一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510472068.4 (22)申请日 2015.08.04 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105010245 A (43)申请公布日 2015.11.04 (73)专利权人 山东省花生研究所 地址 266199 山东省青岛市李沧区万年泉 路126号 (72)发明人 任艳 袁美 石延茂 尹亮 李双铃 崔潇 李磊 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人 邵朋程 (51)Int.Cl. A01K 67/033(2006.01) 。

2、(56)对比文件 CN 1737123 A,2006.02.22, CN 101946751 A,2011.01.19, US 2009/0010894 A1,2009.01.08, CN 103773797 A,2014.05.07, CN 101899470 A,2010.12.01, 阮龙.基于发根体系的甘薯茎线虫病研究及 甘薯遗传转化体系建立. 中国博士学位论文全 文数据库 农业科技辑 .2008, (第10期),D046- 7. 审查员 金李静芳 (54)发明名称 一种采用花生发根培养北方根结线虫的方 法 (57)摘要 本发明公开了一种采用花生发根培养北方 根结线虫的方法， 包括以下。

3、步骤： 选取花育45号 种子， 接种于MSB5培养基上培养； 取发根农杆菌 A4菌株， 经培养活化， 达到对数生长期； 采用发根 农杆菌A4侵染无菌培养6d的花育45号花生子叶 诱导毛状根； 选取虫瘿多的花生根， 浸没入NaCLO 溶液中， 弄碎， 制成混合液； 将混合液倒入组合筛 上， 组合筛自上而下依次为40目、 200目、 325目和 500目， 用无菌水喷淋冲洗， 使线虫集中一侧， 然 后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物， 收集液 体到容器获得根结线虫悬液； 将根结线虫悬液均 匀接至花生毛状根培养皿， 培养获得大量虫卵和 二龄幼虫。 本发明方法解决了难以获得纯化的大 量根结线虫的问题，。

4、 繁殖率高。 权利要求书1页 说明书4页 CN 105010245 B 2017.06.06 CN 105010245 B 1.一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法， 其特征在于包括以下步骤： a花生毛状根的制备 a1选取粒大饱满的花育45号种子， 经消毒处理， 然后用无菌刀在无菌滤纸上剥去种皮， 接种于培养基上培养； a2无菌条件下， 用接种环挑取低温冻存的发根农杆菌A4菌株， 在LB+50mg/L Kan的固体 平板上化线接种， 然后置于恒温培养箱中暗培养， 待长出单菌落后挑取1个单菌落转入10ml LB液体培养基中， 于摇床内暗培养复苏； 取0.05ml该菌液于10ml LB液体培养基。

5、中再次活 化， 使其达到对数生长期； a3当农杆菌的A600nm0.60.8时采用发根农杆菌A4侵染步骤a1无菌培养6d的花育 45号花生子叶诱导毛状根， 扩繁继代培养毛状根； b北方根结线虫悬液及卵悬液的制备 b1选取北方根结线虫病发病严重， 虫瘿多的花生根， 用剪刀剪成小段， 浸没入NaCLO溶 液中， 将花生根段弄碎， 并搅拌， 制成混合液； b2将混合液倒入组合筛上， 组合筛自上而下依次为40目、 200目、 325目和500目， 用喷壶 形成薄雾喷洒40目筛上的混合物， 使线虫和卵从根组织内移到表面， 喷淋后期使用无菌水； 喷淋后， 取出325目筛， 用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲。

6、洗， 使线虫集中一侧， 然后再用 少量无菌水从筛背面冲洗筛上物， 收集液体到容器获得根结线虫悬液； 取出500目筛， 用无 菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗， 使线虫集中一侧， 然后再用少量无菌水从筛背面冲洗 筛上物， 收集液体到容器获得卵悬液； c北方根结线虫的接种与培养 无菌条件下， 将制备好的根结线虫悬液或卵悬液， 均匀接至花生毛状根培养皿， 合盖静 置， 用膜封口， 培养获得大量虫卵和二龄幼虫。 2.根据权利要求1所述的一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法， 其特征在于， 步 骤a1中消毒处理过程如下： 先用自来水冲洗花育45号种子20-30min， 然后于无菌条件下， 用 质量百分比。

7、浓度为75的酒精浸泡0.5-1min， 再在0.1升汞中浸泡15min， 最后用无菌水 洗涤34次， 每次3-5min。 3.根据权利要求1所述的一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法， 其特征在于， 步 骤a2中： 所述发根农杆菌A4菌株在-20低温冰箱中冻存； 所述恒温培养箱内的温度控制在 28； 所述LB液体培养基中添加有50mg/L Kan； 所述摇床内培养条件为温度28， 转速 180r/min。 4.根据权利要求1所述的一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法， 其特征在于， 步 骤b1中： 将虫瘿多的花生根剪成1cm小段； 所述NaCLO溶液的质量百分比浓度为1； 所述搅 拌时间为。

8、10min。 5.根据权利要求1所述的一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法， 其特征在于， 步 骤c中： 选取根结线虫悬液1ml或卵悬液1ml接至花生毛状根培养皿； 所述合盖静置时间为 1h； 所述培养温度为25， 培养时间为42d。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105010245 B 2 一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种根结线虫的培养方法， 具体地说是涉及一种采用花生发根培养北 方根结线虫的方法。 背景技术 0002 花生是世界上广泛种植的经济作物之一， 是我国第二大食用植物油和蛋白质资 源。 我国北方地区主要是北方根结线虫对花生生产。

9、危害严重， 尤其是花生大省山东， 发病面 积最大， 损失最严重。 受害的花生一般减产在20-30左右， 严重时可达70-80， 甚至 绝收(徐秀娟， 2009)。 花生线虫病是花生生产上的重要病害， 迄今为止， 仍不能很好的控制 线虫病的发生和危害。 0003 根结线虫侵染花生后， 刺激巨型细胞产生， 导致花生的根活力下降， 阻碍对营养物 质的吸收和运输。 同时可引起花生叶绿素含量减少， 光合强度下降。 根结线虫侵染花生以后 在侵染的第3d引起花生呼吸强度提高， 随后则明显降低。 这些生理变化都导致了花生的代 谢失常和生理紊乱， 最终导致植株矮小、 黄化， 甚至枯萎死亡(宾淑英， 1999)。。

10、 目前对花生北 方根结线虫病的研究局限在植物病理方面， 对北方根结线虫的生长发育、 遗传特性和代谢 途径方面缺乏研究， 原因是缺乏北方根结线虫的单外源高效连续培养体系和缺乏能反映出 线虫和寄主的互相作用的真实情况的研究体系。 0004 由于植物寄生线虫、 植物宿主和环境之间的关系是极其复杂的， 难以评估在土壤 中所发生的变化。 无菌培养条件下研究它们之间的关系可以反映出植物寄生线虫和植物宿 主相互作用真实情况， 为一种良好的方法。 要研究北方根结线虫， 首先要培养得到大量一致 的线虫群体。 目前植物寄生线虫的无菌培养多采用在愈伤组织或离体根上单外源培养， 是 研究植物寄生线虫生化和遗传发育特性。

11、上常用的方法， 缺点在于愈伤组织和离体根透明性 差， 不便于观察， 不能继代培养， 影响实验的连续性。 这就要求尽快研究出北方根结线虫的 单外源高效连续培养体系， 为开展花生抗线虫病的研究提供重要技术平台。 0005 目前， 在花生北方根结线虫病抗性鉴定方法研究方面缺乏一个简单、 直观方便、 重 复性好以及不受自然环境影响的抗性鉴定方法。 0006 病地自然诱发鉴定， 受自然条件影响大， 每年发病情况都不一样， 周期长， 费工， 占 地面积大。 室内人工接种鉴定方法虽具有快速等特点， 但和生长实践不符合， 只能鉴定品种 抗扩展特性。 0007 发根农杆菌能诱导大多数双子叶植物和少数单子叶植物，。

12、 发根农杆菌所含Ri质粒 的T-DNA通过整合进入植物核基因组， 并稳定表达引起宿主植物发根。 用发根农杆菌侵染花 生而获得的发根生长速度快， 具有激素自主性， 分化水平高， 遗传特性稳定， 合成能力较强， 易于继代培养。 发根具有正常根组织结构， 符合植物内寄生线虫的生长环境， 因此更能反映 出线虫和寄主互相作用的真实情况。 0008 常用的发根农杆菌对花生外植体毛状根诱导能力存在差异。 Fabricio等采用3种 发根农杆菌ATCC15834、 R1000、 EHA105均诱导出毛状根。 Kim等采用发根农杆菌ATCC15834、 说 明 书 1/4 页 3 CN 105010245 B 。

13、3 A4、 R1000、 R1200、 R1601等菌株诱导发根。 国内姚庆收等采用发根农杆菌R1601诱导， 子叶没 有诱导出毛状根， 叶片诱导率达65.6， 茎干诱导毛状根生长缓慢。 刘杰等采用发根农杆菌 ACCC10060和ATCC11325诱导发根， 叶片最高诱导率为53.3。 0009 Verdejo S.等发现经发根农杆菌转化后的植株具有侧根增多、 易于次培养等特 点， 在用马铃薯和番茄的发根培养瓜哇根结线虫获得较好的效果。 Elsen A.等发根体系研 究了菌根真菌和咖啡短体线虫的相互作用。 Kifle S.等用甜菜发根体系来研究转抗根部专 性寄生物基因的表达。 Narayana。

14、n R.A.用大豆发根体系研究大豆孢囊线虫特性， 表明用发 根体系可以鉴定大豆抗孢囊线虫基因。 Plovie E.等研究了用番茄发根体系鉴定番茄抗线 虫特性。 肖翔等进行了胡萝 卜发根培养甘薯茎线虫体系的研究。 阮龙等做了用甘薯、 胡萝 卜发 根体系培养马铃薯腐烂线虫的研究。 0010 多年来发根一直被用于维持线虫的常规培养和研究植物与寄生物之间的相互关 系。 运用发根体系检测植物对线虫抗性， 已经在甜菜、 大豆、 马铃薯、 番茄和甘薯等作物上使 用， 但运用花生发根体系培养北方根结线虫还没有人尝试。 发明内容 0011 基于上述技术问题， 本发明提供一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法。 。

15、0012 本发明所采用的技术解决方案是： 0013 一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法， 包括以下步骤： 0014 a花生毛状根的制备 0015 a1选取粒大饱满的花育45号种子， 经消毒处理， 然后用无菌刀在无菌滤纸上剥去 种皮， 接种于无激素的MSB5培养基上培养； 0016 a2无菌条件下， 用接种环挑取低温冻存的发根农杆菌A4菌株， 在LB+50mg/L Kan的 固体平板上化线接种， 然后置于恒温培养箱中暗培养， 待长出单菌落后挑取1个单菌落转入 10ml LB液体培养基中， 于摇床内暗培养复苏； 取0.05ml该菌液于10ml LB液体培养基中再 次活化， 使其达到对数生长期；。

16、 0017 a3当农杆菌的A600nm0.60.8时采用发根农杆菌A4侵染步骤a1无菌培养6d的 花育45号花生子叶诱导毛状根， 扩繁继代培养毛状根； 0018 b北方根结线虫悬液及卵悬液的制备 0019 b1选取北方根结线虫病发病严重， 虫瘿多的花生根， 用剪刀剪成小段， 浸没入 NaCLO溶液中， 将花生根段弄碎， 并搅拌， 制成混合液； 0020 b2将混合液倒入组合筛上， 组合筛自上而下依次为40目、 200目、 325目和500目， 用 喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物， 使线虫和卵从根组织内移到表面， 喷淋后期使用无 菌水； 喷淋后， 取出325目筛， 用无菌水自筛的一侧向另一侧。

17、喷淋冲洗， 使线虫集中一侧， 然 后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物， 收集液体到容器获得根结线虫悬液； 取出500目 筛， 用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗， 使线虫集中一侧， 然后再用少量无菌水从筛背 面冲洗筛上物， 收集液体到容器获得卵悬液； 0021 c北方根结线虫的接种与培养 0022 无菌条件下， 将制备好的根结线虫悬液或卵悬液， 均匀接至花生毛状根培养皿， 合 盖静置， 用膜封口， 培养获得大量虫卵和二龄幼虫。 说 明 书 2/4 页 4 CN 105010245 B 4 0023 优选的， 步骤a1中消毒处理过程如下： 先用自来水冲洗花育45号种子20-30min， 然 后于。

18、无菌条件下， 用质量百分比浓度为75的酒精浸泡0.5-1min， 再在0.1升汞中浸泡 15min， 最后用无菌水洗涤34次， 每次3-5min。 0024 步骤a1中， 所述培养基优选无激素的MSB5培养基， 即为MS无机盐+B5有机成分(简 称MSB5)， 大体包括： MS大量+MS微+MS铁盐+B5有机+蔗糖30g/L+琼脂粉10g/L， pH值为6.0。 当 然上述用于花育45号种子接种的培养基本领域技术人员也可根据经验进行常规选择。 0025 优选的， 步骤a2中： 所述发根农杆菌A4菌株在-20低温冰箱中冻存； 所述恒温培 养箱内的温度控制在28； 所述LB液体培养基中添加有50m。

19、g/L Kan； 所述摇床内培养条件 为温度28， 转速180r/min。 0026 优选的， 步骤b1中： 将虫瘿多的花生根剪成1cm小段； 所述NaCLO溶液的质量百分比 浓度为1； 所述搅拌时间为10min。 0027 优选的， 步骤c中： 选取根结线虫悬液1ml或卵悬液1ml接至花生毛状根培养皿； 所 述合盖静置时间为1h； 所述培养温度为25， 培养时间为42d。 0028 本发明的有益技术效果是： 0029 本发明方法繁殖率高、 操作简单、 不易污染、 应用范围广、 实用性强， 解决了难以获 得纯化的大量根结线虫的问题， 且避免了盆栽实生苗接种繁殖根结线虫方法的费时、 占据 大量空。

20、间、 受季节等自然和环境条件限制以及易被其他生物污染等不足。 与常规寄主根系 外植体培养法相比， 毛状根系外植体更有利于根结线虫的侵染繁殖。 具体实施方式 0030 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明： 0031 实施例1 0032 a花生毛状根的制备 0033 选取粒大饱满的花育45号种子， 先用自来水冲洗20min， 然后于无菌条件下， 用质 量百分比浓度为75的酒精浸泡1min， 再在0.1升汞中浸泡15min， 进行表面消毒， 最后用 无菌水洗涤3次， 每次3min。 消毒处理后， 用无菌刀在无菌滤纸上剥去种皮， 接种于培养基上 培养。 0034 无菌条件下， 用接种环挑取于-20。

21、低温冰箱中冻存的将发根农杆菌A4菌株， 在LB +50mg/L Kan的固体平板上化线接种， 然后置于28恒温培养箱中暗培养， 待长出单菌落后 挑取1个单菌落转入10ml LB液体培养基(添加50mg/L Kan)中， 于28、 180r/min的摇床内 暗培养复苏21h。 取0.05ml该菌液于10ml LB液体培养基中再次活化(条件同上)， 使其达到 对数生长期。 使农杆菌的A600nm0.60.8时采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花育45 号花生子叶诱导毛状根， 扩繁继代培养毛状根。 0035 b北方根结线虫悬液的制备 0036 选取北方根结线虫病发病严重， 虫瘿多的花生根， 用剪刀。

22、剪成1cm的小段， 浸没入 装有质量百分比浓度为1的NaCLO溶液的大烧杯中， 带上无菌手套将含有虫瘿的花生根段 捏碎， 搅拌10min， 制成混合液。 将混合液倒入组合筛上， 组合筛自上而下依次为40目、 200 目、 325目和500目。 用喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物约30min， 使线虫和卵从根组织 内移到表面， 喷淋后期使用无菌水。 喷淋后， 取出325目筛， 用无菌水自筛的一侧向另一侧喷 说 明 书 3/4 页 5 CN 105010245 B 5 淋冲洗， 使线虫集中一侧， 然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物， 收集液体到容器获得 根结线虫悬液。 用同法冲洗500目筛， 。

23、可制备获得卵悬液。 0037 c北方根结线虫的接种与培养 0038 无菌条件下， 将制备好的根结线虫悬液1ml(约100条)或卵悬液1ml(约100个)， 均 匀接至花生毛状根培养皿， 合盖静置1h， 用膜封口。 25培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫。 0039 实施例2 0040 a花生毛状根的制备 0041 选取粒大饱满的花育45号种子， 先用自来水冲洗30min， 然后于无菌条件下， 用质 量百分比浓度为75的酒精浸泡0.5min， 再在0.1升汞中浸泡15min， 进行表面消毒， 最后 用无菌水洗涤4次， 每次3min。 消毒处理后， 用无菌刀在无菌滤纸上剥去种皮， 接种于无激素 的M。

24、SB5培养基上培养。 MSB5培养基为MS无机盐+B5有机成分(简称MSB5)。 0042 无菌条件下， 用接种环挑取于-20低温冰箱中冻存的将发根农杆菌A4菌株， 在LB +50mg/L Kan的固体平板上化线接种， 然后置于28恒温培养箱中暗培养， 待长出单菌落后 挑取1个单菌落转入10ml LB液体培养基(添加50mg/L Kan)中， 于28、 180r/min的摇床内 暗培养复苏21h。 取0.05ml该菌液于10ml LB液体培养基中再次活化(条件同上)， 使其达到 对数生长期。 使农杆菌的A600nm0.60.8时采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花育45 号花生子叶诱导毛状根。

25、， 扩繁继代培养毛状根。 0043 b北方根结线虫悬液的制备 0044 选取北方根结线虫病发病严重， 虫瘿多的花生根， 用剪刀剪成1cm的小段， 浸没入 装有质量百分比浓度为1的NaCLO溶液的大烧杯中， 带上无菌手套将含有虫瘿的花生根段 捏碎， 搅拌10min， 制成混合液。 将混合液倒入组合筛上， 组合筛自上而下依次为40目、 200 目、 325目和500目。 用喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物约30min， 使线虫和卵从根组织 内移到表面， 喷淋后期使用无菌水。 喷淋后， 取出325目筛， 用无菌水自筛的一侧向另一侧喷 淋冲洗， 使线虫集中一侧， 然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物， 收集液体到容器获得 根结线虫悬液。 用同法冲洗500目筛， 可制备获得卵悬液。 0045 c北方根结线虫的接种与培养 0046 无菌条件下， 将制备好的根结线虫悬液1ml(约100条)或卵悬液1ml(约100个)， 均 匀接至花生毛状根培养皿， 合盖静置1h， 用膜封口。 25培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105010245 B 6 。