微小隐孢子虫双价核酸疫苗及制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101422620 B (45)授权公告日 2012.09.19 CN 101422620 B *CN101422620B* (21)申请号 200810050899.2 (22)申请日 2008.06.30 A61K 48/00(2006.01) A61K 39/002(2006.01) C12N 15/30(2006.01) C12N 15/79(2006.01) A61P 33/02(2006.01) (73)专利权人 吉林大学 地址 130062 吉林省长春市西安大路 5333 号 (72)发明人 张西臣 李建华 于钦磊 宫鹏涛 张国才 杨举 李淑红 (74)。

2、专利代理机构 吉林长春新纪元专利代理有 限责任公司 22100 代理人 陈宏伟 CN 1814806 A,2006.08.09, 全文 . CN 1596977 A,2005.03.23, 全文 . CN 1560066 A,2005.01.05, 全文 . Grayson B.LiPford.CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen:a new class of vaccine adjuvants. European Journal。

3、 of Immunology .1997,第27 卷第 2340-2344 页 . Abrahamsen,M.SNCBI Reference Sequence: XM_625459.1.GENBANK .2005, 全 文 . 张雷 . 嗜肺军团菌双价 DNA 疫苗的初步研 究 .中国博士学位论文全文数据库， 医药卫生科 技辑， 2007 年 .2007,( 第 03 期 ), 第 15-27 页 . Abrahamsen,M.SNCBI Reference Sequence: XM_625821.1.GENBANK .2005, 全 文 . 薛霞 . 微小隐孢子虫 Cpgp40/15 基因的。

4、真核 表达及其免疫保护性研究 .中国优秀硕士学位 论文全文库 农业科技辑 2004 年 .2004,( 第 02 期 ), 第 10-39 页 . 何宏轩 . 微小隐孢子虫核酸疫苗的研究 . 中 国博士学位论文全文数据库 农业科技辑 2003 年 .2003,( 第 02 期 ), 第 2-5 章 . 宰德富.微小隐孢子虫表面抗原CP23基因的 克隆及表达 .中国病原生物学杂志 .2006, 第 1 卷 ( 第 3 期 ), 全文 . (54) 发明名称 微小隐孢子虫双价核酸疫苗及制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种微小隐孢子虫双价核酸疫苗 及制备工艺， 以真核表达载体 pVAX1 为载体。

5、， 将两 个微小隐孢子虫保护性抗原基因联合 CPG 免疫 加强序列串联插入到 pVAX1 真核表达载体的多克 隆位点区， 获得了含免疫加强序列的微小隐孢子 虫双价核酸疫苗。选用了两个保护性抗原基因进 行了双价核酸疫苗的研制， 并在此基础上引入了 CPG 免疫加强序列， 以增强其免疫保护效果。本发 明疫苗具有较强的细胞免疫和体液免疫作用， 并 且引入的 CPG 基序又具有激活免疫系统， 诱导天 然免疫应答， 分泌免疫球蛋白和各种细胞因子的 作用， 两者优势组合， 从而可以达到更好的预防动 物微小隐孢子虫病的目的。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 汪未申 权利要求书 1 页 说明。

6、书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种微小隐孢子虫双价核酸疫苗， 其特征在于 ： 以真核表达载体 pVAX1 为载体， 将两 个微小隐孢子虫保护性抗原基因联合CpG免疫加强序列串联插入到pVAX1真核表达载体的 多克隆位点区， 获得含免疫加强序列的微小隐孢子虫双价核酸疫苗 ； 所述的微小隐孢子虫 保护性抗原基因为 CP12 和 CP21 ； CP12 的序列 ： Atgtcagatg catcaataga ttggaagttt tcaataggtt tctatgctgc ga。

7、tatttgta 60 gctctactcc ctaccggcat ttcattgaca tactggtatg aaggagtact ttggcacaac 120 gtattcgaac aggataggct ccagtggcaa cctgaaagaa acgatgcgca aaattttacc 180 aatggtaatc aatataacta tattcaagtt ccaaccgatt ttaatagtgt gatgggaggg 240 ctacagtcgc cttcagaaat ggcaagaaca attgaaagga acatagaaaa gaaacagatg 300 aatgaaca。

8、aatatag 315 ； CP21 的序列 ： atgtctaaaa gagcatcact atttattttt attttcttcg tattgtttga catttttgca 60 acttcacaac atgaggtttc cccaaagttg gctgtgagta gagctgaagc gttatctttt 120 gaaaacagcg aaataagttt gaaagaatta gcatctagac tcaagaccct tctttcagtg 180 gaacaaataa tatatcttgt tcggaaaata attccagaag actttcaatt ggttgctaaa 。

9、240 tccagcgaac atgattattt tgatgtgagt gaaagcacac ttaaagaaac ctatgaaaat 300 ataatttatc aaaacctaac taaagtacct atctatcagc tagttcatat accagaactt 360 ttatctaatg ccactcattt aaggaaaatt cgaaatgcta tcagttcccc aagaccagta 420 agacctagaa aacaaataaa agggaggaat ccaagtaata ttccaggcgc atccccttat 480 tttgtatacg agaga。

10、gtaat agaaatatat aattctgatt ctgacgttca aacagatgaa 540 tag 543。 2. 权利要求 1 所述微小隐孢子虫双价核酸疫苗的制备工艺， 包括以下步骤 ： 将 CpG-CP12、 CP21 目的基因与 T 载体进行连接， 分别用 BamHI、 EcoR1 和 EcoR1、 Xhol 进行双酶 切反应， 回收片段与经过 BamHI 和 Xhol 双酶切反应的真核表达载体 pVAX1 进行连接， 构建 pVAX1-CpG-CP12-CP21 重组载体。 权 利 要 求 书 CN 101422620 B 2 1/3 页 3 微小隐孢子虫双价核酸疫苗及。

11、制备方法 技术领域 0001 本发明提供了一种微小隐孢子虫双价核酸疫苗， 用于隐孢子虫病的预防和治疗， 同时还提供了该疫苗的的制备方法， 属于寄生虫病疫苗制备技术领域。 背景技术 0002 隐孢子虫 (Cryptosporidium) 是一种人畜共患的寄生性原虫， 主要寄生于人和其 它哺乳动物的胃肠道、 禽类的呼吸道等粘膜的上皮细胞内， 由它引起的疾病称隐孢子虫病。 隐孢子虫病分布广泛， 人畜感染率高， 且危害严重， 临床上以严重水样腹泻为主要特征。在 艾滋病人中隐孢子虫感染率可达到 10 50， 是艾滋病人的主要致死因素之一。该病是 今后医学和兽医学界防治的重要寄生虫病。虽经多年研究， 迄今。

12、尚无有效的防治药物以及 预防办法， 已筛选了 200 多种药物， 包括所有的抗生素、 抗球虫药和磺胺类药物用于该病的 治疗， 但没有任何药物对隐孢子虫有杀灭作用。 发明内容 0003 本发明目的是提供一种微小隐孢子虫双价核酸疫苗， 是抗微小隐孢子虫的新型疫 苗， 对于隐孢子虫病的预防和治疗有明显效果。 0004 本发明还提供了该疫苗的制备方法， 适用于工业化生产。 0005 本发明的微小隐孢子虫双价核酸疫苗， 其特征在于 ： 以真核表达载体 pVAX1 为载 体， 将两个微小隐孢子虫保护性抗原基因联合 CPG 免疫加强序列串联插入到 pVAX1 真核表 达载体的多克隆位点区， 获得了含免疫加强。

13、序列的微小隐孢子虫双价核酸疫苗。 0006 所述的微小隐孢子虫保护性抗原基因为 CP12 和 CP21。 0007 本发明的微小隐孢子虫双价核酸疫苗的制备工艺， 包括如下步骤 ： 0008 根据微小隐孢子虫保护性抗原基因序列的开放性阅读框设计引物进行 PCR， TA 克 隆。将所得的包含免疫性加强序列的两个保护性抗原基因串联克隆入真核表达载体 pVAX1 载体， 构建含免疫加强序列的微小隐孢子虫双价重组核酸疫苗。提取重组质粒并利用试剂 盒纯化后， 进行细胞转染。并通过间接免疫荧光、 SDS-PAGE 电泳分析及 Western blotting 实验进行验证。之后利用微小隐孢子虫双价核酸疫苗进。

14、行动物保护性试验以验证效果。 0009 具体的工艺是 ： 将 CPG-CP12、 CP21 目的基因与 T 载体进行连接， 分别用 BamHI、 EcoR1 和 EcoR1、 Xho1 进行双酶切反应， 回收片段与经过 BamHI 和 Xho1 双酶切反应的真核 表达载体 pVAX1 进行连接， 构建 pVAX1-CpGG-CP12-CP21 重组载体。 0010 免疫受损宿主隐孢子虫病症状的严重性和长病程表明， 隐孢子虫病与宿主的免疫 系统关系密切。 因此， 对该病的防治疫苗将起重要作用， 而其关键在于寻找有效的抗隐孢子 虫疫苗的候选分子。 0011 利用新的保护性抗原基因， 构建新型疫苗，。

15、 对隐孢子虫的防治起到非常关键的作 用。由于隐孢子虫的感染及其特点与免疫功能密切相关， 宿主感染隐孢子虫卵囊后其病情 轻重、 病程长短， 治疗效果可能主要取决于机体的免疫状态。因此， 免疫干预是控制隐孢子 说 明 书 CN 101422620 B 3 2/3 页 4 虫病更合适的途径。 0012 本发明的积极效果在于 ： 选用了两个保护性抗原基因进行了双价核酸疫苗的研 制， 并在此基础上引入了 CPG 免疫加强序列， 以增强其免疫保护效果。微小隐孢子虫双价核 酸疫苗本身具有较强的细胞免疫和体液免疫作用， 并且引入的 CPG 基序又具有激活免疫系 统， 诱导天然免疫应答， 分泌免疫球蛋白和各种细。

16、胞因子的作用， 两者优势组合， 从而可以 达到更好的预防动物微小隐孢子虫病的目的。 附图说明 0013 图 1、 pVAX1-CPG-CP12-CP21 载体构建示意图 ； 0014 图 2、 pVAX1-CPG-CP12-CP21 基因转染 Hela 细胞的间接免疫荧光图 ； 0015 图 3、 pVAX1-CPG-CP12-CP21 转染后 SDS-PAGE 及 Western blotting 鉴定图 ； 0016 图 4、 核酸疫苗对免疫小鼠抗微小隐孢子虫感染的保护效果。 具体实施方式 0017 为了便于理解本发明， 特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而 非对本发明的任何。

17、形式的限制。 0018 实施例 1 0019 微小隐孢子虫双价核酸疫苗的制备 0020 本发明以微小隐孢子虫免疫相关蛋白基因 CP12、 CP21 为例， 进行重组真核表达载 体的构建。 0021 微小隐孢子虫双价核酸疫苗的制备步骤 ： 0022 参照CP12、 CP21基因序列开放性阅读框及真核表达载体pVAX1物理图谱设计引物 并引入酶切位点。 0023 CP12 上游引物 ： 0024 QF 1 ： 5 -CTGGATCCTCCATGACGTTCCTGACGTTATGTCAGATGCATCAATA-3 ； 其中 5 端含 有 BamHI 位点以及 CPG 免疫加强序列 ； 0025 下游。

18、引物 QR1 ： 5 -GGGGCGAATTCTATTTGTTCATTCATCTG-3 ； 5 端含有 EcoRI 位点。 0026 CP21 上游引物 ： 0027 QF2 ： 5 -CCGAATTCGGTGGCGGTGGCTCGATGTCTAAAAGAGCAT-3其中 5 端含有 EcoRI 位点以及 Linker 序列 ； 0028 下游引物 QR2 ： 5 -CTGGCTCTCGAGCTATTCATCTGTTTGAAC-3 ； 5 端含有 XhoI 位点。 0029 利用上述引物序列进行 PCR 反应 ( 通用参数为 ： 94 4min ； 94 45s， 55 50s， 72 1mi。

19、n， 30 个循环后于 72延伸 10min)， 将各个 PCR 纯化产物克隆分别至 PMD18-T 载 体， 经 PCR 及相对应的酶切鉴定后， 送生物公司测序鉴定。凝胶回收各个目的片段然后与 用 BamHI 和 XhoI 进行双酶切的真核表达载体 pVAX1 连接， 连接产物转化 E.coli DH5 感受态细胞后筛选重组质粒， 用 BamHI 和 XhoI 进行双酶切反应鉴定， 将重组质粒命名为 pVAX1-CPG-CP12-CP21( 如图 1)。提取重组质粒 pVAX1-CPG-CP12-CP21， 并利用质粒纯化试 剂盒进行质粒的纯化， 37， 5 CO2孵箱培养 Hela 细胞，。

20、 使细胞达到 50 80融合， 按 Lipofectamine 转染试剂盒说明进行转染， 转染 72 小时后更换培养基并用 G418 进行筛选， 说 明 书 CN 101422620 B 4 3/3 页 5 同时用未加转染的细胞作对照。当对照细胞大部分死亡时， 用含低浓度的 G418 的培养基维 持筛选。1 周后有阳性克隆形成， 待其逐渐增大后转移扩大培养。分别收集培养上清液、 转 染细胞和对照细胞。 基因转染后进行免疫荧光、 SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴 定 ( 如图 2、 3)。 0030 实施例 2 0031 微小隐孢子虫双价核酸疫苗的用途 0032 将 。

21、50 只 4 6 周龄， 18 22g 的雌性清洁级 BALB/c 小鼠分成 5 组， 每组 10 只， 其中第一组为阴性对照组 ( 肌注 100ul/ 只生理盐水 )， 第二组 pVAX1-CPG-CP12-CP21 肌注 组 ( 佐剂为司苯甘油， 100ug/ 只 )， 第三组为 pVAX1 肌注组 ( 佐剂为司苯甘油， 100ug/ 只 )， 第四组 pVAX1-CPG-CP12-CP21， 滴鼻组 ( 佐剂为司苯甘油， 100ug/ 只 )， 第五组阳性对照组， 肌肉注射卵囊抗原 100ug/ 只。各组注射三次， 间隔两周。三免一周后口服接种微小隐孢子 虫卵囊 1106个 / 只进行攻。

22、虫试验， 攻虫后每隔两天收集各组粪便， 用饱和硫酸锌浮集法 收集卵囊， 将沉淀溶于一定量的水中， 混匀后， 取一滴置于血细胞计数板中， 在低倍镜下记 数隐孢子虫卵囊总数。同时进行体液和细胞免疫水平的检测。于每次免疫前尾静脉采血， 分离血清， 用微小隐孢子虫卵囊抗原作为包被抗原， 通过间接ELISA方法对鼠血清中IgG变 化情况进行检测 ( 如附图 4 所示 )。第三次免疫后 1 周， 每组随机各取 4 只小鼠放血处死， 取脾脏， 加 2mLPBS， 在 200 目筛上研磨， 用 PBS 稀释成细胞悬液 (107个 /mL)。取 100L 细 胞悬液， 加 FITC 标记的抗 CD4+和 PE 。

23、标记的抗 CD8+兔抗鼠单克隆抗体， 避光作用 40min， 然 后用 PBS 洗液洗 2 遍， 加入 0.5mL 荧光保存液， 用流式细胞仪检测 CD4+、 CD8+T 淋巴细胞的数 量， 并用 SPSS 软件对所得数据进行统计学分析。 0033 免疫保护性试验结果显示试验组免疫保护率明显优于阴性对照组， 排出的卵囊明 显减少， 排出时间也缩减 ( 见附图 4)。体液免疫检测结果证实一免后各实验组与对照组相 比 IgG 滴度变化不大。二免后 IgG 滴度逐渐上升， 第三次免疫后， 各实验组均显示一定的抗 体效价， 其中 pVAX1-CPG-CP12-CP21 滴鼻组血清抗体效价最高， 于阴性。

24、对照组相比差异极 显著(P0.01)。 细胞水平免疫检测结果表明免疫组CD4+、 CD8+变量明显高于阴性对照组， 与阴性对照组差异均极显著 (P 0.01)， 且滴鼻组鼠的 CD4+、 CD8+T 淋巴细胞数升值较注 射组高。综合上述实验结果， 本发明的微小隐孢子虫双价核酸疫苗 pVAX1-CPG-CP12-CP21， 对微小隐孢子虫免疫保护率较高， 可以用来作为微小隐孢子虫病的预防和治疗性疫苗。 说 明 书 CN 101422620 B 5 1/2 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101422620 B 6 2/2 页 7 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101422620 B 7 。