小牛血去蛋白提取物制备方法及其冻干粉.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101433553 B (45)授权公告日 2011.08.17 CN 101433553 B *CN101433553B* (21)申请号 200710194950.2 (22)申请日 2007.12.07 A61K 35/14(2006.01) A61K 9/19(2006.01) A61P 1/04(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 9/14(2006.01) (73)专利权人 吉林康乃尔药业有限公司 地址 132013 吉林省吉林市高新区深圳街 95 号。

2、 (72)发明人 宋治国 (74)专利代理机构 北京元中知识产权代理有限 责任公司 11223 代理人 王明霞 CN 1579420 A,2005.02.16, 说明书第 1-6 页， 图 1. CN 1569030 A,2005.01.26, 说明书第 1-8 页， 图 1. CN 1899307 A,2007.01.24, 说明书第 1-7 页 . 郭东宇等 . 一种小牛血去蛋白提取物注射剂 及其制备方法 .中医药管理杂志 .2007, 第 15 卷 ( 第 2 期 ),110. (54) 发明名称 小牛血去蛋白提取物制备方法及其冻干粉 (57) 摘要 本发明的目的在于提供一种小牛血去蛋白。

3、提 取物制备方法及其冻干粉， 该方法过程简便， 易 于大批量生产， 得到的提取物生物活性高， 产品 纯度好， 冻干粉采用梯度升温干燥， 成品外观好， 易于溶解。小牛血去蛋白提取物通过如下方法制 得 ： 将采集的血清加热除蛋白， 过滤后滤液浓缩， 乙醇除蛋白， 然后加入活性炭和酸进行水解脱色， 过滤后调节 pH 值至合适范围， 冷冻除蛋白并反复 操作， 最后用纤维膜超滤除高分子物质， 得到小牛 血去蛋白提取物， 然后加入赋形剂和注射用水， 预 冻， 再梯度升温真空干燥， 得到成品。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吴斌 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权。

4、利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 CN 101433553 B1/1 页 2 1. 一种小牛血去蛋白提取物的制备方法， 包括如下步骤 ： (1) 将小牛血搅拌、 离心得到血清 ； (2) 将离心得到的血清加热去除蛋白， 过滤后浓缩滤液 ； 所述浓缩为浓缩至原体积的 1/4 1/12 ； 所述加热温度为 60 90， 加热时间 5 10 分钟 ； (3) 向浓缩后的滤液中加入乙醇进行醇沉， 过滤去除沉淀出的蛋白， 滤液浓缩回收乙 醇， 得到醇沉后的滤液 ； 所述乙醇加入量为步骤(3)所述浓缩后的滤液的210倍， 乙醇浓 度为 50 95， 醇沉时间为 24 72 小时 ； (4) 。

5、向醇沉后的滤液中加入酸调节 pH 值为酸性， 加入活性炭并加热进行脱色和水解， 过滤收集滤液 ； 所述酸为盐酸、 硫酸、 硝酸、 或磷酸 ； 所述 pH 值为 3.5 6.5 ； 所述加热温度 为 60 90， 时间 10 60 分钟 ； (5) 将收集的滤液用碱调节 pH 至 6.8 8， 冷冻除蛋白， 过滤得到滤液， 再冷冻、 过滤， 反复 2 5 次， 所述冷冻温度为 -50 0， 时间为 12 72 小时 ； 所述碱为 NaOH、 KOH、 或碳 酸氢钠 ； 所述 pH 值 7 7.5 ； (6) 将冷冻除蛋白后得到的滤液用纤维膜超滤除高分子物质， 得到小牛血去蛋白提取 物， 所述纤维。

6、膜为截留分子量 5000 30000 道尔顿。 2. 根 据 权 利 要 求 1 所 述 的 制 备 方 法， 其 特 征 在 于， 步 骤 (5) 所 述 冷 冻 温 度 为 -40 -10， 所述时间为 24 48 小时。 3. 根 据 权 利 要 求 2 所 述 的 制 备 方 法， 其 特 征 在 于， 步 骤 (5) 所 述 冷 冻 温 度 为 -30 -20， 所述时间为 30 40 小时。 4. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 (6) 所述纤维膜超滤为顺序用 30000、 10000、 5000 道尔顿分子量的中空纤维膜超滤。 5. 根据权利要求 1 所述。

7、的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法得到的小牛血去蛋白 提取物呼吸活力 8 10.1l O2/(mgh)， 刺激指数 3 5。 6. 一种含有按权利要求 1 所述方法制备的小牛血去蛋白提取物的注射用冻干粉， 其 特征在于， 所述的注射用冻干粉的制备步骤包括 ： 称取 小牛血去蛋白提取物溶液， 加入可 药用赋形剂， 搅拌溶解， 加入注射用水至规定体积， 分别用 0.45m、 0.22m 超滤膜过滤除 菌， 按一定规格灌装， 压半盖， -60 -30下预冻 2 5 小时， 然后抽真空， 真空度 3 9 帕， 缓慢升温至 -10， 升温时间 8 16 小时， 保持 -10真空干燥 2 6 小时，。

8、 再缓慢升温 至 10， 升温时间 4 8 小时， 再升温至 20 35干燥， 升温时间 3 6 小时， 最后保温干 燥 30 90 分钟， 压全盖， 成品完成。 7. 根据权利要求 6 所述注射用冻干粉， 其特征在于， 制备步骤包括 ： 称取小牛血 去蛋白提取物溶液， 加入甘露醇或右旋糖酐， 搅拌溶解， 加入注射用水至规定体积， 分 别 用 0.45m、 0.22m 超 滤 膜 过 滤 除 菌， 按 400mg/ 支 或 800mg/ 支 规 格 灌 装， 压 半 盖， -50-40下预冻3小时， 然后抽真空， 真空度57帕， 缓慢升温至-10， 升温时间 12 小时， 保持 -10真空干燥。

9、 4 小时， 再缓慢升温至 10， 升温时间 6 小时， 再升温至 25 32干燥， 升温时间 5 小时， 最后保温干燥 50 80 分钟， 压全盖， 成品完成。 权 利 要 求 书 CN 101433553 B1/9 页 3 小牛血去蛋白提取物制备方法及其冻干粉 技术领域 0001 本发明涉及医学生化药物领域， 具体地说为一种小牛血去蛋白提取物制备方法及 其冻干粉。 背景技术 0002 小牛血去蛋白提取物 ( 血活素 ) 自 1955 年由瑞士素高药厂开发研制成功五十年 以来， 已经在世界各国推广使用。它是 1 18 个月的幼牛血清经除蛋白后得到的小分子生 物活性物质， 其注射液每毫升含有 。

10、405 毫克小牛血去蛋白提取物的总固体， 其中 30为 氨基酸、 糖类、 酮酸、 嘌呤、 核苷酸及相对分子量为 2500 3000 的寡肽类物质， 70为无机 物 (K+、 Na+、 Cl-、 Ca2+等 )， 它们能增加组织细胞对氧的摄入和利用， 促进葡萄糖向脑组织运 转， 并能促进葡萄糖在脑内进行有氧代谢， 尤其在缺血、 缺氧的条件下， 小牛血去蛋白提取 物能使脑组织产生更多的高能化合物 (ATP)， 以维护脑组织的正常生理功能。它主要用于 ： 1 改善脑部血液循环和营养障碍性疾病引起的神经功能缺损， 用于缺血缺氧脑血管疾病、 颅 脑外伤如脑梗塞、 脑出血、 脑炎、 脑动脉硬化、 老年痴呆。

11、、 促复苏等 ； 2 作为能量合剂治疗心 肌炎、 冠心病等 ； 3 末梢动、 静脉循环障碍及其引起的动脉血管病， 腿部溃疡及周围神经病 变 ； 4 消化性溃疡、 萎缩性胃炎 ； 5 放射所致皮肤、 粘膜损伤 ； 6 减轻肝细胞损伤， 用于各种肝 炎、 肝硬化等。具有良好疗效且无毒耐受性好。 0003 目前， 本领域中常用的小牛血去蛋白提取技术主要为离心、 乙醇除蛋白、 酸解酶解 除蛋白、 超滤除大分子物质等过程。但目前公知技术中很难最大程度的去除蛋白和保留活 性物质。 例如在专利CN200410013643中采用将血清碱性、 酸性(PH6.57.5， 并7090 热处理 ) 离心除蛋白， 60。

12、 80减压浓缩， 再超滤截留 5000-10000 道尔顿的分子， 然后加 入水、 渗透压调节液和活性炭加热， 过滤， 最后加入水配得小牛血去蛋白提取物注射液。其 技术难度小， 易于生产， 但很难将杂质， 特别是蛋白完全去除， 影响了产品纯度， 从而危害患 者健康甚至生命。 0004 在申请专利 CN200610080520 中公开了另一种小牛血去蛋白提取技术 ： 将小牛血 清先用两倍体积的 96乙醇除蛋白， 再在 37、 1 个大气压下用真空旋转蒸发仪减压除 乙醇， 然后酶水解 24 小时， 离心 (1000rpm， 4， 30min)， 再用葡聚糖 G15 凝胶层析脱盐和 DEAE-Sep。

13、hadex-50 凝胶层析分离， 最后膜滤除高分子物质并紫外线灭菌。该方法所用酶水 解除蛋白条件剧烈， 破坏了更多的活性物质， 使得产品生物活性降低。 0005 在专利 CN200410062657 中公开了一种制备小牛血去蛋白眼膏的技术， 其中涉及 一种小牛血去蛋白提取物的提取技术 ： 将小牛血液离心 (2000-4000rmp、 10-20 分钟 ) 得到 红细胞， 加入 2-6 倍水在 -20 -10下冻溶 20-30 小时， 离心 (10000-15000rmp、 10-30 分 钟 )， 然后 50-70下巴氏消毒 6-15 小时， 再超滤除高分子物、 脱盐， 浓缩后用活性炭脱色 (。

14、90-110， 10-60 分钟 )。其采用从红细胞中提取， 加大了制备难度， 增加了成本， 但效果并 没有实质提高。另外他采用 50-70温度下进行消毒， 不能消灭大部分致病细菌， 而他进行 活性炭脱色时采用 90-110高温又破坏了血液中的有效成分， 所得产品效果低。 说 明 书 CN 101433553 B2/9 页 4 0006 专利 CN200410013509 中公开了一种小牛血去蛋白提取物冻干粉的制备方法， 先 在-45-40下预冻， 然后抽真空至110帕， 升温至-20-5， 再第二次升温至30 35， 然后保温干燥至合格。 该专利没有给出预冻和两个干燥阶段的具体时间， 而我们。

15、知道 对于冻干工艺来说， 冻干时间是非常关键的， 时间过短会干燥不彻底， 造成外观塌陷、 出泡 坑， 时间过长则会破坏细胞膜， 灭活有效成份。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种小牛血去蛋白提取物制备方法， 该方法过程简便， 易 于大批量生产， 得到的提取物生物活性高， 产品纯度好。 0008 为实现本发明目的， 采取如下方法制备小牛血去蛋白提取物 ： 0009 (1) 将小牛血搅拌、 离心得到血清 ； 0010 (2) 将离心得到的血清加热去除蛋白， 过滤后浓缩滤液 ； 0011 (3) 向浓缩后的滤液中加入乙醇进行醇沉， 过滤去除沉淀出的蛋白， 滤液浓缩回收 乙醇， 得到醇沉后的。

16、滤液 ； 0012 (4) 向醇沉后的滤液中加入酸调节 PH 值为酸性， 加入活性炭并加热进行脱色和水 解， 过滤收集滤液 ； 0013 (5) 将收集的滤液用碱调节 PH 至 6.8 8， 冷冻除蛋白， 过滤得到滤液， 再冷冻、 过 滤， 反复 2 5 次， 所述冷冻温度为 -50 0， 时间为 12 72 小时 ； 0014 (6) 将冷冻除蛋白后得到的滤液用纤维膜超滤除高分子物质， 得到小牛血去蛋白 提取物， 所述纤维膜为截留分子量 5000 30000 道尔顿。 0015 上述制备方法中， 步骤 (1) 中如果将血液只进行离心分离血清， 会由于纤维蛋白 原存在造成血浆凝固， 使得提取的。

17、血清质量很差， 严重影响后面提取过程， 所以我们先将血 液用搅拌器进行搅拌， 搅拌速度 60 200 转 / 分钟， 搅拌时间 5 20 分钟 ； 其后进行离心， 离心速度为 800 2000 转 / 分钟， 时间为 20 40 分钟， 这里我们将离心时间进行延长同 样也可以提高所得血清质量。 0016 上述制备方法中， 步骤 (2) 中采取了先进行加热除蛋白的方法， 通过高温使蛋白 凝固变质来去除蛋白， 同时较高温度又可以杀死血清中的各种细菌， 提高了产品的安全性， 所述加热温度为 60 90， 加热时间 5 10 分钟， 其温度范围不会对血清中有效成分造 成破坏 ； 过滤掉沉淀后减压浓缩，。

18、 至剩余原体积的 1/4 1/12， 如果剩余体积太小则浓度 过大， 降低了后面醇沉除蛋白的效果， 如果剩余体积过大则使后面操作困难， 并影响产品活 力。 0017 上述制备方法中， 步骤 (3) 中所述乙醇加入量为所述浓缩后滤液体积的 2 10 倍， 乙醇浓度为 50 95， 醇沉时间为 24 72 小时， 我们将醇沉时间延长， 也可以提高蛋 白的清除效果， 同时不会影响有效成分。 0018 上述制备方法中， 步骤 (4) 中如果采用水解酶进行水解， 势必会对血清有效成分 造成破坏， 为了得到更高效的提取物， 我们采用了酸调解的方法， 调解过程中同时加入活性 炭脱色吸附杂质， 减少了提取步骤。

19、， 简化了工艺， 其中所述酸为盐酸、 硫酸、 硝酸或磷酸 ； 所 述 PH 值为 3.5 6.5 ； 所述加热温度为 60 90， 时间 10 60 分钟 ； 步骤 (5) 中根据蛋 白和其他一些杂质在低温下会在溶液中析出的原理， 我们用碱调节溶液 PH 值后采用了低 说 明 书 CN 101433553 B3/9 页 5 温冷冻的新方法， 很大效率的提高了蛋白等杂质的去除率， 清除了其他现有技术无法清除 的蛋白和细小杂质， 其中所述碱为 NaOH、 KOH 或碳酸氢钠 ； 所述 PH 值 7 7.5。 0019 上述制备方法中， 步骤 (5) 所述冷冻温度为 -40 -10， 时间为 24 。

20、48 小时。 0020 上述制备方法中， 步骤 (5) 所述冷冻温度为 -30 -20， 时间为 30 40 小时。 0021 上述制备方法中， 步骤 (6) 中我们用三种规格的中空纤维膜依次进行超滤， 能够 有效的将大分子物去除， 避免了注射后大分子物引起的免疫反应。其中所述纤维膜超滤为 顺序用 30000、 10000、 5000 道尔顿分子量的中空纤维膜超滤。 0022 上述制备方法中， 所述制备方法得到的小牛血去蛋白提取物呼吸活力 8 10.1lO2/(mgh)， 刺激指数 3 5。 0023 本发明另一目的在于提供一种含有上述方法制备的小牛血去蛋白提取物的注射 用冻干粉， 所述注射用。

21、冻干粉制备包括如下步骤。 0024 一种含有前面所述的小牛血去蛋白提取物的注射用冻干粉， 所述注射用冻干 粉制备步骤包含 ： 称取小牛血去蛋白提取物溶液， 加入可药用赋形剂， 搅拌溶解， 加入注 射用水至规定体积， 分别用 0.45m、 0.22m 超滤膜过滤除菌， 按一定规格灌装， 压半 盖， -60 -30下预冻 2 5 小时， 然后抽真空， 真空度 3 9 帕， 缓慢升温至 -10， 升 温时间 8 16 小时， 保持 -10真空干燥 2 6 小时， 再缓慢升温至 10， 升温时间 4 8 小时， 再升温至 20 35干燥， 升温时间 3 6 小时， 最后保温干燥 30 90 分钟， 压。

22、全盖， 成品完成。 本发明中， 经过摸索采用了梯度升温方法， 该方法更适合于小牛血去蛋白提取物 的冻干干燥， 可以更彻底的去除水分， 所得产品形态饱满细腻， 色泽均匀， 结构牢固， 溶解速 度快， 残余水分低， 生物活性基本不变。 0025 一种含有前面所述的小牛血去蛋白提取物的注射用冻干粉， 所述注射用冻干粉 制备步骤包含 ： 称取小牛血去蛋白提取物溶液， 加入甘露醇或右旋糖酐， 搅拌溶解， 加入注 射用水至规定体积， 分别用 0.45m、 0.22m 超滤膜过滤除菌， 按 400mg/ 支或 800mg/ 支 规格灌装， 压半盖， -50 -40下预冻 3 小时， 然后抽真空， 真空度 5。

23、 7 帕， 缓慢升温 至-10， 升温时间12小时， 保持-10真空干燥4小时， 再缓慢升温至10， 升温时间6小 时， 再升温至2532干燥， 升温时间5小时， 最后保温干燥5080分钟， 压全盖， 成品完 成。 0026 一种含有前面所述的小牛血去蛋白提取物的注射用冻干粉， 所述注射用冻干粉制 备步骤更具体为 ： 将 4000g 小牛血去蛋白提取物， 加入 30 1500g 甘露醇， 搅拌溶解， 加入 30000ml 注射用水， 分别用 0.45m、 0.22m 超滤膜过滤除菌， 按 400mg/ 支或 800mg/ 支 规格灌装， 压半盖， -50 -40下预冻 3 小时， 然后抽真空，。

24、 真空度 5 7 帕， 缓慢升温 至-10， 升温时间12小时， 保持-10真空干燥4小时， 再缓慢升温至10， 升温时间6小 时， 再升温至2532干燥， 升温时间5小时， 最后保温干燥5080分钟， 压全盖， 成品完 成。 0027 本发明提供的小牛血去蛋白提取物及其制备方法优点在于 ： 0028 (1)本发明提供的小牛血去蛋白提取液中每毫升含有游离氨基酸11.5mg， 总固 体含量 160 170mg， pH6.5 7.5， 呼吸活力为 8 10lO2/(mgh)， 刺激指数 4 5。 0029 (2) 本发明过程简便易行， 将水解和活性炭脱色两步操作合并为一步进行， 提高了 生产效率 。

25、； 本发明同样避免了复杂繁琐的柱层析技术， 所使用各种材料均为廉价易得的工 说 明 书 CN 101433553 B4/9 页 6 业产品， 便于工业化生产， 能够安全有效的生产出更强活性的小牛血去蛋白提取物。 0030 (3) 现有技术中单一的通过醇沉或加热、 水解去除蛋白方法效率低下， 得到产品往 往杂质多， 质量差， 影响了临床用药效果。 本发明通过加热、 醇沉、 酸水解的联合应用保证了 对蛋白的彻底消除， 提高了产品质量。 廉价无机酸的应用避免了昂贵的水解酶， 同时减少了 对有效活性成分的破坏并提高了蛋白去除效果。 0031 (4) 牛血中含有多种致病菌， 严重危害着患者用药安全。现有。

26、技术中要么步骤 (2) 中比其他现有技术更高温度的应用， 确保了对产品中各种致病细菌的灭活， 保证了患者的 用药安全。同时该温度范围又不会对血清中的有效成分造成影响。 0032 (5) 步骤 (6) 中运用低温冷冻方法， 使得经过醇沉、 加热、 水解后残存的蛋白和其 他杂质在低温中析出， 更进一步提高了产品质量， 同时低温不会对产品的有效成分造成破 坏。 0033 (6) 冻干干燥过程采取梯度升温过程， 更有效的除去吸附水和结合水， 且不对提取 物有效成份造成破坏， 附图说明 0034 图 1 为小牛血去蛋白提取物制备工艺流程图 0035 图 2 为小牛血去蛋白提取物冻干粉制备工艺流程图 具体。

27、实施方式 0036 下面的实施例将对本发明作更具体的解释， 但本发明并不仅仅局限于这些实施 例， 同样这些实施例也不以任何方式限制本发明。 0037 实施例 1 0038 小牛血采集 0039 经检验健康的 1.5 岁以下小牛的血， 用搅拌器以 150 转 / 分钟搅拌 20 分钟， 去 除血浆纤维蛋白原， 然后用离心机以 800 转 / 分钟离心 30 分钟， 取上清液， 倒入清洁的桶 内， -40速冻后于 -20冷藏备用。 0040 提取 0041 将冷藏小牛血清取出， 室温融化后放入减压浓缩罐， 加热至 60使蛋白质凝固、 变 性， 过滤， 滤液加热至70， 减压浓缩至原体积1/4， 冷。

28、却至室温， 加入5倍体积55乙醇， 醇 沉 30 小时， 过滤， 回收乙醇， 得到半成品。 0042 脱色、 除冷蛋白 0043 取上步产品放入水解罐， 加入HCl至PH为3.5， 加热至70， 用10活性炭脱色50 分钟， 过滤， 滤液放入罐中， 用 NaOH 调节 PH 为 6.9， 水冷却， 取样检测， 总固体含量 130mg/ ml， -80冷冻 24 小时， 解冻， 过滤， 滤液再冷冻 24 小时， 反复 3 次。 0044 分子量筛选、 细菌内毒素去除、 除高分子物质 0045 顺序使用 30000、 10000、 5000 道尔顿分子量的中空纤维膜超滤， 得到精制小牛血 去蛋白提。

29、取物， 检测， 总固体含量 140mg/ml， -20冷冻备用。 0046 实施例 2 0047 小牛血采集 说 明 书 CN 101433553 B5/9 页 7 0048 经检验健康的 1.5 岁以下小牛的血， 用搅拌器以 100 转 / 分钟速度搅拌 6 分钟， 去 除血浆纤维蛋白原， 然后用离心机以 2000 转 / 分钟速度离心 30 分钟， 取上清液， 倒入清洁 的桶内， -40速冻后于 -20冷藏备用。 0049 提取 0050 将冷藏小牛血清取出， 室温融化后放入减压浓缩罐， 加热至 70使蛋白质凝固、 变 性， 过滤， 滤液加热至 80， 减压浓缩至原体积 1/8， 冷却至室。

30、温， 加入 2 倍 70乙醇， 醇沉 24 小时， 过滤， 回收乙醇， 得到半成品。 0051 脱色、 除冷蛋白 0052 取上步产品放入水解罐， 加入 HCl 至 PH 为 6.5， 加热至 60， 用 5活性炭脱色 15 分钟， 过滤， 滤液放入罐中， 用 NaOH 调节 PH 为 8.0， 水冷却， 取样检测， 总固体含量 130mg/ ml， -20冷冻 24 小时， 解冻， 过滤， 滤液再冷冻 24 小时， 反复 5 次。 0053 分子量筛选、 细菌内毒素去除、 除高分子物质 0054 顺序使用 30000、 10000、 5000 道尔顿分子量的中空纤维膜超滤， 得到精制小牛血 。

31、去蛋白提取物， 检测， 总固体含量 140mg/ml， -20冷冻备用。 0055 实施例 3 0056 小牛血采集 0057 经检验健康的 1.5 岁以下小牛的血， 用搅拌器以 60 转 / 分钟进行搅拌， 搅拌 12 分 钟， 去除血浆纤维蛋白原， 然后用离心机以 1500 转 / 分钟离心 30 分钟， 取上清液， 倒入清洁 的桶内， -40速冻后于 -20冷藏备用。 0058 提取 0059 将冷藏小牛血清取出， 室温融化后放入减压浓缩罐， 加热至 90使蛋白质凝固、 变 性， 过滤， 滤液加热至90， 减压浓缩至原体积1/11， 冷却至室温， 加入94乙醇10倍， 醇沉 68 小时，。

32、 过滤， 回收乙醇， 得到半成品。 0060 脱色、 除冷蛋白 0061 取上步产品放入水解罐， 加入 HCl 至 PH 为 5.5， 加热至 90， 用 1活性炭脱色 30 分钟， 过滤， 滤液放入罐中， 用 NaOH 调节 PH 为 8.0， 水冷却， 取样检测， 总固体含量 130mg/ ml， -45冷冻 24 小时， 解冻， 过滤， 滤液再冷冻 24 小时， 反复 2 次。 0062 分子量筛选、 细菌内毒素去除、 除高分子物质 0063 顺序使用 30000、 10000、 5000 道尔顿分子量的中空纤维膜超滤， 得到精制小牛血 去蛋白提取物， 检测， 总固体含量 140mg/m。

33、l， -20冷冻备用。 0064 本发明实施例所得产品参数见表 1 0065 表 1. 三批小牛血去蛋白提取物参数 0066 批号 实施例 1 实施例 2 实施例 3 性状 浅黄色澄明液体 浅黄色澄明液体 浅黄色澄明液体 相对密度 1.0249 1.0250 1.0253 说 明 书 CN 101433553 B6/9 页 8 呼吸活性 10.0782 8.4266 9.5882 刺激指数 4.7017 3.1345 3.0682 游离氨基酸 (mg/ml) 1.15 1.19 1.35 PH 7.2 7.0 7.0 吸收度 0.06 0.07 0.06 高分子物质 未检出 未检出 未检出 总。

34、固体 (mg/ml) 167.9 169.0 164.0 过敏试验 符合规定 符合规定 符合规定 细菌内毒素 符合规定 符合规定 符合规定 0067 实施例 4 0068 将 4000g 小牛血去蛋白提取物， 加入 30g 甘露醇， 搅拌溶解， 加入 30000ml 注射 用水， 分别用 0.45m 和 0.22m 超滤膜超滤， 按 400mg/ 支规格灌装， 压半盖， 放入冻干 柜， -60预冻2小时， 抽真空， 真空度9帕， 缓慢升温至-10， 升温时间16小时， 保持-10 真空干燥 6 小时， 再缓慢升温至 10， 升温时间 8 小时， 再升温至 20， 升温时间 3 小时， 最 后保。

35、持 20真空干燥 90 分钟， 压全盖， 成品完成。 0069 实施例 5 0070 将 4000g 小牛血去蛋白提取物， 加入 150g 甘露醇， 搅拌溶解， 加入 30000ml 注射 用水， 分别用 0.45m 和 0.22m 超滤膜超滤， 按 400mg/ 支规格灌装， 压半盖， 放入冻干 柜， -45预冻3小时， 抽真空， 真空度6帕， 缓慢升温至-10， 升温时间12小时， 保持-10 真空干燥 4 小时， 再缓慢升温至 10， 升温时间 6 小时， 再升温至 29， 升温时间 5 小时， 最 后保持 29真空干燥 65 分钟， 压全盖， 成品完成。 0071 实施例 6 0072。

36、 将 4000g 小牛血去蛋白提取物， 加入 300g 甘露醇， 搅拌溶解， 加入 30000ml 注射 用水， 分别用 0.45m 和 0.22m 超滤膜超滤， 按 400mg/ 支规格灌装， 压半盖， 放入冻干 柜， -30预冻 5 小时， 抽真空， 真空度 3 帕， 缓慢升温至 -10， 升温时间 8 小时， 保持 -10 真空干燥 2 小时， 再缓慢升温至 10， 升温时间 4 小时， 再升温至 35， 升温时间 6 小时， 最 后保持 35真空干燥 30 分钟， 压全盖， 成品完成。 0073 实施例 7 0074 将 4000g 小牛血去蛋白提取物， 加入 900g 甘露醇， 搅拌。

37、溶解， 加入 30000ml 注射 用水， 分别用 0.45m 和 0.22m 超滤膜超滤， 按 400mg/ 支规格灌装， 压半盖， 放入冻干 柜， -50预冻3小时， 抽真空， 真空度7帕， 缓慢升温至-10， 升温时间12小时， 保持-10 真空干燥 4 小时， 再缓慢升温至 10， 升温时间 6 小时， 再升温至 25， 升温时间 5 小时， 最 后保持 25真空干燥 80 分钟， 压全盖， 成品完成。 说 明 书 CN 101433553 B7/9 页 9 0075 实施例 8 0076 将 4000g 小牛血去蛋白提取物， 加入 1500g 甘露醇， 搅拌溶解， 加入 30000m。

38、l 注射 用水， 分别用 0.45m 和 0.22m 超滤膜超滤， 按 400mg/ 支规格灌装， 压半盖， 放入冻干 柜， -40预冻3小时， 抽真空， 真空度5帕， 缓慢升温至-10， 升温时间12小时， 保持-10 真空干燥 4 小时， 再缓慢升温至 10， 升温时间 6 小时， 再升温至 32， 升温时间 5 小时， 最 后保持 32真空干燥 50 分钟， 压全盖， 成品完成。 0077 试验例 1 0078 小牛血去蛋白提取物呼吸活性测定 ： 0079 本法系用瓦氏呼吸检压仪测定豚鼠肝匀浆的呼吸活力， 从测得的耗氧量计算出呼 吸活力 QO2IO2/(mgh) 和刺激指数 (SI)。 。

39、0080 仪器 ： 瓦氏呼吸检压仪， 匀浆器， 定时器。 0081 试剂 ： 0082 10氢氧化钠溶液 ： 取氢氧化钠 10g， 加水溶解并稀释至 100ml。 0083 Soerensen 缓冲液 (PH 7.4) ： 取磷酸氢二钠 (Na2HPO4)9.72g 和磷酸二氢钾 1.65g， 加水溶解并稀释至 1000ml。 0084 Brodie 测压液 ： 取氯化钠 23g， 牛胆酸钠 5g， 伊文氏兰 100mg， 加水溶解并稀释至 500ml。相对密度为 1.033g/ml。 0085 肝匀浆液 ： 取体重 200 300g 的雄性豚鼠一只， 颈部打击处死 ( 处死前需禁食至 少 2。

40、4 小时 )， 立即切断颈动脉放血， 打开腹腔取出肝脏， 置冰水浴中的 Soerensen 缓冲液中 ( 注意 ： 不得损伤胆囊或胆管 )。称取 5.5g 的肝脏， 并切割为大小相同的 7 块， 每块用 7ml 的 Soerensen 缓冲液匀浆 ( 注意 ： 以上操作必须在冰水浴中进行 )。 0086 测定法 ： 0087 (1) 预先把测压计反应瓶洗净并干燥， 备用。 0088 (2) 装好测压液于测压管内， 调节液面至 150mm。 0089 (3) 反应瓶中先加入 Soerensen 缓冲液 1.1ml， 加供试品小牛血去蛋白提取物 0.2ml， 然后加肝匀浆液 1.0ml。 0090。

41、 (4) 加 10氢氧化钠溶液 0.2ml 于具一小滤纸条的反应瓶中间小杯。 0091 (5) 由于肝匀浆本身有耗氧作用， 故实验时以 Soerensen 缓冲液 0.2ml 代替供试 品， 其余试剂同样品管， 作为空白管。 0092 (6) 将装好的反应瓶按管号与测压计相连 ( 注意密闭， 勿使漏气 )， 置 37恒温水 浴中。 0093 (7) 开动振荡器振摇 10 分钟 (75 次 / 分 ) 使反应瓶内外温度一致。将测压计右侧 柱液面调至150mm， 记下左侧液面初读数(A)， 然后关闭三向活塞， 开始计时， 反应30分钟记 后将测压计右侧柱液面再调至 150mm， 记下左侧液面初读数。

42、 (B)。 0094 打开三向活塞， 重复上述过程， 进行下一个 30 分钟的反应并记下左侧液面初读数 (C) 及 30 分钟后的液面读数 (D)。 0095 (8) 实验过程中必须附加一套供校正用的温压计， 在反应瓶中加 2.5ml 的 Soerensen 缓冲液， 使其在与试验管完全相同的条件下试验， 观察其压力的变化 (C)， 以 消除试验过程中温度及大气压的影响。 说 明 书 CN 101433553 B8/9 页 10 0096 (9) 取 2.0ml 肝匀浆， 置恒重的装有海沙的称量瓶中， 110干燥至恒重， 计算两次 的重量差异 W(mg)。 0097 按下式计算 ： QO2IO。

43、2/(mgh) (A-B+C-D)K1-CK2/GI 0098 式中 ： 0099 K1- 空白或样品的反应瓶常数 ； 0100 K2- 温压计的反应瓶常数 ； 0101 G- 每 1ml 肝匀浆的干重， mgG W/2-9.2， 9.3 为 Soerensen 缓冲液的干重， mg ； I- 反应时间， 小时。 0102 刺激指数 (SI) 供试品 QO2/ 空白 QO2 0103 试验结果应满足以下条件， 否则无效 ： 0104 1. 对照品的 QO2 4.0lO2/(mgh)， 并且 SI QO2； 0105 2. 空白的 QO2 1.0lO2/(mgh)。 0106 实验结果见表 1 。

44、0107 试验例 2 0108 小牛血去蛋白提取物过敏试验 ： 0109 本法系将一定剂量的供试品小牛血去蛋白提取物溶液注入豚鼠腹腔和静脉， 在规 定的时间内观察动物的过敏反应情况， 以判断供试品是否符合规定的一种方法。 0110 供试动物 ： 健康豚鼠， 雌雄均可， 体重 250 350g， 试验前及试验的观察期内， 均应 按正常饲养条件饲养， 做过本试验的动物不得重复使用。 0111 供试溶液的配制 ： 除另有规定外， 用氯化钠注射液按各药品项下规定浓度制成供 试品溶液。 0112 检查法 ： 取上述豚鼠 6 只， 间日腹腔注射供试品溶液 0.5ml， 连续 3 次， 然后分成两 组， 每。

45、组 3 只， 分别在第一次注射后第 14 日及第 21 日静脉注射供试品溶液 1.0ml。 0113 结果判断 ： 静脉注射后 15 分钟内均不得出现过敏性反应， 如有竖毛、 呼吸困难、 喷 嚏、 干呕或咳嗽 3 声等现象中的两种以上者 ； 或罗音、 抽搐、 虚脱或死亡现象之一者应判为 阳性。 0114 取本品， 用0.9无菌氯化钠稀释成每1ml中含有总固体40mg的供试溶液， 依法测 定， 应符合规定。 0115 实验结果见表 1。 0116 试验例 3 0117 小牛血去蛋白提取物中游离氨基酸含量测定 ： 0118 取本品及标准氨基酸适量， 用氨基酸分析仪进行氨基酸分析， 其游离氨基酸含量。

46、 应为每 400mg 中含 8.0 12.0mg。具体实验结果见表 1 0119 试验例 4 0120 小牛血去蛋白提取物中总固体含量测定 ： 0121 精密量取本品 1g， 置称量瓶中在 (532)下真空干燥至恒重 ( 中国药典 2000 年 版二部附录 VIIIL)， 计算， 所得结果减去赋形剂量， 赋形剂检测方法见药典附录三。 0122 具体实验结果见表 1。 0123 试验例 5 说 明 书 CN 101433553 B9/9 页 11 0124 小牛血去蛋白提取物中高分子物质测定 ： 0125 照高效液相色谱法 ( 中国药典 2000 年版二部附录 VD) 测定。用凝胶色谱 柱 ( 。

47、如 ： Pharmarcia Superdex Peptide 或 TSK-s2000swxl 柱 )， 乙 腈 - 三 氟 醋 酸 - 水 (40 0.1 60) 为流动相， 检测波长为 214nm。 0126 对照品溶液制备 ： 称取胰岛素 ( 分子量 5800) 适量， 加流动相制成每 1ml 中含 2.5mg 的溶液， 作为对照品溶液。 0127 测定法 ： 取对照溶液及供试品溶液(本品加水制成每1ml中含有总固体40mg的供 试溶液)各201分别注入液相色谱仪， 记录色谱图， 将先于胰岛素峰保留时间的峰视为高 分子量物质， 按面积归一化法计算， 含高分子量物质的量不得过 2.0。具体实验结果见表 1。 0128 试验例 6 0129 小牛血去蛋白提取物中细菌内毒素测定 ： 0130 取本品， 依法检查 ( 中国药典 2000 年版二部附录 XIE)， 每 1mg 中含细菌内毒素应 小于 0.025EU)， 具体实验结果见表 1。 说 明 书 CN 101433553 B1/1 页 12 说 明 书 附 图 。