技术领域
本发明属于微生物的培育方法，尤其是涉及一种培育茯苓的方法。
背景技术
茯苓为一种多年生腐生真菌，属于真菌门，具有药用价值，是一味常用大 宗中药。野生茯苓通常在海拔500米以上，生长在地下20厘米左右的腐朽的松 树根或松树段上。茯苓的生长发育可分为两个阶段，即菌丝生长阶段和菌核形 成阶段，菌丝生长阶段主要是菌丝从松木中吸收水分和营养，繁殖大量的营养 菌，当菌丝越积越多时就成为菌核，到形成菌核阶段时栽培上称为结苓阶段。 目前人工培育茯苓的方法主要有干段木栽培和松树根栽培，段木栽培法以松木 为栽培料，选择直径12厘米以上不成材的松树砍倒，在农历12月份砍下松树， 去树杈，削去形成层的外皮，露出木质部，削皮留筋，锯成60～80厘米长的木 段，堆码后干燥，约40天后，无松脂分泌，木心干燥后即可接种。松木段下窖 的时间在春季3-4月份，下窖选择晴天，每窖下松木段15-20公斤。接种方法 目前有三种较普遍采用，一是菌丝引种，将栽培菌种内长满菌丝的松木块取出， 顺段木形成的“V”缝，一块接一块平铺在上面，再撒上木屑等料种，然后将一 根段木削皮处向下压在松木块上，使其呈“品”字形。二是老段木引种，选黄 白色、筋皮下有明显菌丝且有小茯苓又有特殊香气的段木作种引。三是鲜茯苓 引种，选1-2代种苓，种苓皮色紫红，肉色白，浆气足，质结实，个重2-3公 斤的鲜苓作种引。将种苓切成小块或小片放于段木之间，每一窖需500克左右 鲜苓。接好种后，立即覆土，厚7-10厘米，使窖顶呈龟背形，以利排水。用松 树段木栽培茯苓要消耗大量木材。松树根栽培法为首先挖开根周围的土，露出 松根，将侧根刮开皮槽，曝晒数天，晒干后即可接种。于5-8月间在松根开槽 处接放菌种，用树叶将其盖好，覆土压实即可。接后每10天检查1次，发现病 虫害和白蚁要及时防治。9～12月茯苓膨大生长期要及时培土。第二年4-6月可 采收，此方法虽能节约大量材耗但产量低，不能满足需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可取代现有茯苓栽培种植用材，不需采伐树木， 易于推广，产量高的培育茯苓的方法。
本发明的技术方案在于，培育茯苓的方法采用菌种繁殖法。首先选取优良苓 种，其标准为品质好，无病虫害，个体较大，近球形，质地坚，皮红，肉白， 浆汁多，气味浓郁的茯苓菌核；然后进行母种保存和培养；最后在此基础上进 行原种和栽培种的制作和扩繁。其中母种的培养包括母种的分离和在培养基上 的接种培养，原种的制作是将母种接种在培养基上进行培养，栽培种的制作是 在培养基上进行发菌培养，具体工艺如下：
1、母种的分离和培养
母种分离方法为：用无菌水将种苓冲洗数次，再用纱布揩干，最后用75％ 酒精擦洗种苓外皮，并用0.1％升汞擦洗干净后，进行紫外线灭菌；在无菌条件 下，用无菌刀将种苓剖开，用酒精火焰灭菌后的接种铲从种苓较深部位取出黄 豆大小的苓肉，接入试管斜面上；
配制母种培养基，其组分为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克， 水1000毫升，另加0.5克酵母粉，0.5克蛋白胨，PH值为5.5-6.5；
母种的培养过程为：在温度28-32℃，培养2-3天，长出菌丝后，认定无杂 菌即可继续培养至菌丝长满斜面。
2、原种的制作
原种制作中用的培养基其配方为：松木屑76％，麸皮20％，糖2％，石膏粉 1％，过磷酸钙1％，含水量50％-55％，pH5.5-6.5；
其接种培养过程为：在无菌条件下，按常规将母种接入上述配制好的培养 基瓶中，置28-32℃温室中培养，经25-30天，菌丝长满瓶即为原种。
3、栽培种的制作
栽培种制作中所需的培养基配方为：松木片(2厘米×10厘米×0.3厘米) 65％，松木屑10％，麸皮20％，糖2％，石膏粉1％，过磷酸钙1％，尿素0.2％；
其发菌培养过程为：将上述配料按常规配制后装入15厘米×18厘米×0.005 丝米的聚乙烯塑料袋中，经灭菌接种后置28-32℃下培养，经25-30天，当菌丝 长满并深入至木片内后即可。
本发明提供的培育茯苓的方法，能培育出茯苓菌丝和茯苓菌核；由于在母种、 原种、栽培种的培养过程中，其培养基由人工配制而成，不需要天然松木，因 而不用采伐树木，可用于大批量生产，种植成本低。经试验，生产出的茯苓其 外形与现有商品茯苓一致，显微构造基本一致，多糖提取率相近，完全可替代 商品茯苓入药。这种茯苓种植用材代用品的开发，既能保证中医临床用药，又 有效地保护了森林资源，不失为中医药行业生产类似产品的一种行之有效的方 法。
具体实施方式
菌种培养的具体工艺如下：
1、选取优良苓种
其标准为品质好，无病虫害，个体较大，近球形，质地坚，皮红，肉白， 浆汁多，气味浓郁的茯苓菌核。
2、母种的分离和培养
母种分离方法为：用无菌水将种苓冲洗数次，再用纱布揩干，最后用75％ 酒精擦洗种苓外皮，并用0.1％升汞擦洗干净后，进行紫外线灭菌；在无菌条件 下，用无菌刀将种苓剖开，用酒精火焰灭菌后的接种铲从种苓较深部位取出黄 豆大小的苓肉，接入试管斜面上；
母种培养基的配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000 毫升，另加0.5克酵母粉，0.5克蛋白胨，PH值为5.5-6.5；
母种的培养过程为：在温度28-32℃，培养2-3天，长出菌丝后，认定无杂 菌即可继续培养至菌丝长满斜面。
3、原种的制作
原种制作中用的培养基的配方为：松木屑76％，麸皮20％，糖2％，石膏粉 1％，过磷酸钙1％，含水量50％-55％，pH5.5-6.5；
其接种培养过程为：在无菌条件下，按常规将母种接入上述配制好的培养 基瓶中，置28-32℃温室中培养，经25-30天，菌丝长满瓶即为原种。
4、栽培种的制作
栽培种制作中所需的培养基配方为：松木片(2厘米×10厘米×0.3厘米) 65％，松木屑10％，麸皮20％，糖2％，石膏粉1％，过磷酸钙1％，尿素0.2％；
其发菌培养过程为：将上述配料按常规配制后装入15厘米×18厘米×0.005 丝米的聚乙烯塑料袋中，经灭菌接种后置28-32℃下培养，经25-30天，当菌丝 长满并深入至木片内后即可。
茯苓菌种在松枝、木屑瓶内菌丝生长情况及试验数据如下：
2003年5月22日，将直径1厘米左右小松枝截短至15厘米，木屑分别浸 泡在营养液中，待浸透后捞出，分别放入瓶中，高压消毒后，5月30日接种茯 苓菌种，接种两天后菌丝开始生长，6月20日已形成菌索，8月9日已形成6× 3厘米不等的白色块状物，其质地致密，表面呈粉状。菌丝生长情况如下表：
表1茯苓菌丝在瓶内生长情况表 菌丝生长 松枝瓶数 木屑瓶数 松枝瓶数(％) 木屑瓶数(％) 菌丝呈块状 36 6 22.64 9.09 菌丝良好 93 51 58.49 77.27 有菌丝 11 5 6.91 7.58 无菌丝 19 4 11.95 6.06 总数 159 66
显微比较研究：
商品茯苓(购于成都市药材公司)，由茯苓成熟菌核分离得到茯苓菌丝为母 种(琼脂、马铃薯等)，由茯苓母种扩繁得到的茯苓菌丝为原种(木屑等)，由 茯苓原种扩大培养得到茯苓菌丝为茯苓栽培种(即新配方生长的茯苓菌丝、菌 核)。
1、商品茯苓的显微特征
商品茯苓的粉末用水装片，在显微镜下可观察到无色不规则的颗粒状团块 和分支状团块；用5％的NaOH溶液装片，可见团块溶化，露出菌丝，菌丝细长， 稍弯曲，有分支，呈无色或淡棕色。
2、茯苓菌丝母种的显微特征
茯苓菌丝母种的粉末，用水装片和5％的NaOH溶液装片观察到菌丝，菌丝细 长，稍弯曲，有分支，呈无色或淡棕色。
3、茯苓原种菌丝的显微特征
茯苓菌丝原种的粉末，用水装片时，可见到分支状团块，也可见到少量的 菌丝；用5％的NaOH溶液装片时，只能见到菌丝，菌丝细长，稍弯曲，有分支， 呈无色或淡棕色。
4、新配方生长的茯苓菌丝、菌核的显微特征
同上方法装片只能见到菌丝，菌丝细长，稍弯曲，有分支，呈无色或淡棕 色。与商品茯苓的显微特征基本一致。
提取工艺的确定：
茯苓水溶性多糖提取工艺的确定：选用复合方法提取茯苓水溶性多糖。即 将茯苓粉末(过40目筛)适量，用乙酸乙酯、丙酮于索氏提取器分别提取4小 时，药渣加入催化酶酶解，于60-70℃浸泡40分钟，再依次用5倍量、3倍量、 2倍量的沸水提取1小时。合并水提液，滤过，滤液浓缩至1/10，用Severge 法除蛋白。上清液加入三倍量的乙醇沉淀多糖，冷藏12小时，离心，收集沉淀， 低温干燥，即得。
茯苓碱溶性多糖提取工艺的确定：茯苓碱溶性多糖含量较高，提取方法相 对简单，所得提取率较稳定。即将水提后的药渣用稀NaOH溶液提取，碱提液离 心，所得上清液以10％的醋酸中和，3倍量乙醇沉淀，再提纯即得。综合考虑 了生产可行性及经济性，经反复试验后确定稀NaOH溶液用量为5倍量，提取2 次，每次4小时。
茯苓多糖的提取定量实验：
取低温烘干后的商品茯苓、母种、原种，新配方生长的茯苓菌丝、菌核适量 精密称定，按上述方法提取多糖，结果如下表：
表2茯苓多糖提取率 茯苓样品 提取率(％) 水溶性多糖 碱溶性多糖 总多糖 商品茯苓 新配方生长的菌核 新配方生长的菌丝 菌丝母种 菌丝原种 2.00 2.04 1.94 1.15 1.20 80.10 80.72 80.30 59.64 68.16 82.10 82.76 81.22 60.79 69.36
茯苓多糖含量测定：
采用苯酚—硫酸法，对商品茯苓、本发明新配方生长的茯苓菌丝和菌核、 茯苓菌丝母种、茯苓菌丝原种进行茯苓多糖含量测定。测定结果如下：
表3茯苓多糖含量测定结果 茯苓样品 商品茯 苓 新配方生长 的菌核 新配方生长 的菌丝 菌丝母 种 菌丝原 种 多糖含量 (％) 87.79 87.23 86.02 87.84 86.98
由上可见，该发明新配方生长的茯苓菌丝、菌核与商品茯苓比较，多糖提 取率相近，可代替商品茯苓入药，并且该发明新配方生长的茯苓菌丝、菌核的 培育成本低，可以大批量生产。