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一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510905824.8 (22)申请日 2015.12.09 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人广西壮族自治区药用植物园地址 530023 广西壮族自治区南宁市兴宁区长堽路 189 号 (72)发明人韦莹韦坤华肖冬缪剑华李翠李林轩 (74)专利代理机构广西南宁公平专利事务所有限责任公司 45104 代理人黄永校 (54) 发明名称一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法 (57) 摘要一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法，包括如下步骤： (1) 以欧亚瑞香优质种子为外植体进行消毒；。

2、(2) 将消毒后的外植体置于 MS 基本培养基中培养诱导出芽； (3) 将无菌芽置于 MS 基本培养基中，经继代增殖培养后长成丛生芽； (4) 将丛生芽剪切成单芽置于壮苗生根培养基中培养得到完整的带根苗。采用本发明能促进欧亚瑞香种苗的繁殖速度，种子原生苗不易发生退化，保证种苗质量。为进一步开展该物种的研究提供优质种源，具有广泛的应用前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页 CN 105532452 A 2016.05.04 CN 105532452 A 1.一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法。

3、，其特征在于：该方法包括以下步骤： (1)外植体的消毒：将25滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min10min，在超净工作台内用75v/v的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/vHgCl2消毒12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水； (2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度为23 2，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下培养。

4、2030d开始萌发，得到无菌芽，所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.52.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6- BA、 01.0mg/L的萘乙酸NAA， 0.051.5mg/L的赤霉素GA3， 30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8； (3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成12cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度为232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下培养15 20d便长出更多的芽丛，所述增殖培养基为MS基本培养基，添加0.12.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、 0.52.0mg/L的6-苄基腺。

5、嘌呤6-BA、 0.051.0mg/L的吲哚乙酸IBA， 30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8； (4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养1025d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入01.5mg/L的 6-苄基腺嘌呤6-BA、 0.31.5mg/L的萘乙酸NAA、 01.5g/L的活性炭， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。权利要求书 1/1 页 2 CN 1055324。

6、52 A 2 一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法技术领域 0001 本发明涉及一种植物种子诱导及快速繁殖的方法，特别是一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法。背景技术 0002 瑞香科植物分布于世界各地，产于欧洲、亚洲西部。有67属约1200种，其中瑞香属 (Daphne genus)有95种，我国有52种，全国均有分布。自20世纪70年代初，人们从瑞香属植物中分离出具有抗肿瘤活性的欧亚瑞香素(mezerein)和瑞香毒素(daphnotoxin)后，该属植物便成为一个研究热点。欧亚瑞香(Daphne mezereum L.)株型优美、四季常青，在冬天和早。

7、春开花且香味浓郁，深受园艺爱好者的青睐，被视为很珍贵的植物；欧洲用瑞香树皮制的膏药做辛辣剂、刺激剂、康复药；法国用果实做黑胡椒的代用品。欧亚瑞香种子繁殖或扦插繁殖存活率不高且生长缓慢，较难满足市场需求。发明内容 0003 本发明的目的是提供一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法，能够促进欧亚瑞香种苗的繁殖速度，种子原生苗不易发生退化，保证种苗质量，为进一步开展该物种的研究提供优质种源。 0004 本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法，包括以下步骤： 0005 (1)外植体的消毒：将25滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯。

8、中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min10min，在超净工作台内用75v/v的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/vHgCl2消毒 12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水； 0006 (2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度为232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下培养2030d开始萌发，得到无菌芽，所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.52.0。

9、mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、 01.0mg/L的萘乙酸NAA， 0.051.5mg/L的赤霉素GA3， 30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8； 0007 (3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成12cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度为232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下培养 1520d便长出更多的芽丛，所述增殖培养基为MS基本培养基，添加0.12.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、 0.52.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、 0.051.0mg/L的吲哚乙酸IBA， 30g/L蔗糖， 5g/。

10、L的琼脂，培养基的pH值为5.8； 0008 (4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下进行生说明书 1/4 页 3 CN 105532452 A 3 根培养，培养1025d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0 1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、 0.31.5mg/L的萘乙酸NAA、 01.5g/L的活性炭， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。 0009 本发明的突出优点在于： 0010 (1)采用生物技术方。

11、法实现了欧亚瑞香种子诱导和快速繁殖。该方法能促使种子较早萌发并提高了诱导率，缩短组培苗生长周期，降低组织培养成本，提高组培苗的质量。 0011 (2)采用本发明所述的方法培养20d能够诱导出芽，芽诱导率达最高达89.1，培养30d，增殖系数为4.9，生根率为84.8。具体实施方式 0012 下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。 0013 实施例1 0014 本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法一个实例，包括如下步骤： 0015 (1)外植体的消毒：将25滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗。

12、种子表面污垢，线状自来水冲洗5min10min，在超净工作台内用75v/v的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/vHgCl2消毒 12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。 0016 (2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度 232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养30d开始萌发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤 6-BA、 1.0mg/L的萘乙酸NAA。

13、， 0.05mg/L的赤霉素GA3， 30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为69.6。 0017 (3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成12cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养1520d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基，添加0.1mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、 1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、 0.05mg/L的吲哚乙酸IBA， 30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，。

14、增殖系数为3.2。 0018 (4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养25d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入1.0mg/L的萘乙酸NAA、 0.5g/L的活性炭， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为73.9。 0019 实施例2 0020 本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法另一个实例，包括如下步骤： 0021 (1)外植体的消毒：将25滴洗洁精滴入装50ml自来。

15、水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min10min，在超净工作台内用75v/v的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/vHgCl2消毒 12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。说明书 2/4 页 4 CN 105532452 A 4 0022 (2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度 232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养20d开始萌。

16、发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤 6-BA、 0.5mg/L的萘乙酸NAA， 0.2mg/L的赤霉素GA3， 30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为89.1。 0023 (3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成12cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养1520d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基，添加1.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、 1.0mg/L的6-苄。

17、基腺嘌呤6-BA、 0.5mg/L的吲哚乙酸IBA， 30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为4.8。 0024 (4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养16d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入1.5mg/L的6- 苄基腺嘌呤6-BA、 0.3mg/L的萘乙酸NAA、 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为69.6。 0025 实施例。

18、3 0026 本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法再一个实例，包括如下步骤： 0027 (1)外植体的消毒：将25滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min10min，在超净工作台内用75v/v的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/vHgCl2消毒 12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。 0028 (2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度 232，光照。

19、强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养25d开始萌发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤 6-BA、 0.3mg/L的萘乙酸NAA， 1.0mg/L的赤霉素GA3， 30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为82.6。 0029 (3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成12cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下培养15 20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为。

20、MS基本培养基，添加1.0mg/L的噻重氮苯基脲 TDZ、 2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、 0.1mg/L的吲哚乙酸IBA， 30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为4.5。 0030 (4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养18d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.8g/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、 1.5mg/L的萘乙酸NAA、 1.0g/L的活性炭5。

21、g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养 30d，生根率为80.4。 0031 实施例4 0032 本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法又一个实例，包括如下步骤：说明书 3/4 页 5 CN 105532452 A 5 0033 (1)外植体的消毒：将25滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min10min，在超净工作台内用75v/v的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/vHgCl2消毒 12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外。

22、植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。 0034 (2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度 232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养23d开始萌发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤 6-BA、 0.1mg/L的萘乙酸NAA， 1.5mg/L的赤霉素GA3， 30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为76.1。 0035 (3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成12cm长接种于M。

23、S增殖培养基中，在培养温度232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下培养15 20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基，添加2.5mg/L的噻重氮苯基脲 TDZ、 0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、 1.0mg/L的吲哚乙酸IBA， 30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为4.3。 0036 (4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度232，光照强度2030 mol/m2s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养10d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.3mg/L的6- 苄基腺嘌呤6-BA、 0.5mg/L的萘乙酸NAA、 1.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为84.8。说明书 4/4 页 6 CN 105532452 A 6 。

摘要
申请专利号：	CN201510905824.8	申请日：	20151209
公开号：	CN105532452A	公开日：	20160504
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	A01H4/00	主分类号：	A01H4/00
申请人：	广西壮族自治区药用植物园
发明人：	韦莹,韦坤华,肖冬,缪剑华,李翠,李林轩
地址：	530023 广西壮族自治区南宁市兴宁区长堽路189号
优先权：	CN201510905824A
专利代理机构：	广西南宁公平专利事务所有限责任公司	代理人：	黄永校
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内容摘要

一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法，包括如下步骤：(1)以欧亚瑞香优质种子为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中培养诱导出芽；(3)将无菌芽置于MS基本培养基中，经继代增殖培养后长成丛生芽；(4)将丛生芽剪切成单芽置于壮苗生根培养基中培养得到完整的带根苗。采用本发明能促进欧亚瑞香种苗的繁殖速度，种子原生苗不易发生退化，保证种苗质量。为进一步开展该物种的研究提供优质种源，具有广泛的应用前景。

权利要求书

1.一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)外植体的消毒：将2～5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min～10min，在超净工作台内用75v/v％的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl消毒12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水；(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度为23±2℃，光照强度20～30μmol/m·s，光照时间为12h/d的条件下培养20～30d开始萌发，得到无菌芽，所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0～1.0mg/L的萘乙酸NAA，0.05～1.5mg/L的赤霉素GA3，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；(3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1～2cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度为23±2℃，光照强度20～30μmol/m·s，光照时间为12h/d的条件下培养15～20d便长出更多的芽丛，所述增殖培养基为MS基本培养基，添加0.1～2.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05～1.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；(4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养10～25d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0～1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3～1.5mg/L的萘乙酸NAA、0～1.5g/L的活性炭，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物种子诱导及快速繁殖的方法，特别是一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法。

背景技术

瑞香科植物分布于世界各地，产于欧洲、亚洲西部。有67属约1200种，其中瑞香属 (Daphnegenus)有95种，我国有52种，全国均有分布。自20世纪70年代初，人们从瑞香属植物中分离出具有抗肿瘤活性的欧亚瑞香素(mezerein)和瑞香毒素(daphnotoxin)后，该属植物便成为一个研究热点。欧亚瑞香(DaphnemezereumL.)株型优美、四季常青，在冬天和早春开花且香味浓郁，深受园艺爱好者的青睐，被视为很珍贵的植物；欧洲用瑞香树皮制的膏药做辛辣剂、刺激剂、康复药；法国用果实做黑胡椒的代用品。欧亚瑞香种子繁殖或扦插繁殖存活率不高且生长缓慢，较难满足市场需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法，能够促进欧亚瑞香种苗的繁殖速度，种子原生苗不易发生退化，保证种苗质量，为进一步开展该物种的研究提供优质种源。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的消毒：将2～5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min～10min，在超净工作台内用75v/v％的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水；

(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度为23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养20～30d开始萌发，得到无菌芽，所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0～1.0mg/L的萘乙酸NAA，0.05～1.5mg/L的赤霉素GA3，30g/L蔗糖，5g/L 的琼脂，培养基的pH值为5.8；

(3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1～2cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度为23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养15～20d便长出更多的芽丛，所述增殖培养基为MS基本培养基，添加0.1～2.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05～1.0mg/L的吲哚乙酸IBA， 30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

(4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养10～25d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0～ 1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3～1.5mg/L的萘乙酸NAA、0～1.5g/L的活性炭，5g/L 的琼脂，培养基的pH值为5.8。

本发明的突出优点在于：

(1)采用生物技术方法实现了欧亚瑞香种子诱导和快速繁殖。该方法能促使种子较早萌发并提高了诱导率，缩短组培苗生长周期，降低组织培养成本，提高组培苗的质量。

(2)采用本发明所述的方法培养20d能够诱导出芽，芽诱导率达最高达89.1％，培养30d，增殖系数为4.9，生根率为84.8％。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

实施例1

本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法一个实例，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：将2～5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min～10min，在超净工作台内用75v/v％的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒12 min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。

(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度 23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养30d开始萌发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L的萘乙酸NAA，0.05mg/L的赤霉素GA3，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为69.6％。

(3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1～2cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养15～20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基，添加0.1mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L 的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为3.2。

(4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养25d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入1.0mg/L 的萘乙酸NAA、0.5g/L的活性炭，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为73.9％。

实施例2

本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法另一个实例，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：将2～5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min～10min，在超净工作台内用75v/v％的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒12 min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。

(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养20 d开始萌发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入1.0mg/L的6- 苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA，0.2mg/L的赤霉素GA3，30g/L蔗糖，5g/L 的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为89.1％。

(3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1～2cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养15～20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基，添加1.5mg/L 的噻重氮苯基脲TDZ、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L 蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为4.8。

(4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养16d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入1.5mg/L 的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3mg/L的萘乙酸NAA、5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为69.6％。

实施例3

本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法再一个实例，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：将2～5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min～10min，在超净工作台内用75v/v％的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。

(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养25 d开始萌发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入1.5mg/L的6- 苄基腺嘌呤6-BA、0.3mg/L的萘乙酸NAA，1.0mg/L的赤霉素GA3，30g/L蔗糖，5g/L 的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为82.6％。

(3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1～2cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养15～20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基，添加1.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为4.5。

(4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养18d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.8g/L的 6-苄基腺嘌呤6-BA、1.5mg/L的萘乙酸NAA、1.0g/L的活性炭5g/L的琼脂，培养基的pH 值为5.8，培养30d，生根率为80.4％。

实施例4

本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法又一个实例，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：将2～5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min～10min，在超净工作台内用75v/v％的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒12 min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。

(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养23 d开始萌发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入2.0mg/L的6- 苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA，1.5mg/L的赤霉素GA3，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为76.1％。

(3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1～2cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养15～20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基，添加2.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖， 5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为4.3。

(4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养10d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.3mg/L 的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、1.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为84.8％。