PLGA材料在ADSCS为基础的组织工程肝单元构建中的应用.pdf

《PLGA材料在ADSCS为基础的组织工程肝单元构建中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PLGA材料在ADSCS为基础的组织工程肝单元构建中的应用.pdf（10页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 101422631 B (45)授权公告日 2012.10.03 CN 101422631 B *CN101422631B* (21)申请号 200810227671.6 (22)申请日 2008.11.28 A61L 27/38(2006.01) A61L 27/18(2006.01) A61F 2/02(2006.01) (73)专利权人 中国人民解放军军事医学科学院 野战输血研究所 地址 100850 北京市海淀区太平路 27 号 (72)发明人 裴雪涛 王敏 裴海云 师伟 管利东 (74)专利代理机构 北京尚诚知识产权代理有限 公司 11322 代理人 邸万杰。

2、 (54) 发明名称 PLGA 材料在 ADSCs 为基础的组织工程肝单元 构建中的应用 (57) 摘要 本发明公开了 PLGA 材料在 ADSCs 为基础的 组织工程肝单元构建中的应用。所述应用是将 ADSCs 接种到 PLGA 材料表面向肝细胞进行诱导。 形态学观察、 基因和蛋白水平和功能检测等结果 表明 PLGA 支架支持 ADSCs 的粘附、 增殖和向肝细 胞的分化。本发明提供了一种用于 ADSCs 为基础 的组织工程肝单元构建的支架材料， 应用前景广 阔。 (51)Int.Cl. 审查员 徐靖 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。

3、12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 1/1 页 2 1.PLGA 作为支架材料在 ADSCs 为基础的组织工程肝单元构建中的应用， 其特征在于 ： 将脂肪来源干细胞 ADSCs 接种到 PLGA 材料表面向肝细胞诱导 ； 其中 ： 所述脂肪来源干细胞在接种前进行传代培养， 传代次数为 4-7 代 ； 脂肪来源干细胞的 接种密度为 1105-3105个 /24 孔或 3104-5104个 /96 孔 ； 所述 PLGA 材料的孔径范围为 30-50m， 厚度为 1-2mm ； 接种前， 将 PLGA 材料细胞先用 70乙醇将其消毒 1 小时， 再用 PBS 清洗后，。

4、 用含 10 FBS 的 DMEM 培养基浸泡 12-24 小时。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述诱导条件为 ： 用肝细胞诱导液在 37、 5 CO2下诱导 14-21 天 ； 用于体外诱导脂肪来源干细胞分化为肝细胞的专用诱导 液， 是在 DMEM 培养基的基础上添加了 10 FBS， 0.1mol/L 地塞米松， 1ITS， 20-40ng/mL bFGF， 30-50ng/mL HGF 和 20-40ng/mL FGF-4。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于 ： 在诱导期间每星期换液 2-3 次。 4. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于。

5、 ： 所述诱导时间为 14 天。 权 利 要 求 书 CN 101422631 B 2 1/5 页 3 PLGA 材料在 ADSCs 为基础的组织工程肝单元构建中的应用 技术领域 0001 本发明涉及PLGA材料的新用途， 即可作为ADSCs为基础的组织工程肝单元构建的 支架材料。 背景技术 0002 与 骨 髓 相 似， 脂 肪 组 织 也 存 在 多 能 干 细 胞， 称 为 脂 肪 来 源 的 干 细 胞 (adipose-derived stem cells， ADSCs)。 ADSCs能够分化成软骨细胞、 成骨细胞、 脂肪细胞、 心肌细胞和神经细胞等多种细胞， 并且在组织工程中应用广。

6、泛。相对于其它干细胞， ADSCs 作为组织工程的细胞来源有很多优势， 如自体治疗时， 从病人获取 ADSCs 创伤小， 且自体 ADSCs不存在移植排斥问题。 此外， 由于ADSCs易大量获得， 且体外扩增迅速， 因而很容易达 到临床需要的细胞数量。 0003 最近， 有文献报道 ADSCs 能够分化成肝细胞。尽管这方面的研究还比较少， 且仅限 于二维环境， 但这些研究提示 ADSCs 有可能成为肝组织工程的另一种细胞来源。三维系统 或支架是组织工程的重要组成部分之一， 不仅为细胞提供载体， 还对细胞的生长和分化产 生重要影响。但是由于人们对 ADSCs 向肝细胞分化这一领域的研究比较晚且进。

7、展缓慢， 目 前关于 ADSCs 在任何三维支架上向肝细胞分化的研究还未见报道。 0004 支架材料有多种， 主要分为天然材料和人工合成多聚体材料。其中 PLGA( 聚乳 酸-羟基乙酸)已通过美国FDA认证， 是目前组织工程中常用的一类人工合成材料。 虽然这 种材料的生物相容性不如天然材料， 但具有力学性能好、 可加工性能较好以及降解周期调 节范围大等优点。 另外， 有研究报道PLGA材料体外可支持ADSCs向成骨细胞分化(Biochem Biophys Res Commun.2008Epub ahead of print.Osteogenicdifferentiation of human 。

8、adipose tissue-derived stromal cells(hASCs)in aporous three-dimensional scaffold.Lee JH， Rhie JW， Oh DY， Ahn ST.)， 提示 PLGA 材料与 ADSCs 有很好的生物相容 性。 因此， 本发明选择PLGA作为支架材料来研究ADSCs在三维系统上肝细胞的分化。 此外， 需要说明的是 ADSCs 向肝细胞分化是不同于向成骨细胞分化的过程， 而支架材料对同一种 细胞向不同细胞分化的影响是不同的， 因此研究PLGA材料体外是否还能支持ADSCs向肝细 胞分化是有必要的。 发明内容 0005 。

9、本发明的目的是提供PLGA材料的一种新用途， 即可作为ADSCs为基础的组织工程 肝单元构建的支架材料。 0006 具体来讲， 所述应用是将 ADSCs 接种到 PLGA 材料表面体外向肝细胞诱导， 体外构 建能够代偿受损肝脏功能的人工肝单元。 0007 所述 ADSCs 在接种前可进行传代培养， 传代次数优选为 4-7 代 ； 接种密度优选为 1105-3105个 /24 孔或 3104-5104个 /96 孔。 0008 所述多孔 PLGA 膜状支架材料的来源是多种多样的， 如从商业途径购买或采用 说 明 书 CN 101422631 B 3 2/5 页 4 NaCl 颗粒致孔 / 浸出法。

10、制备 (P.A.Zuk， M.Zhu， P.Ashjian， D.A.De Ugarte， J.I.Huang， H.Mizuno， Z.C.Alfonso， J.K.Fraser， P.Benhaim， M.H.Hedrick， Humanadipose tissue is a source of multipotent stem cells， Mol.Biol.Cell.13(2002)4279-4295.) 等。所述 PLGA 支架材料的孔径范围可为 30-50m， 厚度可为 1-2mm。细胞接种前可先用 70乙醇消 毒将其消毒 1 小时， 再用 PBS(pH7.0-7.2) 清洗后， 。

11、用含 10 (V/V)FBS 的 DMEM 培养基浸泡 12-24 小时。 0009 所述诱导条件可为 ： 用肝细胞诱导液在 37、 5 CO2下诱导 14-21 天 ； 用于体外 诱导脂肪来源干细胞分化为肝细胞的专用诱导液， 是在 DMEM 培养基的基础上添加了 10 (V/V)FBS， 0.1mol/L 地 塞 米 松， 1ITS， 20-40ng/mL bFGF， 30-50ng/mLHGF 和 20-40ng/ mL FGF-4。所述肝细胞诱导液中 bFGF 的浓度优选为 30ng/mL， HGF 的浓度优选为 40ng/mL， FGF-4 的浓度优选为 30ng/mL。所述诱导时间优。

12、选为 14 天。 0010 为获得更好的诱导效果， 在诱导期间可每星期换液 2-3 次。 0011 用上述方法诱导 hADSCs 分化为的组织工程肝单元也属于本发明的保护范围。 0012 本发明提供了 PLGA 材料的一种新用途， 即可作为 ADSCs 为基础的组织工程肝单 元构建的支架材料。形态学观察、 基因和蛋白水平和功能检测等结果表明 PLGA 支架支持 ADSCs的粘附、 增殖和向肝细胞的分化。 本发明提供了一种用于ADSCs为基础的组织工程肝 单元构建的支架材料， 应用前景广阔。 0013 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 附图说明 0014 图 1 为 hADSCs 在。

13、 PLGA 支架表面诱导 5 天时的 DAPI 染色结果 0015 图 2 为 hADSCs 在 PLGA 支架表面诱导过程细胞增殖情况的 CCK8 法检测结果 0016 图 3 为 hADSCs 在 PLGA 支架表面诱导过程中细胞和支架形态的扫描电镜观察结果 0017 图 4 为 hADSCs 在 PLGA 支架表面诱导过程中肝特异性基因表达的 RT-PCR 结果 0018 图 5 为 hADSCs 在 PLGA 支架表面诱导过程中 ALB 和 AFP 表达情况的免疫组化结果 0019 图 6 为 hADSCs 在 PLGA 支架表面诱导过程中 A1b 的分泌情况 具体实施方式 0020 。

14、下述实施例中所用方法如无特别均为常规方法， 所用引物均由上海英俊合成， 所 述百分比浓度均为质量 / 体积 (W/V) 百分比浓度或体积 / 体积 (V/V) 百分比浓度。 0021 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达 到具体公开的目的， 不应成为对本发明生物材料来源的限制。 事实上， 所用到的生物材料的 来源是广泛的， 任何不违反法律和道德伦理能够获取的同类生物材料都可以按照实施例中 的提示替换使用 ； 在产业实施中， 来源于大鼠、 小鼠、 猪或人等哺乳动物的各种细胞或组织、 废弃物均为离体的， 并包括从生物材料库、 细胞库中取得、 或商业购买获得， 还包括。

15、按照已 有文献的介绍制备获得。 0022 本发明实施例中所用脂肪， 来源于取吸脂术中吸出并弃离的脂肪， 脂肪的获取均 经过供者的知情同意， 并通过提供脂肪的医院伦理委员会批准。实施例只是利用这些已有 的脂肪获得脂肪来源的干细胞， 脂肪本身的获取途径不构成对本发明的限制。 说 明 书 CN 101422631 B 4 3/5 页 5 0023 实施例 1、 体外在 PLGA 支架表面诱导 ADSCs 分化为肝细胞 0024 用本发明的方法体外诱导 ADSCs( 以 hADSCs 为例 ) 分化为肝细胞， 包括以下步骤 ： 0025 一、 hADSCs 的分离培养 0026 取吸脂术中吸出并弃离的。

16、脂肪， 用等体积的 PBS(pH7.0-7.2) 缓冲液反复冲洗 以去除血细胞和麻醉剂。 0027 用含 0.075 (V/V) 胶原酶的 PBS(pH7.0-7.2) 在 37下消化 40min， 消化期间 需轻轻振荡以释放细胞间连接。 0028 用等体积含10(V/V)胎牛血清(购自HyClone公司)的低糖DMEM(购自Gibco 公司 ) 中和胶原酶。 0029 用 200 目筛网过滤后 1500rpm 离心 5min， 弃上清。 0030 将细胞沉淀用 160mM NH4Cl 溶解红细胞， 1500rpm 离心 5min 后弃上清。 0031 用含 10 (V/V)FBS 的低糖 D。

17、MEM 悬浮， 再以 1-5106个 /75cm2密度接种， 每星 期换液 2 次。 0032 细胞培养至 80融合时， 用 0.25胰蛋白酶消化传代。传到第 3 代时收集细胞 冻存至液氮保存备用。 0033 二、 多孔 PLGA 膜状支架的制备 0034 采 用 NaCl 颗 粒 致 孔 / 浸 出 法 (P.A.Zuk， M.Zhu， P.Ashjian， D.A.De Ugarte， J.I.Huang， H.Mizuno， Z.C.Alfonso， J.K.Fraser， P.Benhaim， M.H.Hedrick， Human adipose tissue is a source 。

18、of multipotent stem cells， Mol.Biol.Cell.13(2002)4279-4295.) 制备多孔 PLGA 膜状支架。该支架的孔径范围为 30-50m， 厚度为 2mm， PLGA 多聚体浓度为 10， NaCl 颗粒比例为 75。使用时， 将 PLGA 支架剪成 96 孔或 24 孔大小。细胞接种前用 70乙醇消毒 1 小时， PBS 洗 3 遍 ( 每遍 3min) 后， 用含 10 FBS 的 DMEM 培养基浸泡 12-24 小时。 0035 三、 hADSCs 在多孔 PLGA 膜状材料上向肝细胞的诱导分化 0036 肝细胞诱导液 ： 在 DMEM 。

19、培养基的基础上添加了 10 (V/V)FBS， 0.1mol/L 地塞 米松， 1ITS， 20-40ng/mL bFGF， 30-50ng/mL HGF 和 20-40ng/mL FGF-4。 0037 将 4-7 代的 hADSCs 以 2105个 /24 孔 (1105-3105个 /24 孔均可 ) 或 4104 个 /96 孔 (3104-5104个 /96 孔均可 ) 密度接种到 PLGA 材料表面， 在 37、 5 CO2下用 肝细胞诱导液诱导 2 星期 (14-21 天均可 )， 每星期换液 2 次 (2-3 次均可 )。 0038 实施例 2、 分化肝细胞的鉴定 0039 用。

20、下述方法对实施例 1 诱导分化的细胞进行鉴定 ： 0040 一、 DAPI 染色 0041 为了评价细胞在整个材料的分布情况， 将实施例1中接种有hADSCs并用肝细胞诱 导液诱导5天的PLGA支架制备成冰冻切片， 然后用DNA特异性荧光燃料DAPI染色。 hADSCs 在 PLGA 支架表面诱导 5 天时的 DAPI 染色结果如图 1 所示 (20)， hADSCs 在 PLGA 支架内 均匀分布， 且与支架整合在一起， 表明 PLGA 支架体外能很好的支持 hADSCs 粘附。 0042 二、 CCK8 法检测 0043 用 CCK8 法评价 hADSCs 向肝细胞诱导过程中的细胞生长情况。

21、， 方法为 ： 将实施例 1 中在诱导第 1、 3、 5、 7、 14 和 21 天分别添加 10l CCK8 到 100l 培养液中， 在 37下孵育 说 明 书 CN 101422631 B 5 4/5 页 6 4 小时， 然后用酶联仪在 450nm 波长处读取吸光值。结果如图 2 所示 ( 数值用 meanSD 表 示， n 3)， 诱导前 14 天细胞增殖迅速， 随后 7 天增殖速度明显下降。 0044 三、 扫描电镜形态检测 0045 用扫描电镜观察诱导细胞和支架的形态， 以及细胞在支架表面的粘附和生长情 况， 方法为 ： 将实施例 1 中未接种 hADSCs 的 PLGA 空材料和。

22、接种 hADSCs 并用肝细胞诱导液 诱导的 PLGA 材料用 3戊二醛固定， 然后将样品表面在真空环境下镀金， 再用扫描电镜获 取图像。结果如图 3 所示 ( 标尺为 150m)， PLGA 支架由很多均匀分布的孔组成， 且孔和孔 之间互相贯通 ( 见图 3 中的图 A) ； 诱导后 3 天后， 可见 hADSCs 粘附到细胞表面， 并且渗透 到支架孔内 ( 见图 3 中的图 B) ； 细胞外基质的合成随诱导时间的延长逐渐增多， 诱导 5 天 明显多于诱导 3 天 ( 见图 3 中的图 C) ； 诱导 7 天时， hADSCs 在 PLGA 支架表面已融合成细胞 层， 并且已看不到细胞支架 。

23、( 见图 3 中的图 D) ； 诱导 14 天时许多梭形细胞出现， 在细胞单 层上面伸出很多连接细胞的细胞突触， 且 hADSCs 增殖分化成三维组织样结构 ( 见图 3 中的 图 E)。 0046 四、 RT-PCR 检测 0047 为进一步探讨 hADSCs 在 PLGA 支架表面向肝细胞的分化能力， 将实施例 1 中接种 hADSCs并用肝细胞诱导液诱导的PLGA支架收到1.5mL EP管中， 加入1mL Trizol， 然后用旋 涡混匀器振荡以彻底释放 RNA， 再将 RNA 用寡核苷酸引物反转录出 cDNA， 最后以 cDNA 为模 板， 在表 1 所示引物的引导下用 RT-PCR 。

24、的方法检测肝细胞标志物 A1b、 AFP、 CK18、 CYP 1B1 在基因水平的表达情况， 以 -actin 为内参， PCR 反应条件为 ： 94 30s， 60 30s， 72 30s， 35 个循环。检测结果如图 4 所示 (A)hADSCs 在 PLGA 支架表面诱导 0、 7 和 14 天时肝 特异性基因的表达情况。泳道 1-5 分别表示 Alb， AFP， CK18， CYP1B1， -actin 的表达情 况。(B) 用图像分析系统进行半定量分析。结果用相对于 -actin 的比值表示。t-Test ： *p0.05 ； *p0.001(n 3)， 诱导 7 天时 hADSC。

25、s 已开始表达一些肝细胞特异性基因 AFP、 CYP 1B1 和微量 ALB， 半定量分析结果表明诱导 14 天时 ALB 和 AFP 基因的表达水平均显著 升高， 而 CYP1B1 的表达水平有所下降。CK18 是一种上皮细胞表面标志， 包括肝细胞在内的 多种细胞均呈阳性表达。结果发现未诱导的 hADSCs CK18 基因呈阳性表达， 说明其中含有 上皮样细胞 ； 诱导 7 天和 14 天后 CK18 基因的表达水平均比未诱导 hADSCs 显著升高， 诱导 14 天同诱导 7 天相比 CK18 基因的表达水平有轻度升高， 但未达到统计学意义。 0048 表 1PCR 引物序列 0049 说。

26、 明 书 CN 101422631 B 6 5/5 页 7 0050 五、 免疫组化检测 ALB 和 AFP 的表达情况 0051 用免疫组化方法检测 ALB 和 AFP 的表达情况， 方法为 ： 将接种 hADSCs 并用肝细胞 诱导液诱导 14 天的 PLGA 支架用 OCT 包埋， 然后制备成 8m 厚的冰冻切片 ； 然后将样品用 冷丙酮固定 10min， PBS 洗 3 遍， 再用 3 H2O2处理以去除内源性过氧化物酶， 接着用 5 BSA 封闭 30min， 去掉封闭液后直接加入抗 ALB 和 AFP 抗体 ( 分别购自 Sigma， USA 和 R&D Systems， Inc.。

27、)， 4孵育过夜 (10-12 小时 )， PBS 洗 3 遍， 然后加入相应二抗 ( 购自北京中 山金桥生物技术有限公司 )37孵育 25min， PBS 洗 3 遍 ； 最后加底物 AEC 显色， 然后用苏木 素衬染。免疫组化检测结果如图 5 所示 (A)Alb 的表达。hADSCs 诱导前 ( 左 ) 和 hADSCs 诱导 14 天 ( 右 )(20)。(B)AFP 的表达。hADSCs 诱导前 ( 左 ) 和 hADSCs 诱导 14 天 ( 右 ) (20)。)， 诱导 14 天后 hADSCs 阳性表达 ALB 和 AFP 蛋白， 而未诱导 hADSCs 呈阴性表达， 表明诱导细。

28、胞可表达肝细胞标志蛋白。 0052 六、 ALB 的分泌情况 0053 白蛋白分泌是成熟肝细胞典型的功能之一， 为了确定这些具有肝细胞特异性表型 的肝细胞样细胞是否具有成熟肝细胞的功能， 用 ELISA 法检测了诱导过程培养上清 ALB 水 平的变化， 方法为 ： 将实施例 1 中在诱导的第 0、 7、 14 和 21 天收取培养上清 ( 提前 24 小时 换成无血清培养液 )， 然后用 ELISA 试剂盒 ( 购自 Bethyl Labs) 检测培养液中 ALB 的分泌 水平。结果如图 6 所示 ( 数值用 meanSD 表示， n 3)， 这些细胞具有分泌 ALB 的能力， 诱 导 7 天。

29、时已经能够检测到微量的 ALB， 并且随诱导时间的延长 ALB 水平逐渐升高， 而未诱导 情况下无 ALB 产生。 0054 上述检测结果表明， PLGA 支架体外能很好的支持 hADSCs 粘附、 增殖和向肝细胞的 分化， 证明 PLGA 支架可作为 ADSCs 为基础的组织工程肝单元构建的支架材料。 说 明 书 CN 101422631 B 7 1/3 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101422631 B 8 2/3 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 101422631 B 9 3/3 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 101422631 B 10 。