技术领域
本发明涉及一种中药提取物及其在制药领域的应用更具体的说涉及一种用于治疗心脑血管疾病的响铃草提取物、制备方法及应用。
技术背景
流行病学研究表明,血脂异常是动脉粥样硬化极为重要的致病危险因素。以往我国人群血中有致动脉粥样硬化作用的胆固醇和甘油三酯水平较西方人低,而有抗动脉粥样硬化作用的高密度脂蛋白胆固醇水平较高,被认为是患动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病) 较少的主要原因之一。但近年对我国健康人群血脂水平的调查发现,男女人群的血总胆固醇和甘油三酯水平都较以前上升,致动脉粥样硬化的危险性相应增加。因此,寻找天然、安全有效的调节血脂生物资源对防治心脑血管疾病具有重要意义。这些疾病病因复杂，但与脂质代谢异常均有一定的关系。高脂血症作为导致心脑血管疾病的主要独立危险因素越来越受到人们的关注。研究证明，正确地调整血脂水平能有效地降低心脑血管疾病的发病率和死亡率。临床上绝大多数降低血胆固醇水平的方法需要严格控制饮食并依赖于药物，而降血脂药物的副作用使其应用受到了一定程度的限制。目前响铃草及其提取物的相关研究主要集中在抗菌消炎方面，中国专利（200710077676.0）公开了一种从响铃草中提取的天然抗菌组合物及其提取方法；吴贞建等报道了关于响铃草黄酮提取物体外抗菌活性研究。
发明内容
响铃草味苦、微酸、性寒，民间用于治疗久咳痰血、慢性肾炎、扁桃体炎、淋巴腺炎、疗毒恶疮、月经不调等；通过研究发现，响铃草中富含甾体类研究发现不同剂量的响铃草中富含的甾醇能不同程度地改善高脂血症小鼠的血脂水平，降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和动脉硬化指数，升高血清高密度脂蛋白胆固醇水平；另外，其富含的齐墩果酸具有降低肝硬化大鼠脑匀浆酷氨酸水平，故有利于肝性脑病的防治。本发明在上述研究的基础上提供了一种用于治疗心脑血管疾病的响铃草提取物、制备方法及应用具体内容为：
用于治疗心脑血管疾病的响铃草提取物的制备方法，包括以下步骤：
1）粉碎响铃草原药材，装柱，用60-95%乙醇渗漉，合并回收提取液回收乙醇制干，得到乙醇提取液；
2）减压回收乙醇提取液中的乙醇，至无醇味，在回收乙醇的过程中不断加入水，使回收乙醇过程中的析出物质呈混悬状态，得到提取物水溶液；
3）用石油醚、乙醚、汽油、正丁醇、正戊醇或苯中任意一种或两种以上的混合物反复萃取洗涤提取物水溶液，至母液中无悬浮物质及皂化泡沫为止，合并回收有机相，得到响铃草提取物。
步骤1）所述的渗漉的条件为：渗漉溶媒采用75-90%乙醇，渗漉量为药材的8-10倍体积。
步骤3）所述合并回收有机相得到响铃草提取物还经过纯化，具体步骤为：
Ⅰ.加热有机相至低于沸点1-2℃，回收至有物质析出，得到析晶母液；
Ⅱ.将析晶母液置于水浴或油浴中，以每小时3-5℃的速度降温，至室温，过滤得到粗提取物；
Ⅲ.用无水乙醇洗涤粗提取物，至析出物表面无油脂类物质，得到响铃草提取物。
根据上述步骤所述的方法制备得到用于治疗心脑血管疾病的响铃草提取物；其中，响铃草提取物中包含甾体成分和齐墩果酸。
所述的用于治疗心脑血管疾病的响铃草提取物在制备治疗心脑血管疾病中的应用。
本发明的有益技术效果是：本发明提供了一种用于治疗心脑血管疾病的响铃草提取物能有效改善高脂血症小鼠的血脂水平，降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇，预防和治疗心血管疾病；而且本发明所提供的提取物制备方法工艺简单，环境污染小，适合大规模的工业生产。
具体实施方式
实施例1 用于治疗心脑血管疾病的响铃草提取物的制备
称量响铃草原药材5.0kg，粉碎，用90%乙醇的溶媒1L浸润，装渗漉柱，加入溶媒浸泡12h,开始渗漉，渗漉量为药材的8-10倍体积，以渗漉液中甾醇量为渗漉体积的判断依据，得到渗漉滤液；
对于渗漉溶媒的选择可以选择60-95%，在这一范围内的溶媒，均可以实现对响铃草中有效部位的提取；但最优的溶媒浓度为75-90%乙醇；
合并渗漉滤液，减压回收乙醇提取液中的乙醇，至无醇味，在回收乙醇的过程中不断加入水，使回收乙醇过程中的析出物质呈混悬状态，得到提取物水溶液；
用石油醚、乙醚、汽油、正丁醇、正戊醇或苯中任意一种或两种以上的混合物反复萃取洗涤提取物水溶液，至母液中无悬浮物质及皂化泡沫为止，合并回收有机相，得到响铃草提取物，其中响铃草提取物的中应当含有甾体类物质和齐墩果酸。
如果在上述提取物水溶液中脂类物质含量较高，导致萃取后的响铃草提取物含有较多的脂类物质和萜类物质，则需要在萃取后添加一步纯化工艺；其中纯化工艺的步骤为：
Ⅰ.加热有机相至低于沸点1-2℃，回收至有物质析出，得到析晶母液；
Ⅱ.将析晶母液置于水浴或油浴中，以每小时3-5℃的速度降温，至室温，过滤得到粗提取物；
Ⅲ.用无水乙醇洗涤粗提取物，至析出物表面无油脂类物质，得到响铃草提取物。
在上述工艺的每个步骤中都应当检测提取部位中有效成分的含量，其中各有效成分的检测方法为：
齐墩果酸的检测条件为：色谱柱为 (4.6 mm×150.0mm，5 m)；流动相为甲醇一水(V:V=90:10)；检测波长为220 nm；进样量为10μl；流速为1.0 mL/min；柱温为25℃。
甾体的检测条件为：A、提取各工艺阶段提取物，干燥至物溶剂，残渣加1ml冰醋酸溶解，再加1ml醋配，于溶液边沿滴加浓硫酸一滴，显紫红色；B、提取各工艺阶段提取物，干燥至物溶剂，用1ml氯仿溶解，加1ml浓硫酸，氯仿层显红色，浓硫酸层有淡黄绿色。以上试验表明该植物含甾体。
实施例2 响铃草提取物对高脂模型大鼠降血脂作用的实验研究
试验动物 雄性SD大鼠,60只,体重150～200g，清洁级。
SPF实验动物房 环境温度20℃～24℃,相对湿度40%～70% ,昼夜交替12h/12h。
高脂饲料 78.95%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、0.05%牛胆盐；
按卫生部保健食品功能检测与评价技术规范:大鼠适应环境3d后,喂饲基础饲料5d,禁食过夜采尾血,离心(3000 rpm) ,取血清,测血清TC、TG、HDL-C ,根据TC水平随机分为5组,即三个剂量组(0.33、0.66和2.00g/kg)、一个高脂饲料对照组和一个基础饲料对照组。试验期内三个剂量组给予高脂饲料和不同剂量的受试物,高脂饲料对照组给予高脂饲料和蒸馏水,基础饲料对照组给予基础饲料和蒸馏水。于试验的第30d称重,禁食16h后取尾血,测血清TC、TG、HDL-C。
统计分析 采用SPSS10.0统计软件进行方差分析,显著性水准定为α=0.05 。
响铃草提取物对大鼠血清TC的的影响 表1
注：各剂量组与高脂模型对照比较 * P<0.01，**P<0.01
高脂饲料对照组动物血清TC 与基础饲料对照组比较差异有统计学意义( P <0.01) ,说明本次试验高脂模型建立成功。试验后0.66 、2.00 g/ kg 剂量组的响铃草提取物能使大鼠血清中TC 降低,与高脂饲料对照组比较差异有统计学意义(P<0.01) 。
响铃草提取物对大鼠血清TG的影响 表2
注：各剂量组与高脂模型对照比较 * P<0.01，**P<0.01
试验后0.33、0.66、2.00 g/kg 剂量组的响铃草提取物能使大鼠血清中TG降低,与高脂饲料对照组比较差异有统计学意义( P < 0.05 , P <0.01) ,说明响铃草提取物对大鼠血清中的TG具有降低作用。
响铃草提取物对大鼠血清HDL-C 的影响 表3
注:各组与高脂饲料对照组比较P>0.05
各组间血清HDL-C差异无统计学意义,说明响铃草提取物对HDL-C无升高作用。
本次实验结果表明,0.66、2.00g/kg 剂量组的响铃草提取物能使大鼠血清中TC明显降低,0.33、0.66和2.00g/kg 剂量组的响铃草提取物均能使大鼠血清中TG降低,但响铃草提取物对HDL-C无明显影响,说明响铃草提取物的降低血脂作用；调整血脂水平能有效地降低心脑血管疾病的发病率和死亡率。