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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610108416.4 (22)申请日 2016.02.29 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 广西壮族自治区药用植物园 地址 530023 广西壮族自治区南宁市长岗路 189 号 (72)发明人 李翠 张占江 缪剑华 韦坤华 韦莹 李林轩 王一诺 肖冬 王晓峰 (74)专利代理机构 广西南宁明智专利商标代理 有限责任公司 45106 代理人 黎明天 (54) 发明名称 一种靖西细筒苣苔组培叶片两步成苗方法 (57) 摘要 一种靖西细筒苣苔叶片组培两步成苗方法 ： 取靖西细筒苣苔幼嫩叶片作为外植体进行灭菌 处理，。
2、 然后将其切分成含主脉 0.5 cm1 cm 大 小后接种到诱导及分化培养基上， 1 1.5 个月后 选择幼嫩叶片上分化出的具有 2 片以上叶子、 高 12.5cm 的无菌芽苗转接到壮苗生根培养基上 ； 当无菌苗每株生根 4 条以上、 根长达 2.54cm 时， 炼苗 34 天， 将组培苗从培养瓶中取出， 将其移栽 至灭菌的栽培基质中。采用本发明方法得到的种 苗健壮、 成活率高， 可在短期内提供大量靖西细筒 苣苔的优质种苗， 并减少了配制培养基和转瓶的 步骤， 节约了大量人力物力， 因此简单易行、 生产 成本降低， 有效解决了靖西细筒苣苔规模化育苗 及种质资源保存问题。 (51)Int.Cl.。
3、 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 CN 105519447 A 2016.04.27 CN 105519447 A 1.一种靖西细筒苣苔叶片组培两步成苗方法， 其特征在于： （1） 叶片诱导分化不定芽培养： 取靖西细筒苣苔幼嫩叶片， 在75%乙醇中表面消毒30 45s， 无菌水23次， 投入0.1% Hcl2 5min, 无菌水23次， 0.1% Hcl2 3min， 无菌水23次冲洗 干后切分为0.5 cm1cm大小接种在MS+ 1.01.5mg/L6-BA+0.51.0mg/LNAA+0.10.2mg/L KT诱导及分化培养基上， 在。
4、温度为2226 C， 光照强度18002600lux， 光照时间为810小时/ 天的条件下， 1015天叶片分化出不定芽； （2） 不定芽壮苗生根培养： 选择靖西细筒苣苔叶片分化11.5个月高23cm不定芽接种 到MS+0.20.4mg/L6-BA+1.01.5mg/LNAA+0.5mg/L AC壮苗生根培养基， 在温度为2226 C， 光照强度20002800lux， 光照时间为810小时/天的条件下进行培养， 1 2个月不定芽长至 高46cm的无菌苗。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于： （1） 叶片诱导分化不定芽培养： 取靖西细筒苣苔幼嫩叶片， 在75%乙醇中表面消毒30 45s。
5、， 无菌水23次， 投入0.1% Hcl2 5min, 无菌水23次， 0.1% Hcl2 3min， 无菌水23次冲洗 干后切分为0.5 cm1 cm大小接种在MS+ 1.52.0mg/L6-BA+0.51.0mg/LNAA+0.20.4mg/ L KT诱导及分化培养基上， 在温度为2226 C， 光照强度18002600lux， 光照时间为810小 时/天的条件下， 1015天叶片分化出不定芽， （2） 不定芽壮苗生根培养： 选择靖西细筒苣苔叶片分化1 1.5个月高23cm不定芽接种 到MS+0.20.4mg/L6-BA+1.01.5mg/LNAA+0.5mg/L AC壮苗生根培养基， 在。
6、温度为2226 C， 光照强度20002800lux， 光照时间为810小时/天的条件下进行培养， 1 2个月不定芽长至 高46cm的无菌苗。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105519447 A 2 一种靖西细筒苣苔组培叶片两步成苗方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体地， 涉及靖西细筒苣苔组培叶片两步成苗方法。 背景技术 0002 靖西细筒苣苔为苦苣苔科细筒苣苔属植物， 是2011年发现的新种， 靖西细筒苣苔 为多年生草本， 根状茎圆柱形， 叶片肾形或圆形， 花序梗、 花序和花期外被线状短柔毛和紫 色腺体， 花期5-6月， 果期6月。 中国特有珍稀植物， 特产。
7、广西靖西， 生于石灰岩山地岩石上， 海拔约为200-250m。 0003 靖西细筒苣苔分布区域极其狭窄， 目前仅在广西靖西地区石灰岩山陡崖上发现少 量植株， 由于生长环境恶劣缺少水肥， 加之其种子细小， 萌发需要的温度范围、 湿度范围和 土壤酸碱度范围比较小， 自然界难以进行有性繁殖， 急需建立有效的繁育和保护体系， 本发 明旨在通过组织培养技术叶片两步成苗方法对靖西细筒苣苔种质资源进行有效的繁育和 保护， 是目前对靖西细筒苣苔育苗最便捷、 稳定的手段， 可以节约大量的人力、 物力和场地， 便于种质交换和转移， 避免有害病虫的人为传播。 发明内容 0004 本发明目的在于提供一种靖西细筒苣苔组。
8、培叶片两步成苗方法， 能够短时间内提 供大量优质适合栽培的靖西细筒苣苔种苗。 0005 为了实现本发明的上述目的， 本发明提供了如下技术方案： 靖西细筒苣苔组培叶片两步成苗方法， 其特征在于： （1） 叶片诱导分化不定芽培养： 取靖西细筒苣苔幼嫩叶片， 在75%乙醇中表面消毒30 45s， 无菌水23次， 投入0.1% Hcl2 5min, 无菌水23次， 0.1% Hcl2 3min， 无菌水23次冲洗 干后切分为0.5 cm1 cm大小接种在诱导及分化培养基上， 在温度为2226 C， 光照强度 18002600lux， 光照时间为810小时/天的条件下， 1015天叶片分化出不定芽； （。
9、2） 不定芽壮苗生根培养： 选择靖西细筒苣苔叶片分化1 1.5个月高23cm不定芽接种 到壮苗生根培养基， 在温度为2226 C， 光照强度20002800lux， 光照时间为810小时/天的 条件下进行培养， 1 2个月不定芽长至高46cm的无菌苗。 0006 当无菌苗每株生根4条以上、 根长达2.54cm时， 打开瓶盖， 在室内炼苗34天后， 将 组培苗从培养瓶中取出， 洗去培养基， 将其移栽至灭菌的栽培基质中。 0007 采用本发明所述方法得到的种苗健壮、 成活率高， 可在短期内提供大量靖西细筒 苣苔的优质种苗， 并减少了配制培养基和转瓶的步骤， 节约了大量人力物力， 因此简单易 行、 。
10、生产成本降低， 有效解决了靖西细筒苣苔规模化育苗及种质资源保存问题。 具体实施方式 0008 下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。 0009 靖西细筒苣苔组培叶片两步成苗方法法， 包括以下步骤： 说 明 书 1/4 页 3 CN 105519447 A 3 （1） 叶片诱导分化不定芽培养： 取靖西细筒苣苔幼嫩叶片， 在75%乙醇中表面消毒30 45s， 无菌水23次， 投入0.1% Hcl2 5min, 无菌水23次， 0.1% Hcl2 3min， 无菌水23次冲洗 干后切分为0.5 cm1 cm大小接种在诱导及分化培养基上， 在温度为2226 C， 光照强度 18002600lux。
11、， 光照时间为810小时/天的条件下， 1015天叶片分化出不定芽， 观察发现， 6-BA和NAA浓度对不定芽数诱导有显著影响， 在6-BA浓度为1.5mg/L, NAA浓度为1.0 mg/L, KT浓度为0.2 mg/L时不定芽数最高， 达到11.6个。 说 明 书 2/4 页 4 CN 105519447 A 4 0010 上述诱导及分化培养基为： 以MS为基本培养基， 每升添加6-苄氨基嘌呤12.0 mg、 -萘乙酸0.3 mg、 激动素0.20.5 mg、 琼脂3.84.5 g和蔗糖2025 g， 值5.86.0， 培养 温度为242 C， 光照强度18002600lux， 光照时间为。
12、810小时/天。 0011 （2） 不定芽壮苗生根培养： 选择靖西细筒苣苔叶片分化1 1.5个月高23cm不定芽 接种到壮苗生根培养基， 在温度为2226 C， 光照强度20002800lux， 光照时间为810小时/ 说 明 书 3/4 页 5 CN 105519447 A 5 天的条件下进行培养， 1 2个月不定芽长至高46cm的无菌苗。 观察发现， 在添加0.5g/L活 性炭的MS培养基中6-BA和IAA协同作用对靖西细筒苣苔生根效果好， 当6-BA浓度升高为0.6 mg/L ， NAA浓度为1.0 mg/L时靖西细筒苣苔组培苗生根效果最好， 植株粗壮， 植株高度 5.3cm， 生根率达到100%， 平均根数达到6根。 0012 当无菌苗每株生根4条以上、 根长达2.54cm时， 打开瓶盖， 在室内炼苗34天后， 将 组培苗从培养瓶中取出， 洗去培养基， 将其移栽至灭菌的栽培基质中。 0013 备注： 6-BA （6-苄氨基嘌呤） , NAA （萘乙酸） , KT （激动素） , IAA(吲哚乙酸), AC (活性炭) 。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105519447 A 6 。