4·7H2O，10g/L脱脂大豆粉，和0.1g/L除泡剂．生产培养的起始pH通过加入1M HCl或NaOH调节至7.0。
第二阶段菌种培养物转入生产发酵罐，其含有用于最终阶段培养的生产培养基。最终阶段的培养在50℃进行8小时，在收获前达到约24至30小时的总培养时间。
在上述培养步骤中，培养基的起始pH调节至7.0，但在培养过程中不提供pH控制。对于地衣芽胞杆菌菌株PWD-1最佳的溶解氧水平为约20％。接种物体积为约2.5％至5％，且接种物种龄为约8-12小时。
对于生产培养，最高细胞密度在培养过程约20或24小时的时候达到1.2×109CFU/mL。最高酶活性，通过偶氮酪蛋白测定法确定，在培养过程约24至30小时的时候达到35-40A450/mL。生产培养基的pH值从7.0变为8.3，但酶活性和产率维持高水平，其表明pH控制不是必要的。
回收和下游处理。在生产培养基中的酶活性在收获前检验。培养上清通过离心从细胞团块分离，随后通过超滤法或蒸发浓缩。浓缩的液态酶随后喷雾干燥。
可选择地，培养上清在从细胞团块分离后直接喷雾干燥，不经浓缩。
酶产量和酶活性。对于100L生产培养物，收获前通过偶氮酪蛋白确定的酶活性为3,000至3,500U/mL，细胞数目为1.3×109CFU/mL。100L生产培养物的总干重为9.12g/L，包括2.15g/L不溶性干重和6.88g/L可溶性干重。
粗制酶产量约1.75-2.0g/L。粗制酶由通过用5kDa分子量截留的膜过滤浓缩发酵上清液而制备，随后冻干。粗制干酶的酶活性为约1,000,000至约1,400,000U/g，正如通过偶氮酪蛋白测定法所确定的。粗制干酶的总蛋白含量为约30-36％，其中约14-20％由纯化的角蛋白酶组成。
实施例2
从重组地衣芽胞杆菌T399D中生产角蛋白酶
使用重组地衣芽胞杆菌T399D菌株(下文中为“地衣芽胞杆菌菌株T1”)，设计发酵规模扩大方法用于角蛋白酶的生产。
用LB培养基的烧瓶培养。烧瓶培养在LB培养基中进行，培养基按照操作说明书制备，含有：1.0L蒸馏水，15g 琼脂，10gNaCl， 10g 胰蛋白胨，和5g酵母提取物。地衣芽胞杆菌菌株T1从甘油菌种挑出在LB平板上划线且在37℃生长18小时。随后，地衣芽胞杆菌菌株T1单克隆从LB平板转入烧瓶，其含有500ml LB培养基，且在37℃生长6小时。细胞生长通过测量在660nm处(Beckmann DU系列660分光光度计，Fullerton，CA)的光密度而监控。生长6小时后，测定的OD660超过1.0。
菌种培养.地衣芽胞杆菌菌株T1的菌种培养在培养基中进行，培养基含有：0.7g/L KH2PO4，1.4g/L K2HPO4，0.1g/L MgSO4·7H2O，10g/L脱脂大豆粉，和0.1g/L除泡剂。菌种培养的起始pH通过加入1M HCl或NaOH调节至7.0。
500ml烧瓶培养物转入约10L至20L的第一阶段菌种发酵罐，其含有菌种培养基，且在其中37℃生长8小时以达到2.5％至5％接种物体积。第一阶段菌种培养物随后转入100L、250L或800L的第二阶段发酵罐中，且在其中37℃生长8小时。
生产培养基。用于地衣芽胞杆菌菌株T1的生产培养基含有0.7g/LKH2PO4，1.4g/L K2HPO4，0.1g/L MgSO4·7H2O，13g/L脱脂大豆粉，40g/L淀粉、13g/L羽毛粉，和0.1g/L除泡剂。生产培养的起始pH通过加入1M HCl或NaOH调节至7.0。
第二阶段菌种培养物转入生产发酵罐，其含有用于最终阶段培养的生产培养基。收获前，最终阶段的培养在37℃进行48小时。
在上述培养步骤中，培养基的起始pH调节至7.0，但在培养过程中不提供pH控制。对于地衣芽胞杆菌菌株T1的最佳溶解氧水平为约30％。接种物体积为约2.5％至5％，且接种物种龄为约12小时。
回收和下游处理。在生产培养基中的酶活性在收获前检验。培养上清通过离心从细胞团块分离，随后通过超滤法或蒸发浓缩。浓缩的液态酶随后喷雾干燥。
可选择地，培养上清在从细胞团块分离后直接喷雾干燥，不经浓缩。
酶产量和酶活性。对于100L生产培养物，收获前通过偶氮酪蛋白确定的酶活性为30,000至35,000U/mL，细胞数目为6×109CFU/mL。100L生产培养物的总干重为40g/L，包括15g/L不溶性干重和25g/L可溶性干重。
从直接干燥的培养物上清的粗制酶产量为20g/L，通过用10kDa分子量截留的膜过滤而得到培养浓缩物获得的粗制酶产量为16g/L。粗制干酶的酶活性超过1,000,000U/g，正如通过偶氮酪蛋白测定法所确定的。
实施例3
家禽饲料用角蛋白酶添加的材料和方法
禽类和饲养。进行三个实验。每个实验中，192只数天大小的肉鸡称重且随机分在24个笼栏中，完全随机化地设计为两个替代设计组(Alternate Design batteries)(Wilveco，Billerica，MA)。禽类称重，给翅膀带上环且在5天大小(实验1和2)或1天大小(实验3)进行实验处理。
除了对照组每栏用8只重复4次外，每个处理都用8只重复5次。禽类被置于温控的、通风、有光照(24小时/天)的房间中。在实验期间，禽类通过饲料槽喂食器随急喂养而水由喷嘴喝水器供给。
PWD-1角蛋白酶。酶，PWD-1角蛋白酶使用标准方法(Wang和Shih(1998)R Indust.Microb.Biotech.22：608-616)用150-L发酵罐生产。简单的说，地衣芽胞杆菌PWD-1(Williams等，(1990)如前)在发酵罐中50℃生长48小时。无细胞培养基通过膜超滤法浓缩且通过冷冻干燥机干燥。一般来说，粗制酶的产量为2.0g/L。粗制角蛋 白酶具有300,000U/g的活性，正如通过偶氮角蛋白的水解作用测定的(Lin等，(1992)如前)。
饮食处理，所有食物使用最小成本的线性规划软件来明确表述且呈现在表1中。
表1
1仅在实验3中起始的5天无限制提供给禽类。
2在实验1和2中起始5天无限制提供给禽类。所有实验中，起始5天后对照禽类持续接受同样的食物，而其他禽类接受相应的处理。
3矿物质预混合物从Eastern Minerals，Inc.，Henderson，NC获得，且以下列提供(每kg食物)：ZnSO4中120mg Zn；MnSO4中120mg Mn；FeSO4C5H2O中80mg Fe；CuSO4中10mg Cu；CaIO4中2.5mg I；CoSO4 中1mg Co。
4维生素预混合物从Roche，Nutely，NJ获得，且以下列提供(每kg食物)：13,200IU维生素A；4000ICU维生素D；66IU维生素E；39.6Fg维生素B12；13.2mg维生素B2；110mg烟酸；22mg d-泛酸盐；0.4mmg维生素K；2.2mmg叶酸；4.0mg维生素B1；7.9mg维生素B6；0.253mg生物素；100mg乙氧喹。
5硒预混合物以Na2SeO3提供0.2mg Se/kg食物。
6计算分析。
整个实验中所有饲料以糊状物形式喂养。禽类在第1天接受基础食物，随后在第5天转至相应的实验食物。在实验1中，用于起始5天喂养的基础食物提供约93％国家研究理事会(NRC)推荐量的粗制蛋白，但提供100％的必须氨基酸、能量和钙及磷成分。在实验2和3中，用于起始5天喂养的基础食物提供约95％国家研究理事会(NRC)推荐量((1994)如上)的能量，和100％的钙和磷，但提供105％的粗制蛋白成分。随后，一栏肉鸡接受五种饮食处理中的一种，直到每个实验结束(实验1和3中为21天，实验2中为26天)。实验1和2中的五种饮食处理为：1)未添加的对照食物(C，21.39％粗制蛋白)；2)低蛋白食物(LP，18％粗制蛋白)；3)用0.05％(wt/wt)酶制备物添加的低蛋白食物(LP+0.05E)；4)用0.10％(wt/wt)酶制备物添加的低蛋白食物(LP+0.10E)；和5)用0.15％(wt/wt)酶制备物添加的低蛋白食物(LP+0.15E)。对照食物与在实验1中起始5天喂养给禽类的基础食物相同。处理1中的禽类在5天后持续接受同样的食物，而剩余的处理组在第5天转至实验食物。实验3中的饮食处理为：1)未添加的对照食物(C，21.39％粗制蛋白)；2)用0.10％(wt/wt)酶制备物添加的对照食物(C+0.10E)；3)低蛋白食物(LP，18％粗制蛋白)；4)用0.10％(wt/wt)酶制备物添加的低蛋白食物(LP+0.10E)；和5)与处理2相同但在第1天起喂给禽类而不是第5天。
在喂养前酶剂量以1g酶/10ml溶液的比率溶解于0.10N碳酸钠溶液中。其后，酶溶液以10ml酶制备物/kg食物的比率用喷雾瓶喷在饲料上面，且用小的盘混合器(Hobart制造公司，Troy，OH)混合。
消化剂(digeatae)粘度。在每个实验结尾，每栏除两只外所有禽类 用CO2气体安乐死。每栏剩余的两只禽类维持到下一天。下一天的早晨，喂食器从栏中移去以产生2小时未进食时期。2小时后，禽类再次允许随意进食。1小时后，禽类被移去，一次两只，随后用CO2气体安乐死。安乐死后立即进行尸检，肠内容物倒入1ml Eppendorf管中。每只禽获得两个样本.试管随即在12,000×g离心5分钟且随即置于冰中直至使用商用粘度计(Brookfield数字粘度计，Model DV-II2.0版本，Brookfield工程实验室，Inc.，Stoughton，MA)测出粘度。粘度记录在溶液中在避免任何细菌生长的条件下进行。
数据分析。体重和饲料消耗从第1天起以5天间隔记录直到每个实验结束。计算饲料转化率(饲料到体重增加)，其由死亡率和剔除的动物校正。每天记录死亡率。使用SAS软件(SAS Institute(1996)SAS/STAT使用指南：统计学.Release 6.11.SAS Institute，Inc.，Cary，NC)的普通线性模型程序的单行分析分别分析每个实验的体重、饲料消耗、饲料转化率和粘度记录。百分比数据在反正弦平方根百分数变换后进行ANOVA.均数使用最小显著差别分离。显著性指令基于P≤0.05。
实施例4
用角蛋白酶的家禽饲料的添加：实验1
终体重，累计饲料消耗，和饲料转化率呈现在表2中。
表2
处理 体重(g) 饲料消耗(g) 饲料转化率 对照(C)低蛋白(LP)LP+0.05ELP+0.10ELP+0.15E 709±16668±14691±14700±14677±14 901a±26835ab±23860ab±23847ab±23826b±23 1.56±0.051.57±0.041.56±0.041.51±0.041.54±0.04
a，b按照SAS软件(SAS研究所(1996)如前)的最小均方功能，带有不同上标的每列的均数差别显著(P＜0.05)。
1值代表每栏8只肉鸡的4至5栏的均数。值代表均数±均数的标准误。
2E＝酶。
酶处理通常以P＞0.05的概率值促进体重。低蛋白+0.10％酶处理具有比低蛋白处理(低蛋白+0.10％酶与低蛋白分别为700与668g，P＝0.08)高的体重。低蛋白+0.10％酶处理在酶处理中具有最高的体重，且与对照处理(低蛋白+0.10％酶与对照分别为700与709g)没有不同。
除了低蛋白+0.15％酶和对照处理之间(低蛋白+0.15％酶与对照分别为826与901g，P＜0.05)外，在处理之间饲料消耗没有显著差异。在酶处理组中饲料消耗没有显著差异。
整个所有实验中仅有一只死亡禽类。该死亡禽类的体重以及被剔除的禽类包含在饲料转化率的计算中，其在表2中呈现。饮食的酶添加剂对饲料转化率具有边际效应.在累积基础上，低蛋白+0.10％酶处理具有最低的饲料转化率(低蛋白+0.10％酶与低蛋白分别为1.51与1.57，P＞0.05)。
第一个实验的结果显示对酶处理响应的趋势。为进一步分析酶更长时间的正面效应，进行禽类养殖超过5天(至26天大小)的第二个实验。
实施例5
用角蛋白酶的家禽饲料的添加：实验2
该实验除了禽类长至超过5天(至26天大小)外，是实验1的重复。终体重，累计饲料消耗，和饲料转化率呈现在表3中。
表3
处理 体重(g) 饲料消耗(g) 饲料转化率 对照(C)低蛋白(LP)LP+0.05ELP+0.10ELP+0.15E 1089b±15964c±131019b±131025b±131032b±13 1717c±161734b±141796a±141764ab±141794a±14 1.83a±0.042.14c±0.042.08ba±0.042.02b±0.042.0bc±0.04
a，b，c按照SAS软件(SAS研究所(1996)如前)的最小均方函数，带有不同上标的每列的均数差异显著(P＜0.05)。
1值代表每栏8只肉鸡的4至5栏的均数。值代表均数±均数的标准误。
2E＝酶。
在26天时用所有三种水平的酶添加低蛋白食料在体重方面具有促进作用(P＜0.05)。低蛋白+0.10％酶处理和低蛋白+0.15％酶处理具有最高的体重促进作用(1,032和1,025相对964g，低蛋白+0.15％酶和低蛋白+0.10％酶相对低蛋白，分别地，P＜0.05)。然而，所有的酶处理相比对照处理具有较低的(P＜0.05)体重(对于低蛋白+0.15％酶、低蛋白+0.10％酶和低蛋白+0.05％酶与对照分别为1,032、1,025、1,016和1,089g)。
所有接受低蛋白食料的禽类比对照组消耗更多的饲料(P＜0.05)。酶处理组也比低蛋白食料组消耗更多的饲料(P＜0.05；表2)。在酶处理之间饲料消耗无显著差异。在0.05和0.15％水平的酶添加比低蛋白处理产生数字上更高的饲料转化率，而低蛋白+0.10％酶处理表现出比低蛋白处理比显著(P＜0.05)高的饲料转化率(2.02相对2.14，低蛋白+0.10％酶相对低蛋白，分别地)。在该实验中，用酶添加低蛋白食料未能促进鸡的生长特性至等同于对照食料的水平。然而，用0.10％酶(wt/wt)水平添加低蛋白食料确实(P＜0.05)促进鸡的生长特性，超过低蛋白食料的作用。
实验1和2中的禽类在接受处理食料前的起始5天供给对照食料。虽然对照食料提供足够的能量、钙和磷，以及必须氨基酸，它只提供NRC((1994)如前)粗蛋白推荐量的93％，其使得它对蛋白酶添加刚刚适合且敏感。
实施例6
用角蛋白酶的家禽饲料的添加：实验3
实验3中，禽类被供给高蛋白预开食料，其提供105％NRC((1994)如前)推荐量的粗蛋白以及除能量外(95％NRC推荐量；表1)稍微高于需求量的所有其他养分。进行实验3以确定是否酶甚至在鸡已经接受足够养分需求后仍能持续发挥其作用。
在该实验中，仅使用一个水平的酶(0.10％wt/wt)。然而，引入两种新的处理以测试在添加到刚刚够格的肉鸡开食料时，酶发挥其作用的能力。两种新的处理由用0.10％酶(wt/wt)添加到与实验1和2中使用的同样的对照食料(21.39％粗蛋白)且在5天(处理2)或1天(处理5)引入该处理过的饲料至鸡组成。此提供了在1天大小时酶的添加是否在生长特性中具有更进一步促进作用的信息。
终体重，累计饲料消耗，和饲料转化率呈现在表4中。
表4
处理 体重(g) 饲料消耗(g) 饲料转化率 对照(C)C+0.10E低蛋白(LP)LP+0.10％EC+0.10％E3 695b±14767a±13651c±13679bc±13764a±13 974b±181046c±161043a±16978b±161022ab±16 1.49ab±0.031.45c±0.031.71c±0.031.53b±0.031.42a±0.03
a，b，c按照SAS软件(SAS研究所(1996)如前)的最小均方函数，带有不同上标的每列的均数差异显著(P＜0.05)。
1值代表每栏8只肉鸡的4至5栏的均数。值代表均数±均数的标准误。
2E＝酶。
3该处理中酶在1天大小加入。所有其他的在5天大小加入。
虽然表2、表3和表4中数据仅显示了不同实验中禽类数目的终体重，禽类在每个实验中每5天就称重。观察该实验的5天间隔数值，很清楚的是实验3中用酶添加低蛋白食料在体重增加上显示出与实验1和2类似的效果。用酶添加低蛋白食料增加21天大小禽类的体重，但效果在P＜0.05时检测不到(679相对651g，低蛋白+0.10％酶相对低蛋白，分别地，P＞0.05)。然而，用酶添加对照食料(对照+0.10％酶制备物，处理2和5)显示出比对照处理更高的体重(767和764相对695g，处理2和5相对对照，分别地，P＜0.05)。意想不到的是，用酶进行对照饲料的添加比在用酶添加低蛋白食料时在体重上显示出显著更高的促进作用，无论酶是在1天大小或5天大小进行添加(表 4)。这可能归因于对照食料相对低蛋白食料具有更高的蛋白和/或氨基酸含量。角蛋白酶是广谱性蛋白酶，其作用于不同来源的蛋白且将其降解为更小的多肽组分。这些多肽变得更易被肠道腔中的消化酶降解。食料(此处为对照食料)更高的粗蛋白和/或氨基酸含量意味着更高的底物含量为酶所作用以释放更多的蛋白组分，且使其更易被雏鸡利用，随后将反映在更高的体重增加上。
实施例7
用角蛋白酶的家禽饲料的添加：消化剂粘度
所有3个实验22天大小(实验1和2)和27天大小(实验3)肉鸡的空肠内含物的粘度读数呈现在表5中。
表5
处理 实验1 实验2 实验3 对照(C)C+0.10EC+0.10E3 低蛋白(LP)LP+0.05ELP+0.10ELP+0.15E 3.65b±0.42--------3.59b±0.382.98ab±0.382.88ab±0.382.27a±0.38 2.31b±0.15--------2.36ab±0.142.78a±0.142.21bc±0.141.98c±0.14 2.55ab±0.172.18b±0.151.99b±0.152.97a±0.15----2.20b±0.15----
a，b，c按照SAS软件(SAS研究所(1996)如前)的最小均方函数，带有不同上标的每列的均数差异显著(P＜0.05)。
1值代表每栏8只肉鸡的4至5栏的均数。值代表均数±均数的标准误。
2E＝酶。
3该处理中酶在1天大小加入。所有其他的在5天大小加入。
所有实验中用角蛋白酶添加低蛋白和对照食料降低了空肠内含物的粘度。该降低与酶添加水平直接相对应。实验1和2中用0.15％酶(低蛋白+0.15％酶)添加低蛋白食料降低了空肠内容物的粘度(实验1和2中，2.27和1.98mPas相对3.59和2.36mPas，低蛋白+0.15 ％酶相对低蛋白，分别地，P＜0.05)。当与对照处理比较时，低蛋白+0.15％酶处理也具有较低的空肠内容物粘度(实验1和2中，2.27和1.98mPas相对3.65和2.31mPas，低蛋白+0.15％酶相对对照，分别地，P＜0.05)。
当在5天大小用角蛋白酶添加对照食料时，空肠内容物粘度也被降低(2.18mPas相对2.55mPas，对照+0.10％酶[实验3，处理2]相对对照，分别地，P＞0.05)。然而，降低仅在1天大小起始用酶添加食料时才是显著的(1.99mPas相对2.55mPas，对照+0.10％酶[实验3，处理5]相对对照，分别地，P＜0.05)。
实施例8
利用改变酶活的喂养试验
按照此处描述的方法生产的干粗制酶提取物主要包括角蛋白酶，但也包含其他类型的化合物，包括其他酶、碳水化合物、非酶的肽、核苷酸片断，等等，其分子量超过5kDa且因而在超滤时滞留。
进行另外的实验以研究肉鸡生长特性和加入到它们食料的粗制酶提取物的角蛋白酶活性之间的关系。
在这些研究中使用从地衣芽胞杆菌菌株P1、P2和T399的发酵产物中获得的粗制酶提取物，结果提供在表1中。
表1
1从6至21天酶添加喂养。
2从6至2 7天酶添加喂养.
3＞90％酶活受抑制。
4＞98％酶活受抑制。
5从1至21天酶添加喂养。
前面的实施例是本发明的说明，而不是解释为对它的限制。本发明通过下述的权利要求，以及包括在本发明内的权利要求的等价形式进行描述。