技术领域
本发明涉及三氧化二砷在制备治疗对砷化物敏感的胚胞细胞疾病的药 物中的应用。
背景技术
近年气喘病的基本病因发现仍是以慢性发炎(Chronic inflammation) 为主轴。由于基因遗传与外界环境的双重影响，导致过敏发炎反应的发生， 影响的发炎细胞包括：树突细胞、上皮细胞、T细胞、B细胞、肥胖细胞、 颗粒细胞及嗜伊红白血球都卷入这场“战争”，如何早期发现、早期预防 或早期治疗气喘病是业界努力的目标。
气喘的产生原因可能为各种刺激(诱因)引发T细胞的免疫反应控制失 常而产生的气管炎症(AI)，其诱发或加重气管高反应性并导致支气管收缩、 粘膜充血水肿及分泌亢进、微血液渗漏并逐渐有气管重塑，最终引起气管 狭窄、气流受限，临床症状发作。
全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种进行性 结缔组织病，其特征为体内产生多种自身抗体，能对自身许多标的组织成 分造成损害。该病属于多系统性自身免疫病，临床主要表现为：关节炎、 肾小球肾炎、癫痫样发作、贫血或血小板减少等，而且该病常有发作和缓 解相交替。过去认为SLE治疗困难，预后很差；近来由于医学科学的进展， 对SLE已有了较深的认识，在早期诊断和及时治疗情况下，使重要器官受 损减少，提升存活率，使SIE的预后大为改观。
近30多年由于免疫病理学的发展，证实SLE患者体液免疫和细胞免疫 均有不同程度异常改变。然而对于SLE的确切病因至今仍未完全阐明，但 可能与下列某些因素有关：遗传原素、性激素原素、病毒感染、药物。
疟疾(malaria)在我国古代称为瘴气，国外称malaria，为意大利文 mala(不良)与aria(空气)两字合成。该病是由雌性疟蚊叮咬人体时将其体 内寄生的疟原虫传入人体而引起。临床表现为间歇性、定时性、发作性寒 战、高热和大汗，以及贫血和脾肿大。间日疟和三日疟常有复发，恶性疟 发热不规则，1％-2.5％的患者表现为中枢神经系统功能失常，呈现凶险发作。
人类疟疾有4种，由4种不同疟原虫引起，即间日疟(vivax malaria， benign tertian)，病原为间日疟原虫(Plasmodium vivax)；三日疟(quartan malaria，malariae malaria)，病原为三日疟原虫(P.malariae)；卵形疟 (ovale malariae)，病原为卵形疟原虫(P.ovale)；恶性疟(falciparum malaria，malignant tertian)，病原为恶性疟原虫(P.falciparum)。
锥虫约有20多种，作为人类致病原的仅2种。锥虫病是锥虫寄生人体 引起的疾病，包括美洲锥虫病(American trypanosomiasis)和非洲锥虫病 (African trypanosomiasis)，前者又称恰加斯病(chagas disease)，后者 又称非洲睡眠病(African sleeping sickness)。
非洲锥虫病病原为布氏锥虫，其3个亚种对人均致病。布氏罗得西亚 锥虫(T.b.rhodesiense)引起罗得西亚锥虫病(东非睡眠病)；布氏甘比亚 锥虫(T.b.gambiense)引起冈比亚锥虫病(中西非睡眠病)；布氏布氏锥虫 (T.b.brucei)引起的病例，临床虽有报告，但较少，主要引起牛发病。
非洲锥虫病又称昏睡病(sleeping sickness)，是非洲人畜共患的严重 疾病之一。该病由一种属于布氏锥虫复合组(T.brucei Complex)带有鞭毛 的寄生原虫引起的疾病，采采蝇为传播媒介。疾病早期表现为不规则发热、 淋巴结炎等，后期为中枢神经系统受损表现，有严重头痛、反应迟钝、嗜 睡直至昏睡，终至死亡。
传统中药因为采撷于天地自然，许多天然药物用于人体时不免产生毒 性等副作用。中药炮制技术长时间以来一直是减低中药毒性副作用的主要 方法之一。砒霜为一种至毒药物代表，传统中药炮制技术虽可将其毒性减 至一定程度，但长久以来仍给人不良印象，并令人闻之色变，因此限制了 应用砒霜的发展。砒霜内所含的化学成分种类众多，然其主要成分为三氧 化二砷，目前已知的文献中，对于砒霜的应用，也以其主要成分三氧化二 砷为主。由于中草药逐日受到世界各国的重视，对于砒霜的了解及应用与 日俱增，因此也使得三氧化二砷的使用受到重视，举例而言，利用三氧化 二砷治疗如子宫颈癌、皮肤癌、食道癌等癌症，或皮肤疾病如俗称鸡眼。 然而，关于三氧化二砷的其它应用，仍有待医药研究者进一步开发与研究。
发明内容
本发明涉及以三氧化二砷在制备治疗对免疫癌症、免疫性疾病与寄生 虫感染的药物中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案详述如下：
本发明涉及提供以三氧化二砷在制备治疗对砷化物敏感的胚胞细胞疾 病的药物中的应用。
优选的是，药物以注射方式使用，即，所述药物为注射剂型。
优选的是，对砷化物敏感的胚胞细胞疾病选自如下：过敏性疾病、免 疫性疾病、纤维母细胞疾病、发炎疾病和寄生虫疾病。
更优选的是，免疫性疾病选自如下：结缔组织疾病、自体免疫甲状腺疾 病、神经肌肉自体免疫疾病、肠胃道自体免疫疾病、自体免疫肝炎、原发型 肝胆硬化症、原发型硬化性胆管炎、自体免疫心脏炎和动脉炎(arteritis)。
更具体地，免疫疾病选自如下：全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、 硬化症(sclerosis)、格雷氏病(Graves disease)、重症肌无力(Myasthenia Gravis)、多重硬化症、溃疡性结肠炎和克隆氏症(Crohn’s disease)。
优选的是，过敏性疾病选自如下：气喘、过敏性肺炎、扩散性肺间纤 维病变、过敏性鼻炎、嗜伊红关联性鼻炎(eosinophil-associated nasal inflammation)、春天结膜炎(vernal conjunctivitis)和荨麻疹。
优选的是，发炎疾病选自如下：肺炎、骨髓炎、麻疯病、梅毒、结核 病、肝炎、肿瘤形成和慢性阻塞性肺部疾病。
优选的是，纤维母细胞疾病选自如下：肝纤维化、肺纤维化、皮肤纤维 化、全身性纤维化、尘肺病、结核病、非典型肺炎(SARS)、成人呼吸困厄 综合症状、慢性阻塞性肺部疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)、疤痕(scarring)、瘢痕瘤(keloid)、银屑病(psoriasis)、侵袭囊 性纤维变性(cystic fibrosis)和神经纤维瘤病(neurofibromatosis)。
优选的是，寄生虫疾病为疟疾或锥虫病。
优选的是，对砷化物敏感的胚胞细胞选自如下：白血球、外围血液单 核球和纤维母细胞。
优选的是，药物包含约0.001μM至约20μM的三氧化二砷。
更优选的是，药物包含约0.1μM至约15μM的三氧化二砷。
最优选的是，药物包含约0.1μM至约10μM的三氧化二砷。
本发明所使用的术语“对砷化物敏感的胚胞细胞”意指白血球、外围 血液单核球及纤维母细胞。
本发明所使用的术语“哺乳动物”意指包含人类的哺乳动物。
附图说明
图1是以不同浓度的三氧化二砷处理人类成纤维母细胞所产生细胞周 期停滞的图表。
图2是以不同浓度的三氧化二砷处理人类成纤维母细胞表现细胞毒性 的图表。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步地详细说明：
实施例一：以三氧化二砷处理支气管气喘的动物试验
1.1材料
试验动物：选用常用的BALB/c雌鼠，6-8周大，喂食六周，每组15只。 自台湾大学动物中心购进SPF六周大的BALB/c雌鼠，每只小鼠分别饲养， 室温控制于22±2℃，光暗循环时间各为12小时(早上六点亮，下午六点 暗)，自由摄食饮水及AIN-76配方粉末饲料，每周记录摄食量及体重二次， 隔周以眼窝采血一次；小鼠八周大时则随机分组为四组，致敏步骤与接受 治疗的方法如后述。
药物：三氧化二砷注射液(Asadin，10mg/10ml/管(vial))，以PBS溶 液稀释。
试剂：不含钙镁离子的平衡盐水(balanced salt solution；HBSS)灌 洗液、台盼蓝(Trypan blue)、苏木青-伊红(hematoxylin-eosin)、碳酸覆 盖缓冲液(carbonate coating buffer)、含有0.05％土温20(Tween 20)的 1X PBS缓冲液、阻断液(blocking solution；含有1％BSA-0.05％Tween20 的1X PBS缓冲液)、[3H]TdR。
其它：卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、石蜡(paraffin)、嗜伊红粒细胞趋 化蛋白(eotaxin)ELISA套组(IBL，德国汉堡)、抗老鼠IgE抗体。
主要仪器：雾化器(DeVilbiss，Somerset，PA)、离心机、血球计数器、 显微镜、eotaxin ELISA读取机、培养盘读取机(microplate reader)、液 体闪烁计数器、测量呼吸道阻力的仪器(例如Plethysmography)。
1.2试验方法
1.2.1建立呼吸道发炎动物模式
选用常用的BALB/c雌鼠，6-8周大，老鼠致敏步骤先以卵清蛋白腹腔 注射至老鼠体内，分别于第0、14、21、和28天，以相同剂量的卵清蛋白 重复注射老鼠。将6到8只老鼠同时置于密闭容器中，以雾化器将OVA抗 原制作成可吸入粒子型态后，让老鼠在此密闭容器内吸入抗原超过20分钟。 雾化器会以0.3ml/min的速率送出0.5-5m的抗原颗粒分子。
1.2.2测定卵清蛋白专一性抗体的ELISA测量法
将0.5mg抗原溶于100ml碳酸覆盖缓冲液后，加入微量培养盘于4℃静 置过夜。第2天以含有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液清洗微量培养盘。 然后以阻断液阻断微量培养盘，再清洗3次。接着每个微孔加入100μl待 测样本-血清(以阻断液稀释)反应，反应后再清洗6次。加入100ml抗老鼠 IgE抗体进行反应再清洗6次。上述反应均在37℃进行45分钟，再移至室 温反应15分钟。最后，每个微孔再加入100μl 2，2′-连氮-双-3-乙基苯并 噻唑-6-磺酸(2，2′-Azino-bis-3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid， ABTS)受质(即，受酶切割的物质)溶液于室温呈色约30分钟，以每微孔 100μl的5％SDS终止反应，并以培养盘读取机读取吸光值。
1.2.3支气管肺泡冲洗液与巨噬细胞、淋巴球、嗜中性球与嗜伊红性 白血球的数目计算
最后一次吸入抗原24小时后，将所有的老鼠眼窝采血后处死。然后立 即进行支气管插管，以1ml不含钙镁离子的HBSS灌洗老鼠肺部四次，并收 集冲洗液。将所收集的肺泡冲洗液以400xg的转速在4℃下离心10分钟。 离心所得的细胞悬浮于1ml HBSS中，然后以血球计数剂计算细胞总数。接 着以细胞离心沉淀法(Cytocentrifuged preparations)将细胞固定在玻片 上，再以刘氏染色(Liu′s stain)计算各类细胞数目。各类细胞数目以300 颗细胞中巨噬细胞、淋巴球、嗜中性球与嗜伊红性白血球各自所占的数目 来计算，并且根据其标准型态来分类。
1.2.4测定支气管肺泡冲洗液中eotaxin的含量
支气管肺泡冲洗液(BAL)中eotaxin含量，以eotaxin ELISA套组测定， 操作步骤则依ELISA套组制造商所指示。
1.2.5小鼠的呼吸道阻力测试
以增加乙酰甲胆碱(methacholine，Mch.)浓度的方法(分别为 6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml)刺激小鼠，并且利用 plethysmography的方法来测定小鼠的呼吸道阻力(airway enhanced pause (PenH)values)，以了解小鼠的呼吸道收缩是否受到改善。
1.3试验分组
小鼠八周大时随机分成四组，每组15只，四组小鼠接受治疗的方法为： A组小鼠仅用PBS致敏与治疗；B组小鼠用卵清蛋白致敏，但仅用PBS治疗； C组小鼠用卵清蛋白致敏，用剂量为2.5mg/kg的三氧化二砷治疗；D组小 鼠用卵清蛋白致敏，用剂量为5.0mg/kg的三氧化二砷治疗(请参见表1.1)。
表1.1 致敏抗原 处理 A组 PBS PBS B组 OVA PBS C组 OVA ATO 2.5mg/kg D组 OVA ATO 5mg/kg
1.4试验步骤
选用8周大的BALB/c雌鼠，老鼠饲养方法及分组方式如前所述。老鼠 致敏的方法及途径如前所述，老鼠致敏后每周以眼窝采血法测定抗原专一 性抗体的效价。
1.5处理方法
先以卵清蛋白(ovalbumin，OVA)腹腔注射置老鼠体内，分别于第0、14、 21及28天，以相同剂量的卵清蛋白重复注射老鼠完成致敏步骤后，第38 天以PBS和剂量为2.5mg/kg与5.0mg/kg的三氧化二砷腹腔连续注射七日 治疗小鼠。再于第42、43及44天以吸入卵清蛋白抗原刺激小鼠。第45天 进行小鼠的呼吸道阻力测试。呼吸道阻力测试结果如表1.2所示。
表1.2小鼠的呼吸道阻力(气管反应)测试 呼吸道阻力测试 Mch(mg/ml) 6.25mg/ml 12.5mg/ml 25mg/ml 50mg/ml A组 2.20±0.28# 8.22±1.22 11.99±1.50 14.21±1.06 B组 2.50±0.40 8.00±0.93 14.52±1.42 19.15±3.35 C组 3.62±0.47 7.83±1.13 10.15±0.84* 9.83±1.17* D组 2.55±0.35 8.82±0.88 11.57±1.52 12.51±1.90
#：数值为平均±SD；*：与B组比较，p＜0.05。
由表1.2显示增加乙酰甲胆碱(methacholine，Mch.)浓度(6.25 mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml)刺激小鼠后，plethysmography 测定小鼠的呼吸道阻力，以气管过敏反应-PenH比值(AHR；airway hyper-reactivity-PenH(airway enhanced pause))表示。与未接受三氧化 二砷治疗的B组小鼠比较，剂量2.5mg/kg三氧化二砷治疗成功地阻断C 组小鼠的气管高免疫反应性而减低小鼠的呼吸道阻力。
最后一次吸入卵清蛋白抗原刺激48小时后，所有的老鼠眼窝采血后处 死。然后立即进行支气管插管，以1ml不含钙镁离子的HBSS灌洗老鼠肺部 四次，收集肺泡冲洗液。所收集的肺泡冲洗液进行组织病理学研究、计算 各类细胞的数目(巨噬细胞、淋巴球、嗜中性球与嗜伊红性白血球)并测定 支气管肺泡冲洗液中eotaxin的含量，结果如表1.3及表1.4所示。
表1.3支气管肺泡冲洗液巨噬细胞、淋巴球、嗜中性球与嗜伊红性白 血球数目计算 BALF小鼠白血球计数 (×1000细胞数/ml) 巨噬细胞 嗜伊红性白血球 嗜中性球 淋巴球* A组 135.6±54.5# 3.2±2.1 8.4±4.9 12.9±8.2 B组 243.8±69.3 105.3±60.7 77.1±32.8 37.8±16.3 C组 621.0±199.6 28.6±13.0 200.7±75.2 37.0±9.4 D组 499.1±131.6 33.2±12.5 244.0±72.6 28.7±13.6
*：嗜碱性白血球数目稀少，在此并未表示。
表1.4显示在小鼠支气管肺泡冲洗液的eotaxin含量的平均浓度与标 准差。与未接受三氧化二砷治疗的B组小鼠比较，C、D组小鼠接受三氧化 二砷治疗使其支气管肺泡冲洗液的eotaxin含量减少，尤其是接受2.5mg/kg 三氧化二砷治疗的C组小鼠与未接受三氧化二砷治疗的B组小鼠相比，有 显著差异(p＜0.05)。
表1.4支气管肺泡冲洗液中eotaxin的含量测定 Eotaxin(pg/ml) 平均 SD A组 14.42 8.39 B组 20.90 4.97 C组 12.38* 3.92 D组 16.00 4.06
*：与B组比较，p＜0.05。
在小鼠接受卵清蛋白抗原刺激后，采取小鼠血液并测量血清中卵清蛋 白专一性抗体含量(OVA-specific IgE values)，作为致敏反应 (immunization)的证据。表1.5显示B、C、D组小鼠的血清中卵清蛋白专 一性抗体含量比对照组A组小鼠明显升高，表示B、C、D组小鼠接受卵清 蛋白抗原刺激致敏成功。
表1.5卵清蛋白刺激指数(OVA stimulation index) OVA-专一性IgE抗体 (SI.) 平均 SD A组 0.30 0.09 B组 2.06 0.81 C组 2.20 0.70 D组 1.96 0.31
实施例二：以三氧化二砷处理全身性红斑狼疮的试验
2.1试验材料
2.1.1试验动物：NZB×NZW F1雌性小鼠，约7个月大；NZB(H-2d)雌 性小鼠；NZW(H-2z)雄性小鼠。
2.1.2药物：三氧化二砷注射液(Asadin，10mg/10ml/vial)，以PBS稀 释。
2.1.3试剂：
(1)甲基化牛血清白蛋白溶液(mBSA；methylated Bovine Serum Albumin)working solution)；
(2)小牛胸腺DNA处理液(calf thymus DNA working solution)；
(3)阻断液(Geletin-PBS溶液)；
(4)血清及正对照组：血清由采血后的血液经离心(5000rpm，10分钟) 而取得。使用时血清以阻断液稀释。正对照组则由融合瘤细胞(hybridoma) 分泌的抗-DNA IgG或IgM，于每一个培养盘取抗体并稀释成250倍的500μl 溶液，再作连续稀释；
(5)2级抗体(2Ab；辣根过氧化物酶(HRP)-共轭抗小老鼠γ链或μ链抗 体；Horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-mouseγchain or μchain Ab)；
(6)2，2’-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid(ABTS) 溶液；
(7)5X柠檬酸缓冲液；
(8)SDS溶液。
2.1.4主要仪器：测定抗体的ELISA读取机。
2.2试验方法
2.2.1建立人类全身性红斑野狼疮的动物模式
约7个月大NZB×NZW F1雌性小鼠及NZB/NZW配种的小鼠会自然发生一 种类似人类全身性红斑狼疮的自体免疫征候群。NZB/NZW配种的小鼠的自体 免疫征候群在四个月大时会产生抗核的抗体(antinuclear antibodies (IgG))，九个月大时会发生肾小球肾炎与蛋白尿，肾脏衰竭引发尿毒症是 死亡的主要原因。
2.2.2测定抗-dsDNA和抗-ssDNA抗体的ELISA测量法
运用标准ELISA测量法测定血清中抗dsDNA和ssDNA的抗-DNA抗体含 量，其步骤如下：
(1)以mBSA覆盖(coating)于每微孔中覆盖100μl的mBSA(10μg/mL)， 于4℃下静置隔夜，之后以PBS清洗二次。
(2)dsDNA和ssDNA覆盖：于每微孔中覆盖100μl的dsDNA及ssDNA(分 别为7.5μg/mL)，于4℃下静置隔夜，之后以PBS清洗二次。
(3)以阻断液阻断：于每微孔中覆盖200μl的阻断液，于44℃静置隔 夜(或室温下2小时或37℃下静置45分钟后室温15分钟)，以PBS-Tween 20 清洗三次。
(4)添加血清或正对照组或负对照组：每微孔中分别添加100μl血清 或正对照组或负对照组，于37℃静置45分钟后室温15分钟(或室温2小时)， 以PBS-Tween 20清洗六次。
(5)添加前述2级抗体：于每微孔中添加100μl的二级抗体，于37℃ 静置45分钟后室温15分钟，以PBS-Tween 20清洗六次。
(6)添加呈色剂：每微孔中添加100μl的呈色剂(ABTS溶液)，5-10分 钟避光反应，加入终止液(5％SDS溶液)并于吸光值405nm下进行OD值测量。
(7)抗-DNA IgG的量是以ELISA分析法的单位表示(EU/ml)
其与mAb 10F10相比较，10F10抗体在74ng/ml浓度下所产生的OD值 定义为1EU/ml的抗DNA IgG。抗核醣体IgG浓度是根据10F10抗体浓度以 EU计量。由231ng/ml的10F10抗体所产生的吸收值，则定义为1EU/ml的 抗核醣体IgG。
2.2.3小鼠的肾小球肾炎检测
小鼠的肾小球肾炎评估，是运用尿液测试沾片(Multistix，Bayer)比 色测定尿蛋白含量。比色测定尿蛋白含量大于1g/L(2+)定义为严重肾小球 肾炎。于小鼠第37周大与第40周大时检测。
2.2.4小鼠的存活率评估
每组6只小鼠，记录小鼠存活率至第43周大。
2.3试验步骤
2.3.1试验分组
小鼠24周大时随机分为三组，每组6只：(1)A组：仅用PBS(10ml/kg) 治疗；(2)B组：用剂量为2.5mg/kg的三氧化二砷治疗；(3)C组：用剂量 为5.0mg/kg的三氧化二砷治疗。
2.3.2试验流程
小鼠24周大时则随机分为三组，每组6只，接受治疗的方法每个星期 一、三、五各以腹腔注射打一次，持续1个月，治疗之前与治疗停止后，每 四周老鼠以眼窝采血法采取血液测抗-ssDNA和抗-dsDNA抗体，持续3个月。
2.3.3结果
运用ELISA测定小鼠血清中抗-dsDNA和抗-ssDNA抗体的含量：抗 -dsDNA的测量结果如表2.1所示。
表2.1 IgG抗-dsDNA效价(ELISA单位) 试验时间(周) 试验前 4 8 12 PBS(A组) 0.280 0.623 0.679 0.381 2.5mg/kg ATO(B组) 0.262 0.572 0.464 0.442 5mg/kg ATO(C组) 0.362 0.285 0.357 0.702
试验结果显示，接受三氧化二砷治疗的B、C组小鼠比未接受三氧化二 砷治疗的A组小鼠的血清中抗-DNA抗体含量较低；并且较高剂量三氧化二 砷效果较强。因为抗-DNA抗体的含量与SLE疾病活性有极强的关联性，此 试验结果显示三氧化二砷可能成为SLE新的治疗药剂。
2.3.4小鼠的肾小球肾炎检测结果
小鼠的肾小球肾炎评估是运用尿液测试沾片比色测定尿蛋白含量。比 色测定尿蛋白含量大于1g/L(2+)定义为严重肾小球肾炎。
表2.2小鼠具有严重肾小球肾炎的比例 时间(周) 37 40 PBS(A组) 25 100 2.5mg/kg ATO(B组) 16.67 40 5mg/kg ATO(C组) 25 25
表2.2的试验数据显示接受三氧化二砷治疗可以显著延缓B、C组小鼠 严重肾小球肾炎的发生，有一些尚未发生严重肾小球肾炎的小鼠，其中一 部分甚至仍有正常的肾脏功能也无蛋白尿的现象。而未接受三氧化二砷治 疗的A组小鼠则全部发生了严重肾小球肾炎。与未接受三氧化二砷治疗的A 组小鼠比较，三氧化二砷治疗可以显著降低B、C组小鼠严重肾小球肾炎的 发生与进行。
2.3.5小鼠存活率评估
表2.3小鼠存活率评估(％) 时间(周) 22 31 38 39 40 41 42 43 PBS(A组) 100 100 66.7 50 50 16.7 0 0 2.5mg/kg ATO(B组) 100 100 100 83.3 66.7 66.7 66.7 50 5mg/kg ATO(C组) 100 100 66.7 66.7 66.7 66.7 66.7 66.7
表2.3显示接受三氧化二砷治疗的B、C组小鼠，其43周的存活率为 50％，未接受三氧化二砷治疗的A组小鼠则全部死亡。与未接受三氧化二砷 治疗的A组小鼠比较，三氧化二砷治疗可以显著地延长B、C组小鼠的存活。
实施例三：以三氧化二砷毒杀恶性疟疾疟原虫的体外试验
3.1试验材料
3.1.1药物：三氧化二砷注射液(Asadin，10mg/10ml/vial)。三氧化 二砷，分子量197.84，试验药物剂型浓度为1mg/ml(5054.6μM)，试验前将 其稀释为160μM，然后再对半稀释，终浓度按ng/ml计算。
3.1.2原虫：恶性疟原虫FCC1/HN引自海南，试验室连续培养或冷藏保 种5年以上。
3.1.3培养液：常规体外连续培养恶性疟原虫用的培养基(液)，主要成 分为RPMI-1640(GBCO)，HEPES(GBCO)，NaHCO3和AB血清等。
3.1.4其它材料：血清、红细胞广州血液中心提供。红细胞(RBC)为 ACD抗凝B型全血，4℃保存，不超过一个月，临用前用无血清培养基洗涤 2-3次。
3.2试验方法
连续培养FCC1/HN。参照管惟滨、黄文锦、周元昌等的“体外微量测定 抗疟疾药效的方法”(《药学学报》，1982；17(2)：139-141)，以及陈林 的《抗疟疾的实验研究与临床应用》(第一版，上海，第二军医大学出版 社，2001)第248-249页记载的方法，在培养盘上每孔加药液20μl，再加 入感染率1％左右的虫血180μl，加盖，轻轻振荡数秒钟，于37℃，5％CO2， 培养48小时，去上清，取RBC涂一层薄血膜，经吉氏染色及镜检，计算原 虫感染率，对照组作为100，求出各剂量组的减虫率[减虫率＝(对照组感染 率-试验组感染率)/对照组感染率×100％]，以剂量对数为横坐标，以减虫率 的机率单位为纵坐标作回归方程，计算出使原虫增殖比对照组减少50％和 90％的用药量。
3.3试验步骤与结果(一)
3.3.1药物配制
灭菌青霉素瓶8个，按下表3.1分别加入RPMI-1640完全培养基和三 氧化二砷(ATO)。
表3.1三氧化二砷于培养液中的浓度 ATO(μl) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0 RPMI-1640培养基(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 浓度(μM) 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 0
3.3.2虫血稀释
取连续培养的FCC1/HN，涂片，染色，计算感染率，以B型RBC调节感 染率至1％左右。
3.3.3测试
参照陈林等的方法，在3599培养盘上每微孔加入药液20μl，再加入含 虫血180μl，试验4行。之后加盖振荡数秒钟，置37℃于5％CO2箱培养48 小时，涂薄片染色计算5000个RBC内感染有疟原虫的RBC数。
3.3.4结果
开始培养时原虫感染率为0.98％，表3.2中为培养后每5000个红血球 中的原虫数。
表3.2培养后每5000个红血球中的原虫数 A(对照) B C D E F G H(对照) ATO剂量(μM) 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 0 1 172 82 79 81 60 53 39 199 2 306 163 48 33 47 49 33 294 3 251 125 36 29 46 32 17 213 4 198 74 57 55 53 48 26 208
从上表可见，最高剂量(15μM)G#未能完全抑制疟原虫发育。
3.4试验步骤与结果(二)
3.4.1药物配制
无菌青霉素瓶9个，按下表3.3分别加入RPMI-1640完全培养基和三 氧化二砷(ATO)。
表3.3三氧化二砷于培养液中的浓度 ATO(μl) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 RPMI-1640(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓度(μM) 0 10 20 30 40 50 60 70 80
3.4.2虫血稀释
取连续培养的FCC1/HN，涂片，染色，计算感染率，以B型RBC调节感 染率至1％左右。
3.4.3测试
参照管惟滨、陈林等的方法，在40孔的培养盘上先于每微孔加入药液 20μl，再加入含虫血180μl，做4行。之后加盖振荡数秒钟，置37℃、5％CO2箱培养48小时，去上清液，取RBC涂薄片，染色及镜检，计算每5000个 RBC内感染有疟原虫的红血球数。
3.4.4结果
开始培养时原虫感染率为1.6％，表3.4中为培养后每5000个红血球中 的原虫数
表3.4培养后每5000个红血球中的原虫数 1(对照) 2 3 4 5 6 7 8 9 ATO计量μM 0 10 20 30 40 50 60 70 80 A 227 96 49 46 45 45 50 40 25 B 209 50 68 63 64 60 70 56 19 C 188 70 79 90 61 87 67 57 23 D 229 71 77 77 67 74 69 66 30
从上表可见，80μM#原虫密度有所下降，但还未能完全抑制其发育。
3.5试验步骤与结果(三)
3.5.1药物配制
取原液(三氧化二砷注射液(Asadin，10mg/10ml/vial)，以下相同) 20μl用完全培养基，在青霉素瓶内对半稀释共11个剂量组。分别为：2522、 1216、633、316、158、79、40、20、10、5、2.5、0μM。
3.5.2虫血稀释
取连续培养的FCC1/HN，涂片及染色，计算感染率，以B型RBC调节感 染率至1％左右。
3.5.3测试
参照管惟滨、陈林等的方法，在3599培养盘上每微孔加入药液20μl， 再加入含虫血180μl，做4行。之后加盖，振荡数秒钟，置37℃及5％CO2箱培养48小时，去上清液，取RBC涂薄片，染色及镜检，计算每5000个 RBC内感染有疟原虫的RBC数。
3.5.4结果
开始培养时原虫感染率为1.8％，表3.5中为培养后每5000个红血球中 的原虫数。
表3.5培养后每5000个红血球中的原虫数 1 2 3 4 5 6 ATO计量μM 2522 1216 633 316 158 79 A 0 0 0 0 0 38 B 0 0 0 0 0 28 C 0 0 0 0 0 33 D 0 0 0 0 0 25 四行混匀 0 0 0 0 0 32
(续上表) 7 8 9 10 11 12 ATO计量μM 40 20 10 5 2.5 0对照 A 63 75 88 108 206 503 B 63 75 88 108 206 503 C 52 69 81 160 236 450 D 43 60 77 108 186 392 四行混匀 44 65 92 116 200 473
上表可见，158μM可以完全抑制FCC1发育。
3.5.5结果统计
三氧化二砷(ATO)对FCC1抑制作用结果统计表如表3.6。
表3.6三氧化二砷(ATO)对FCC1抑制作用结果统计表 剂量 (uM) 剂量对数 (X) 感染率 (％) 减虫率 (％) 机率单位 (Y) 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -0.6021 -0.3010 0 0.3010 0.6021 0.9031 42.3 24.5 19.5 13.7 9.3 6.8 57.7 75.5 80.5 86.3 90.7 93.2 5.1942 5.6903 5.8596 6.0939 6.3225 6.4909 Y＝0.8177x+5.8188 r2＝0.9651 IC50＝0.10uM＝19.78ng/ml 95％置信限度(confidence limit)(11.43-34.2ng/ml) IC90＝3.68uM＝728.05ng/ml 95％置信限度(420.84-1259.53ng/ml)
3.6试验步骤与结果(四)
3.6.1药物配制
取原液100μl，加完全培养基3059μl，混匀，此为最高浓度药液(160μM)， 取最高浓度药液200μl，另取200μl培养基在青霉素瓶内混匀，进行对半稀 释，得一系列浓度的药液为：0、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、 0.625、0.3125、0μM。(共做4行，11列为最高剂量孔160uM)。
3.6.2虫血稀释
取连续培养的FCC1/HN，涂片，染色，计算感染率，以B型RBC调节感 染率约1％。
3.6.3测试
参照管惟滨、陈林等的方法，在3599培养盘每微孔加入药液20μl，再 加入含虫血180μl，做4行。之后加盖，振荡数秒钟，置37℃于5％CO2箱培 养48小时，去上清液，取RBC涂片及染色，镜检，计算每5000个RBC内 感染有疟原虫的RBC数(只有核细胞没有细胞质的死虫不计算)。
3.6.4结果
开始培养时原虫感染率为1.5％，表3.7中记录培养后每5000个红血球 中的原虫数。
表3.7培养后每5000个红血球中的原虫数 1 2 3 4 5 6 ATO剂量μM 对照 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 E 394 384 371 328 279 71 F 410 407 401 361 302 72 G 457 414 364 276 240 67 H 454 385 339 308 235 98 混合4行 448 358 330 306 246 99
(续上表) 7 8 9 10 11 ATO剂量μM 10 20 40 80 160 E 70 50 24 19 0 F 45 22 34 25 0 G 55 36 28 24 0 H 69 53 47 18 0 混合4行 80 58 50 23 0
3.6.5统计结果
三氧化二砷(ATO)对FCC1抑制作用结果统计，表示如表3.8。
表3.8三氧化二砷(ATO)对FCC1抑制作用结果统计 ATO剂量(uM) 剂量对数(X) 感染率(％) 减虫率(％) 机率单位(Y) 0.031 0.063 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -1.509 -1.201 -0.903 -0.6021 -0.3010 0 0.3010 0.6021 0.9031 79.9 73.7 68.3 54.9 44.4 17.9 12.9 11.2 5.1 20.1 26.3 31.7 45.1 55.6 82.1 87.1 88.8 94.9 4.1619 4.3659 4.5239 4.8743 5.1408 5.9192 6.1311 6.2160 6.6352 Y＝1.0904x+5.6582 r2＝0.9706 IC50＝0.25uM＝49.28ng/ml 95％置信限度(28.00-86.73ng/ml) IC90＝3.73uM＝737.94ng/ml 95％置信限度(419.28-1298.77ng/ml)
3.7试验步骤与结果(五)
3.7.1药物配制
取原液32μl，加完全培养基0.5ml，混匀，此为最高浓度药液(320μM)， 在青霉素瓶内进行对半稀释，得一系列浓度的药液为：0、320、160、80、 40、20、10、5μM。(共做12行，11列为最高剂量孔320uM)。
3.7.2虫血稀释
取连续培养的FCC1/HN，涂片，染色，计算感染率，以B型RBC调整感 染率至1％左右。
3.7.3测试
参照管惟滨、陈林等的方法，在3599培养盘上每微孔加入药液20μl， 再加入含虫血180μl，做12行。之后加盖，振荡数秒钟，置37℃并于5％CO2箱培养48小时，去上清液，混匀，各取RBC 5μl，混匀，涂片且染色镜检， 计算每5000个RBC内感染有疟原虫的RBC数(只有细胞核没有细胞质的死 虫不计算)。
3.7.4结果
开始培养时原虫感染率为1.1％，表3.9中为培养后每5000个RBC中的 原虫数。
表3.9培养后每5000个RBC中的原虫数 A B C D E F G H ATO计量(μM) 0 5 10 20 40 80 160 320 混合 256 75 34 21 9 5 0 0 混合 247 72 39 25 10 4 0 0 混合 231 69 28 20 9 6 0 0 混合 258 57 26 17 8 4 0 0
3.7.5三氧化二砷(ATO)对FCC1抑制作用，请参见表3.10。
表3.10三氧化二砷(ATO)对FCC1抑制作用结果统计表 ATO剂量(uM) 剂量对数(X) 感染率(％) 减虫率(％) 机率单位(Y) 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -0.3010 0 0.3010 0.6021 0.9031 27.4 12.9 8.5 3.6 2.0 72.6 87.1 91.5 96.3 98.0 5.6008 5.1311 6.3722 6.7866 7.0537 Y＝1.1832x+6.0328 r2＝0.9849 IC50＝0.13uM＝25.72ng/ml 95％置信限度(18.91-34.9ng/ml) IC90＝0.96uM＝189.93ng/ml 95％置信限度(139.65-258.3ng/ml)
3.8试验步骤与结果(六)
3.8.1药物配制
取原液32μl，加完全培养基0.5ml，混匀，此为最高浓度药液(320μM)， 在青霉素瓶内进行对半稀释，得一系列浓度的药液为：0、320、160、80、 40、20、10、5μM(做1-6列，H行为最高剂量孔320uM)。
3.8.2虫血稀释
取连续培养的FCC1/HN，涂片，染色，计算感染率，以B型RBC调整感 染率至1％左右。
3.8.3测试
参照管惟滨、陈林等的方法，在3599培养盘上每微孔加入药液20μl， 再加入含虫血180μl，做12行(1-6为ATO，7-12为ATS)。之后加盖振荡数 秒钟，置37℃并于5％CO2箱培养48小时，去上清液，混匀，各取RBC 5μl， 混匀，涂片并染色镜检，计算每5000个RBC内感染有疟原虫的RBC数(只 有细胞核没有细胞质的死虫不计算)。
3.8.4结果
开始培养时原虫感染率为1.39％，表3.11为培养后每5000个RBC中的 原虫数。
表3.11培养后每5000个RBC中的原虫数 A B C D E F G H ATO计量(μM) 0 5 10 20 40 80 160 320 混合 420 103 66 38 17 8 0 0
3.8.5结果统计
三氧化二砷(ATO)对FCC1抑制作用结果统计表，如表3.12所示。
表3.12三氧化二砷(ATO)对FCC1抑制作用结果 ATO剂量(uM) 剂量对数(X) 感染率(％) 减虫率(％) 机率单位(Y) 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -0.3010 0 0.3010 0.6021 0.9031 24.5 15.7 9.0 4.0 1.9 75.5 84.3 91.0 96.0 98.1 5.6903 6.0027 6.3408 6.7507 7.0749 Y＝1.5032x+5.8726 r2＝0.9495 IC50＝0.32uM＝63.31ng/ml 95％置信限度(40.32-99.4ng/ml) IC90＝2.09uM＝413.48ng/ml 95％置信限度(263.06-258.30ng/ml)
3.9结论
经由多次试验，结果发现IC50在19.78-63.31ng/ml之间，平均为 35.57ng/ml。IC90在185.97-737.94ng/ml之间，平均451.07ng/ml。此剂量 比现有的抗疟药磷酸氯喹大10倍左右，与磷酸哌喹的剂量相当。
实施例四：三氧化二砷毒杀非洲锥虫病的体外试验
4.1试验材料
4.1.1药物：三氧化二砷注射液(Asadin，10mg/10ml/vial)。
4.1.2原虫：Trypanosoma brucei标定为“427”。该原虫株来自于纽约 大学李美丽博士(Dr.Mary Lee)。
4.1.3培养液：含有胎牛血清的SDM79(JRH 57453)培养液。
4.2试验方法
以显微镜观察活细胞数量与型态变化。
4.3试验步骤
以三氧化二砷0.1mg/ml/天处理3天，观察7日的毒杀作用。
4.4试验结果
细胞学发现虫体死亡呈现线状而非一般的小圆形。暂时的观察显示三 氧化二砷对培养的Trypanosoma brucei的毒杀作用与美拉胂醇 (Melarsoprol)相当。
实施例五：三氧化二砷对人类周边血液单核白血球关于细胞凋亡作用 的体外试验
5.1试验材料
5.1.1细胞株：自行分离的新鲜人类周边血液单核白血球。
5.1.2药物：三氧化二砷注射液(Asadin，10mg/10ml/vial)。
5.1.3试剂：白血球分离试剂。
5.2试验方法及步骤
5.2.1细胞株分离
由人类血液分离出人类周边血液单核白血球，运用Ficoll Plaque方 法(一种用以分离血球的比重梯度法)，利用其它血球与人类周边血液单 核白血球的密度不同而将其分离。
5.2.2细胞株培养
分离出的人类周边血液单核白血球培养于RPMI1640并加入10％胎牛血 清，在5％CO2及95％空气、37℃下培养。
5.2.3细胞凋亡检测
以PI染色法染色后，由流式细胞仪(flowcytometry)检测。
5.2.4人类特定周边血液单核白血球的细胞凋亡测试
结合单株抗体-荧光串联染色法(mAb-fluorescein tandem staining) 和Phiphilux(一种侦测活细胞的套组(kit)，是针对活细胞中光冬酶 -3(caspase-3)及光冬酶-3样(caspase-3-like)(切点位置相同)活性的设 计；侦测原理是利用设计一段可供caspase-3及caspase-3-like蛋白辩识， 且能主动被细胞嗜入，环状部结构两端标有荧光的肽，该肽称为Phiphilux) 处理后，再由流式细胞仪检测分类。
5.3实验结果
5.3.1三氧化二砷诱发人类周边血液单核白血球细胞凋亡作用
请参阅表5.1所示，发现三氧化二砷诱发人类周边血液单核白血球细 胞凋亡作用。
表5.1三氧化二砷诱发人类周边血液单核白血球细胞凋亡作用 浓度 24小时细胞死亡百分比(％) 48小时细胞死亡百分比(％) 对照组 6.2±0.6％ 7.3±0.8％ 0.5μM 7.3±1.2％ 7.6±0.6％ 2.5μM 13.7±1.6％ 15.2±2.3％ 5.0μM 14.6±2.1％ 17.2±1.9％ 1.0μM 17.8±1.8％ 20.3±2.6％
当以不同浓度的三氧化二砷(分别为0、0.5、2.5、5、或10μM)，对全 部人类周边血液单核白血球细胞分别处理24小时和48小时后，再以PI staining将人类周边血液单核白血球细胞染色，由流式细胞仪检测全部人 类周边血液单核白血球细胞的细胞凋亡百分比。
由表中显示，在处理24小时和48小时的两组中，三氧化二砷在浓度2.5 至10μM之间，三氧化二砷诱发人类周边血液单核白血球细胞凋亡作用并无 剂量依存关系(dose-dependent)；在48小时组有稍高的死亡比率，也许一些 特定种类的人类周边血液单核白血球细胞对三氧化二砷比其它细胞敏感。
5.3.2运用光冬酶-3活性区别对三氧化二砷敏感的白血球种类
配合特殊种类细胞染色模式区别对三氧化二砷所诱发的凋亡反应最明 显的人类周边血液单核白血球细胞。结果如表5.2所示。
运用光冬酶-3活性测试，配合特殊种类细胞染色模式，以人类周边血 液单核白血球细胞表面记号(例如T淋巴球以“CD3+”辨识，B淋巴球以 “CD19+”辨识)。由表5.2的试验结果显示，以浓度5.0μM的三氧化二砷处 理48小时后，T淋巴球达96％死亡。因此，在三氧化二砷诱发特定人类周 边血液单核白血球细胞的凋亡作用中，T淋巴球具有一定的敏感度。
表5.2经48小时三氧化二砷处理后，所诱发特定人类周边血液单核白 血球细胞凋亡作用 对照组 34.5(％) 1μM 36.1(％) 5μM 96.2(％)
实施例六：三氧化二砷对人类纤维母细胞的细胞凋亡作用与影响细胞 周期的体外试验
6.1试验材料
6.1.1细胞株：购买自ATCC的人类纤维母细胞IMR-90[IMR90]。
6.1.2药物：三氧化二砷注射液(Asadin，10mg/10ml/vial)。
6.1.3试剂：Triton X-100、氯化钠、EGTA、NP-40、氟化钠、Na3VO4、 抑酶肽(aprotinin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、PBS、苯甲基磺酰氟 (phenylmethyl-sulfonylfluoride，PMSF)。
6.2试验方法
6.2.1三氧化二砷抑制人类成纤维母细胞细胞株增殖作用的敏感性测试
6.2.1.1细胞周期测试
以不同浓度的三氧化二砷(分别为0、1.0、2.5、5、或10μM)，对人类 成纤维母细胞细胞株处理24小时后，利用碘化物染色法(propidium iodide staining)染色后，以流式细胞仪量测细胞周期停滞。
6.2.1.2利用MTT比色法测量细胞活性
在96-微孔的培养盘中，每个微孔加入5×103个细胞。细胞在37℃下培 养后，加入30μl MTT溶液，之后避光培养4小时。Formazan粒状染料(Formazan grain)溶解在DMSO后，利用ELISA读取机于570nm下，测量吸光值。
6.2.1.3观察凋亡小体的产生
细胞凋亡小体的型态是利用Hoechst染色观察。去掉培养液，利用在 PBS中4％福尔马林(formaldehyde)室温下固定5分钟。然后加入Hoechst 33258染料5μg/ml在PBS中作用5分钟，洗去之后，加入试剂(PBS∶甘油 (glycerol)＝3∶1)。利用荧光显微镜观察被染成荧光的细胞核。利用Hoechst 33258染色来观察细胞凋亡的形态。
6.2.2实验结果
6.2.2.1三氧化二砷引发人类成纤维母细胞的细胞周期停滞
请配合参阅图1所示，以不同浓度的三氧化二砷(分别为0、1.0、2.5、 5、10μM)，对人类成纤维母细胞细胞株处理24小时后，利用碘化物染色法 及流式细胞仪分析细胞周期，发现三氧化二砷引发人类成纤维母细胞的细 胞周期停滞于G2/M。
6.2.2.2三氧化二砷引发人类成纤维母细胞的细胞死亡
请配合参阅图2所示。以不同浓度的三氧化二砷(分别为0、1.0、2.5、 5、10μM)，对人类成纤维母细胞细胞株处理24小时后，利用MTT比色法测 量细胞活性，发现三氧化二砷对人类成纤维母细胞具细胞毒性。
同时，以不同浓度的三氧化二砷(分别为0、1.0、2.5、5、10μM)，对 人类成纤维母细胞细胞株处理24小时后，并以DAPI着色测试细胞凋亡小 体。实验结果发现对照组并无细胞凋亡现象，1.0和2.5μM三氧化二砷诱 发细胞小体；5.0和10μM出现明显的细胞凋亡小体，且人类成纤维母细胞 发生细胞凋亡与坏死现象。
6.2.2.3分析方法
试验采用两原素析因设计数据的方差分析。数据均采用SPSS套装软件 完成。
根据本发明可作的不同修正及变化对于熟悉本领域的技术人员而言均 显然不会偏离本发明的范围与精神。虽然本发明已叙述特定的优选具体实 例，必须了解的是本发明不应被不当地限制于这些特定具体实例上。