技术领域
本发明涉及能着色的(pigmenting)表皮等同物(epidermis equivalent)，其包含来自基质细胞(matrix cell)的分化的细胞，以及涉及其制备方法。
本发明也涉及包含所述表皮等同物的、能着色且任选含有毛囊的重建皮肤(reconstructed skin)，其制备方法及其在评估局部用化妆品、药物或皮肤病学产品的效果中的用途。
本发明的重建皮肤也可用于制备准备移植到哺乳动物、更特别是移植到人类患者如三度烧伤患者上的移植物(grafts)。
背景技术
开发重建皮肤模型的努力已经进行了许多年，一方面，重建皮肤模型将使开展在机理领域和生理领域更好理解皮肤作用所必需的研究成为可能，另一方面，重建皮肤模型构建化妆品和/或药物活性试剂的活性预测实验或者可选地构建局部用成分的副作用预测实验。
因此，在或多或少地程度上，已经可以开发与人类皮肤相似的模型。例如，可以提及下列文献记载的模型：EP 0 285 471，EP 0 285 474，EP 0 418 035，WO-A-90/02796，WO-A-91/16010，EP0 197 090，EP0 020 753，FR 2 665 175，FR 2689 904。
通常，这些文献记载的重建皮肤模型由真皮乳头成纤维细胞和/或从外上皮鞘(outer epithelial sheath)(也称外根鞘(Outer Root Sheath)或ORS)移取的细胞制备，因为这些细胞容易获得。实际上，当拔出发丝后这些细胞就被移出，而且当将它们置于支持物(通常是真皮等同物)上，且在合适培养介质中培养时，这些细胞能够制造表皮。
当角质化细胞来自ORS时，这些表皮模型中可能存在的少许黑素细胞并不多，使得不能获得满意的着色的(pigmented)皮肤模型(Lenoir MC，Bernard BA，Pautrat G，Darmon M，Shroot B.Outer root sheath cells of human hair follicle are able to regenerate a fully differentiated epidermis in vitro.Dev Biol.1988 Dec；130(2)：610-20和Limat A，Breitkreutz D，Hunziker T，Boillat C，Wiesmann U，Klein E，NoserF，Fusenig NE.Restoration of the epidermal phenotype by follicular outer root sheathcells in recombinant culture with dermal fibroblasts.Exp Cell Res.199l June；l94(2)：2l8-27)。
为了获得着色的皮肤模型，已知可将商业可获得的表皮黑素细胞加入角质化细胞培养物中(FR 2 665 175)。然而，获自该模型的着色特性并不能满意地再现自然着色。
基质细胞，其位于毛球(hair bulb)中并围绕真皮乳头形成小细胞群集，主要由角质化细胞前体构成，该角质化细胞前体构成生发层(germinative)并迅速增生和分化，形成毛干，因此在头发生长循环中起到关键作用。从毛发生长初期阶段开始至结束，这些基质细胞将增生直至毛发生长中期，而后在毛发生长终期阶段消失(Ebling FJ.The biology of hair.Dermatol Clin.1987 Jul；5(3)：467-81.Review；Saitoh M，Uzuka M，Sakamoto M.Human hair cycle.J Invest Dermatol.1970 Jan；54(1)：65-81)。基质也包括负责头发着色的滤泡黑素细胞。
这些基质细胞的增生和分化由真皮乳头调节(Botchkarev VA，Kishimoto J.Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling.JInvest Dermatol Symp Proc.2003 Jun；8(1)：46-55.Review)。
发明内容
惊奇地是，本申请人已经证明，在人造真皮上培养基质细胞能产生特别包括角质化细胞和黑素细胞的完全表皮。
尽管基质中存在的滤泡黑素细胞通常是使头发着色，但是发现根据本发明的方法它们也能在表皮环境中生长且也能用于着色在体外生产的表皮，而且移植后在活体内也可以。因此，申请人已经开发出一种完全从头发细胞-基质细胞制备能着色的皮肤模型的新方法。
本方法的优越性在于，其使得通过利用单一组织-基质获得包含完全表皮的皮肤模型成为可能，其中该皮肤模型提供所有表皮细胞类型；而且，这些细胞以允许它们增殖的几乎未分化状态彼此相容，形成呈现活表皮特性的表皮组织。
该制备表皮等同物(epidermis equivalent)的方法不需要设计为用于富集具有给定细胞类型的组织的预处理。
基质细胞的使用无需考虑头发所在的阶段：毛发生长初期，毛发生长中期或毛发生长终期。
最后，与使用ORS角质化细胞的文献已记载的技术(对它们来说，需要接种约33000个细胞)比较而言，该方法只需极少量细胞(接种约1000个细胞)，而且，由于基质细胞的定殖动力学(kinetics of colonization)高，所以重建表皮的制备被加速。
需要克服的困难之一是获取充足数量的高质量基质细胞。
通常情况下，当发丝脱落或拔出后，真皮乳头-基质细胞室(compartment)仍保持在头皮的真皮内。该室将引发新头发发育循环，并将生成新的滤泡。因此，拔出发丝并不能使得可以获得这些基质细胞，因此必需进行头皮活检，然后通过显微解剖分离这些细胞。
除了分离困难以外，基质细胞也至少因为下列原因而难于培养：
a)它们的数量特别少；
b)它们容易分解，因此在显微解剖中较难定位；
c)它们不粘附塑料支持物(plastic support)；
d)它们较难扩增(amplify)，因为在制备表皮等同物所需的融合时它们倾向于形成小群落(colonies)而不是原代培养物(primary culture)。
一些作者建议将这些细胞与乳头的成纤维细胞作为共同培养物一起培养。该方法的缺点在于获得的培养物不均一，且基质细胞被共培养中所用的乳头真皮成纤维细胞所污染(Reynolds AJ，Lawrence CM，Jahoda CA.Human hair folliclegerminative epidermal cell culture.J Invest Dermatol.1993 Oct；101(4)：634-8)。
Luo et al.提出了显微解剖和在塑料支持物上培养基质细胞的技术(Luo et al：Method for culturing hair follicle epithelial matrix cells；Reg.Number：H1610；Nov.5，1996)。然而，该显微解剖技术产生极低的基质细胞产率，而且这些细胞的培养仅仅只能获得未分化细胞单层，该单层不能用作全皮肤模型。
本申请人分离了基质细胞并开发了在真皮等同物上培养这些细胞的方法，这些细胞迅速增生和分化，形成完全表皮。
优选地，基质组织通过将保持细胞数量和完整性的新显微解剖技术获得； 它们没有相互分离。该显微解剖技术使得能分离和在真皮等同物支持物保存所有基质细胞。
使用该显微解剖技术，基质细胞将更容易粘附于真皮等同物上、均一增生并分化。所获表皮等同物可进一步包括除角质化细胞以外的细胞类型，如黑素细胞。
制备能着色的表皮的已知技术是利用ORS角质化细胞，在体外预培养后将黑素细胞加入其中；然而，该预培养的后果是在表皮环境外发生的细胞分化，黑素细胞不能形成可与活体内观察的黑素细胞相比较数量的树突。接着将它们引入表皮模型，将不能确保黑素细胞在角质化细胞基层的均匀分布，或将不能保证黑素细胞的最佳功能，其通常是双极(两树突)的，由此将黑素粒(melaningrains)转移至角质化细胞的能力较低。
因此，根据本发明主题的第一方面，本发明涉及利用基质细胞制备着色的表皮等同物。
术语“基质细胞”应理解为是指位于毛球中的细胞，它们围绕真皮乳头形成小细胞群集(Ebling FJ.The biology of hair.Dermatol Clin.1987 Jul；5(3)：467-81.Review；Saitoh M，Uzuka M，Sakamoto M.Human hair cycle.J Invest Dermatol.1970 Jan；54(1)：65-81)。这些细胞的样品可收集、扩增并储存于组织库中。
为保持基质组织完整性，可以按下述方法收集这些细胞：将毛囊置于Petri盘中，所述Petri盘包含基本培养介质(minimum culture medium)并补加有2％抗生素和必需氨基酸。从真皮乳头及连接鞘(connective sheath)分离毛头的上皮，然后在真皮乳头顶端切下球状区。接着，将所获部分置于在无菌环内的真皮等同物上，而后在介质中培养基质细胞，所述介质在下文表皮制备方法及在实施例I中有详细记载。
基质细胞提供制备能着色的表皮所需的所有细胞；因此，利用基质细胞制备表皮等同物不需要任何其它类型的细胞，而且可在排除任何外生细胞供应的情况下进行。
根据第二个主题，本发明涉及制备表皮等同物的方法，包括至少一个在真皮等同物上培养基质细胞的步骤。
本发明方法获得的“表皮等同物”——也称为表皮模型，是再现活体表皮特征的完全组织，即角化的分层的多层上皮，其最少包括角质化细胞，基细胞 (basal cell)与真皮等同物接触，且其顶层显示出再现组织上的正常粒层(stratumgranulosum)和角质层(stratum corneum)的终末分化。该表皮等同物也包括功能性的黑素细胞，也就是说，该表皮等同物能转移黑色素(黑素粒)至角质化细胞；对该表皮的组织学观察显示黑素细胞在基层水平的组织结构，由此精确再现正常的皮肤结构。
该表皮模型特点之一是，含众多树突(三个或更多个)的大量黑素细胞均一围绕在基础角质化细胞周围；这些特征在观察表皮模型横截面时表现得特别清楚(特别参见图3，其中可见基层的角质化细胞被对应于黑素细胞的厚且黑的层所围绕)。
这些特征尤其使得可以将本发明方法所获表皮模型与现有技术方法区分开来。确实，常规方法制备的表皮(后加入黑素细胞)含有少量黑素细胞，其位于基础角质化细胞之间并带有两个树突。
优选地，真皮等同物也包括朗格汉斯细胞(Langerhans’cells)和/或默克尔细胞(Merkel cells)。
此外，该表皮能均匀着色。
实际上，看起来本发明的表皮模型具有均匀着色，黑素粒有规则地位于角质化细胞顶极(top pole)及角质层中。该分布与现有技术表皮模型相比有优越性，就现有技术模型而言，其有很少的不规则分布于表皮中的黑素粒。
更具体地，本发明方法的特征在于它包括：
a-在真皮等同物上接种基质细胞，该真皮等同物置于浸没在培养介质中的支持物上；
b-在所述真皮等同物表面增殖所述基质细胞；
c-升高所述支持物，以使在制备过程中培养介质不覆盖表皮等同物顶面(topface)。
特别地，所述支持物可以是支持格栅。
本发明所用的“真皮等同物”或真皮支持物，可以是现有技术文献记载那些中的任意一种(特别是FR 2 665 175所记载的那些)。举例来说，作为支持物，可提到收缩胶原/成纤维细胞网架，预先去表皮化的(de-epidermized)真皮(Prunieras et al.，Ann，Chir.Plast.，1979，24，No.4，357-362)，选自合成半渗透膜(特别是FR 2 833 271所记载的那些)、人造膜(例如Millipore商标过滤器)的惰性支 持物，基于胶原的皮下替代物，或者任何其它与细胞存活和粘附相容的可暴露于空气的支持物。
优选地，真皮等同物由其中真皮成纤维细胞分布于其中的胶原网架组成，其中所述真皮成纤维细胞处于与活体中观察到的等同的分化状态。
这种类型的真皮等同物可以根据不同方法制备，例如EP 0 418 035，WO00/29553或EP 0 285 471所记载的方法。
该方法可以包括以下培养阶段(culture stages)：
a)收获的可收缩细胞(contractile cells)，例如，收获自在用动物或人组织片段接种的营养介质上制造的单层培养物，和
b)补加有真皮细胞外基质组分的营养介质，所述混合物形成发生收缩的凝胶，驱逐出营养介质并形成真皮等同物。
可以使用成纤维细胞作为可收缩细胞；获自健康人供体并通过可控胰蛋白酶化从单层培养物收获的真皮成纤维细胞，被有利地用作可收缩细胞。如下所示，可收缩细胞的选择将决定基质细胞的分化；因此，它们将根据所需真皮等同物的品质来进行选择。
基质细胞构成能形成皮肤或毛发(根据真皮等同物产生的细胞环境(cellularcontext))的多能细胞库(reservoir of pluripotent cells)，因为真皮等同物的成纤维细胞能指导角质化细胞分化程序。
因此，如果其上放置有基质细胞的真皮等同物主要含有滤泡间皮肤成纤维细胞，那么，由于成纤维细胞与基质的角质化细胞之间的相互作用，基质的角质化细胞将形成滤泡间表皮等同物。
所述皮肤成纤维细胞可以是乳头成纤维细胞或网状成纤维细胞或两种的组合。
为制备能着色的表皮模型，可以使用滤泡间成纤维细胞。
实施本发明的制备方法，包括将基质细胞接种于真皮等同物上或真皮基底上。将全部基质都沉积在真皮等同物上。所沉积的基质的数量取决于真皮等同物的表面积。例如，当真皮等同物在60mm盘中制备时，收缩后它们有约2cm2 表面积，接种约10个基质。
维持允许基质细胞在所述基底表面增殖的条件，该基质细胞培养物的生长可使用至少一种基本营养介质来促进，优选实施例I所记载的与所述基质表面相 接触的3F介质。
有益地，在基质细胞接种于基底上之后，经植入的基底浸没在覆盖基质细胞的营养介质中，优选保持5-6天。
接着，使真皮等同物与空气接触；为此，将其放在相对容器基底升高的支持格栅上并调整营养介质液位，以使支持格栅刚好被覆盖但营养介质未覆盖所生产的皮肤等同物的顶面。
根据一个变体，本发明方法可以进一步包括用于诱导表皮等同物着色的额外步骤。这可以是用UV射线刺激。
这样形成的本发明皮肤等同物分化良好并且组织良好。其整体上也是均一的。
术语“皮肤等同物”，下文也称重建皮肤，应理解为是指置于真皮等同物上的表皮等同物组合。
如此制备的真皮等同物至少包括角质化细胞和黑素细胞。
表皮等同物也可以包括朗格汉斯细胞和/或默克尔细胞；这些细胞特别地可在基质细胞接种期间添加到支持物。
根据本发明方法的一个变体，利用包括真皮乳头成纤维细胞和/或连接鞘成纤维细胞和/或完整真皮乳头的真皮等同物，可以制备能重建一个或多个毛囊的皮肤等同物。
如果选择将毛发成纤维细胞如乳头成纤维细胞或连接鞘成纤维细胞或整个乳头或连接鞘或连接鞘部分包含于真皮等同物中（Reynolds AJ，Lawrence CM，Jahoda CA.Human hair follicle germinative epidermal cell culture.J Invest Dermatol.1993 Oct；10l(4)：634-8)，那么，由于这些成纤维细胞和基质细胞之间的相互作用，角质化细胞将重建体毛或头发的形态(morphogenesis)(毛干)。
本发明另一主题涉及能着色的表皮等同物，其特征在于它由来自基质细胞的增生和分化的细胞组成。
该模型可通过其组织学特征进行鉴定：它包含含有三个或多个树突、围绕基础角质化细胞的小黑素细胞。
更具体地，本发明方法制备的表皮等同物，具有以下特征：能均匀且一致地着色，在体外以及移植后在体内都能重建健康肤色。
皮肤或表皮模型着色(由黑素细胞合成黑色素)可以用任何已知的方法量化， 特别是用所谓的Fontana Masson染色(Fontana Masson staining)。
不受限制，举例来说，着色可以通过以下方法观察和/或量化：
-利用计算机辅助图象分析，在多个染色的垂直剖面中测量黑素粒的数量；
-通过生化技术，测量培养物匀浆的黑色素含量；
-通过生化技术，测量培养物中所含的表皮酪氨酸酶活性；
-利用DOPA染色通过间接免疫荧光或电子显微技术，测量所存在的黑素细胞的数量及其在培养物中的位置；
-利用考虑不同色素与它们的理化状态之间的可变平衡的比色法，用仪器来测量颜色；
-任何其它可精确评估所获着色的强度的技术。
申请人也能证明移植后表皮等同物有利地具有这种着色能力。进一步地，所获得的着色均匀、一致并与原皮肤相同。
根据本发明的另一个主题，本发明涉及制备表皮等同物的试剂盒，其特征在于它包括基质细胞。
该试剂盒可进一步包括由置于支持物上的真皮等同物和适合基质细胞增殖和分化的营养介质组成的装置。
根据本发明的另一个主题，本发明涉及评估皮肤化妆或治疗化合物的试剂盒，其包括根据本发明方法获得的表皮等同物。
不考虑皮肤等同物制备所选的各种方法，表皮和/或皮肤等同物是三维模型，其可用作所有需要动物实验的检测的替代性检测，例如活性试剂释放性(release)、其皮肤渗透性(penetration)和/或吸收性(absorption)和/或生物利用度(bioavailability)的研究，化妆、药物或皮肤病学活性试剂和/或成分的耐受性(tolerance)、相容性(compatibility)及功效(efficacy)研究。
本发明的表皮和/或皮肤等同物，也可用于筛选化妆、药物或皮肤病学产品的自动化方法中以鉴定新活性试剂。
本发明的皮肤等同物也允许进行皮肤着色机理和头发和/或体毛生长的生理学研究。
由于本发明的表皮等同物重建皮肤的自然着色，所以其特别有利于测试去着色活性剂、着色活性剂及遮光剂。
这些应用可证明对光老化或老化是特别有用的，特别是当寻找能淡化“色 斑(age spots)”或雀斑(lentigos)或更通常可淡化皮肤肤色的产品时。
含毛囊的表皮等同物将尤其使实施体毛或头发生长动力学研究成为可能，由此使任何需要大量尽可能处于活体环境中的活毛发的研究成为可能，所述研究例如毛发循环和能影响该循环因素的研究，范围包括促进毛发生长的活性试剂研究，使得可以抵抗毛发脱落的活性试剂研究或者能减缓体毛生长的活性试剂研究。
借助活性黑素细胞的存在，该模型也允许研究能影响头发和/或体毛颜色的活性试剂，特别是通过诱导或抑制黑色素产生的活性试剂。
最后，该模型也使期望改变体毛和/或头发结构的活性试剂效果的研究成为可能。
筛选产品以鉴定新活性试剂的方法包括步骤(a)使所述测试产品与本发明的表皮等同物接触，和步骤(b)评估所述产品在表皮等同物上的效果。
根据本发明筛选方法的一个变体，将使用完整的皮肤模型。
优选地，对于步骤(a)的实施，将局部施用测试产品，例如配制于常规局部制剂中或加入培养介质中。
根据期望的效果，步骤(b)可以包括，但不穷举，与未接触测试产品的本发明表皮等同物(对照)进行比较；和/或观察表皮等同物着色或去着色的强度变化，任选地通过黑色素标记和定量(例如通过根据Fontana Masson法进行染色)，观察毛干生长的加速或减缓变化，任选地观察对毛发角蛋白制造的影响。
步骤(b)也可以通过分析表皮和/或真皮标记，例如结构蛋白，特别是真皮基质的大分子的表皮分化蛋白进行。
将在接触测试产品的表皮或皮肤等同物上所测的参数，与在相同条件下培养但未接收测试产品的对照表皮或皮肤等同物上所测参数进行比较。
当表皮或皮肤模型包括免疫系统细胞——朗格汉斯细胞时，筛选测试也能够用于鉴定能引起刺激或过敏反应的产品。
为此，筛选方法步骤(b)中所观察的参数将选自：
-细胞毒性；
-炎症介质释放；
-组织学或乳酸脱氢酶释放所揭示的细胞损伤(角质化细胞膜完整性的标记)(Roguet et al J Tox In vitro 6：303(1992)和Ponec M in In Vitro Toxicology Eds Rouggier，Maibach and Golberg p.107，1994)；
-皮肤脂质，特别是神经酰胺和磷脂的合成和组成改变(JID 86，598(1986))；
-作为它们分化标记的上皮细胞的分层(M Prunieras & R RoguetToxicologie cellulaire in vitro methods & applications Eds M Adolphe，AGuillouzo and F Marano eds INSERM 1995 p.191-236)(DUFFY PA，FLINTOP：In vitro dermal irritancy test.In CK Atterwill and CE Steele(Eds)：In vitromethods in Toxicology Cambridge Univ.Press Cambridge 1987，pp.279-297)(Use of skin cell culture for in vitro assessment of corrosion andcutaneous irrtancy，Roguet，Cell Biology and Toxicology，1999：15，63-75)。
表皮等同物也发现可用于制备准备移植到皮肤疾病患者上的移植物，所述皮肤疾病如烧伤、伤口愈合缺损、皮肤溃疡、牛皮癣，或色素疾病，如白斑病(vitiligo)、灰发症。
应用也涉及任何导致严重着色异常而可能设想通过移植纠正的疾病，例如先天或后天黑色素过少症或者黑色素过多症(Na GY，Seo SK，Choi SK.Single hairgrafting for the treatment of vitiligo.J Am Acad Dermatol.1998 Apr；38(4)：580-4)；事故原因，例如身体或面部大面积烧伤的皮肤(例如：三度烧伤患者)；外科原因，例如经受痣治疗切除的皮肤(Kumagai et al.，Ann Plast Surg.39：483-488，1997)或文身(tatoo)处理切除的皮肤(Kumagai et al.，An Plast Surg.33：385-391，1994)。
应用也涉及与基质变性相关的疾病。
在通过毛发的基质的显微解剖提取之后当由头皮部分制备时，本发明的皮肤等同物也使制备自体移植物成为可能，导致在活体内迅速形成均一着色的表皮。这些自体移植物可以涉及溃烂也可以涉及严重烧伤(Limat A，French LE，BlalL，Saurat JH，Hunziker T，Salomon D.Organotypic cultures of autologous hair folliclekeratinocytes for the treatment of recurrent leg ulcers.J Am Acad Dermatol.2003 Feb；48(2)：207-14)。
在这种具体情况下，所述重建皮肤也使得可以在受到白斑病困扰的患者中制备多处微自体移植物，从而与现有的使用含有很少黑素细胞的ORS细胞的条件相比，在较好的条件下使缺乏颜色区域重新着色。
对所有这些用途，本发明的皮肤等同物有着色自然的优点。因此，移植的皮肤区域更具美感，并且暴露于太阳再现正常的生理行为。
附图说明
图1示出基质细胞的显微解剖和培养。
图2示出本发明方法的重建皮肤的横截面。基质细胞移植8周后所获重建皮肤组织学外观。注意存在滤泡黑素细胞。
图3示出本发明方法的重建皮肤的横截面。基质细胞移植8周后所获重建皮肤。Fontana masson法标记黑色素存在。
具体实施方式
实施例I-着色皮肤模型的制备
Asselineau D，Bernard B，Bailly C，Darmon M.Epidermal morphogenesis andinduction of the 67kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at theliquid-air interface.
Exp cell Res.1985Aug；159(2)：536-9.
Asselineau D，Bernard BA，Darmon M.Three-dimensional culture of humankeratinocytes on a dermal equivalent A model system to study epidermalmorphogenesis and differentiation in vitro.Models dermatol，vol.3，pp.1-7(Karger，Basel 1987)
I-A-真皮等同物的制备
将成纤维细胞解冻，培养于成纤维细胞培养介质(MEM+10％FCS(胎牛血清))中，并用胰蛋白酶酶解(trypsinized)。
对于制备网架，使用解冻后12-13天的处于融合的细胞并制备以获得2×106个细胞/ml的在MEM Hepes 10％FCS中的细胞悬浮液。
培养介质的制备
MEM 1.76X
MEM 10X 17.6ml
7.5％NaHCO3 5.1ml
1.76mM L-谷氨酰胺 0.88ml
0.88mM丙酮酸钠 0.88ml
0.88X非必需氨基酸 0.88ml
8.8U/8.8μg/ml(0.088％)青霉素链霉素 0.088ml
0.04X(0.04％)抗真菌抗生素 0.044ml
无菌超纯水 75ml
MEM Hepes 10％FCS
MEM 25mM Hepes 50ml
2mM L-谷氨酰胺 0.5ml
1mM丙酮酸钠 0.5ml
1X 非必需氨基酸 0.5ml
20U/20μg/ml(0.2％)青霉素链霉素 0.1ml
0.1X(0.1％)抗真菌抗生素 0.05ml
10％FCS 5ml
NaOH 0.1N
10ml NaOH 1N
90ml无菌超纯水
该溶液通过具有0.22μm GV Durapore膜的Millipore过滤器
醋酸1/1000
0.5ml 100％冰醋酸
499.5ml无菌超纯水
制备网架
使用Gattefossé胶原
3.22ml MEM 1.76X
0.63ml FCS
0.35ml NaOH 0.1N
0.2ml MEM Hepes 10％FCS
体积＝4.4ml
向该溶液中加入0.5ml细胞悬浮液。
然后慢慢加入需要体积的冷胶原。
将Erlenmeyer烧瓶内容物清空至细菌盘Falcon 60mm。
将盘放置在培养器(37℃-5％CO2)中约1h 30min-2h。
使收缩进行3天。
然后接种基质细胞。
I-B-基质细胞的显微解剖和培养(接种)(图1)
来自于皮肤活检，将毛囊显微解剖并将其置于含培养介质Petri碟中。将上皮与真皮乳头球及连接鞘分离，并在真皮乳头顶点切下球状区；接着将该部分借助针施加轻压，置于位于无菌环内的真皮等同物上。连接鞘与基质细胞分离更加容易，不需使用蛋白水解酶，由此去除真皮部分，将基质细胞用3F培养介质培养1周。
I-C-制备重建皮肤
浸没培养7天后，将皮肤出浸(emersion)。
在显微镜下观察，查看角质化细胞离开网架的情况。
在Falcon细菌盘中，放置出浸格栅。
加7.5ml MEM 10％FCS+3F，避免形成气泡。
用无菌解剖刀切除待出浸皮肤周围的胶质(glue)。
用曲形镊子和细胞抬升器(cell lifter)，将皮肤转移至格栅上。
将盘置于37℃-5％CO2培养器中。
周三、周五更换介质(7.5ml MEM 10％FCS+3F)。
出浸7天后，将皮肤备用。
所用培养介质：MEM 10％FCS+3F
MEM 500ml
2mM L-谷氨酰胺 5ml
1mM丙酮酸钠 5ml
1X 非必需氨基酸 5ml
20U/20μg/ml(0.2％)青霉素链霉素 1ml
0.1X(0.1％)抗真菌抗生素 0.5ml
10ng/ml EGF 使用0.5ml 10μg/ml储存液
10-10M霍乱毒素(Cholera Toxin) 使用5ml l0-5M储存液
0.4μg/ml氢化可的松 使用0.4ml 0.5mg/ml储存液
10％FCS 50ml
图2、图3示出本发明方法的重建皮肤的横截面。
观察结果显示上面存在角质层的分层表皮，再现活体表皮。也可以看见图3的表皮包含黑色素。
实施例II-制备含毛囊的皮肤模型
在步骤I-A-中使用滤泡成纤维细胞重复实施例I所记载方案的实验条件。