技术领域
本发明属生物制品领域，具体涉及一种麻疹腮腺炎风疹联合减毒活 疫苗的制备方法。
背景技术
1、疾病性质和流行情况
麻疹、流行性腮腺炎(简称腮腺炎)、风疹是由相应病毒引起的儿童 最常见的急性呼吸道传染病。世界卫生组织(WHO)报道全球每年麻疹发 病率3000-4000万例，死亡70多万。我国卫生部2005年和2006年两年 的全国疫情报告，麻疹发病人数22.27万例，腮腺炎发病56.25万例， 风疹发病6.24万例。这三种疾病近几年发病率高，不断在全国局部地区 暴发流行，风疹又可使孕妇早期感染而导致婴儿先天性畸型，即先天性 风疹综合征(CRS)。可见这三种传染性疾病仍严重威胁着儿童的身心健 康和我国优生优育基本国策。
为此，我国政府积极响应WHO的号召，承诺在2012年基本实现消除 麻疹的目标，同时今年起将腮腺炎和风疹纳入国家新扩大免疫预防的15 种疾病之内，财政将出资25亿用于采购针对包括麻疹、腮腺炎、风疹这 15种疾病的疫苗和预防接种，而且明确优先使用联合疫苗。
2、疫苗开发和使用情况
国外于上世纪70年代开发成功麻疹-腮腺炎、麻疹-风疹和麻疹-腮 腺炎-风疹联合减毒活疫苗(MMR)，以史克和默克两大公司为主的MMR于 上世纪90年代中进入中国市场。
国内上海生物制品研究所于上世纪60年代初分离麻疹病毒，研究成 功沪-191株麻疹减毒活疫苗。并于1993年对沪-191株毒种的纯化研究， 建立了纯化毒种的三级种子库，进一步提高了麻疹疫苗的内在质量。目前 已有近40年的生产历史，年产量可达6000万剂量，为全国之最，对预防 和控制麻疹的发病和流行发挥了十分有效的作用。上海生物制品研究所于 上世纪80年代初通过国际交往获得腮腺炎疫苗病毒，经研究建立S79腮 腺炎减毒株，是国内第一个开发出细胞培养的腮腺炎减毒活疫苗。目前年 产量可达1000万剂量，对控制腮腺炎的发病显示了十分有效的作用。上 世纪90年代中由北京生物制品研究所开发成功BRD II株风疹减毒活疫 苗。上海生物制品研究所通过与北京生物制品研究所技术交换，获得BRD II株风疹病毒，于1998年开发成功BRD II株风疹减毒活疫苗。目前年产 量可达1000万剂量，对防止风疹流行和CRS发挥了显著的作用。与此同 时，上海生物制品研究所响应WHO开发联合疫苗的倡导，于2000年开发 成功麻疹腮腺炎联合减毒活疫苗，并被纳入《中国药典》三部(2005年 版)药品标准。目前在上述的技术基础上，进一步开发麻疹腮腺炎风疹联 合减毒活疫苗(MMR)，现已完成临床研究及通过国家药审中心的技 术审评。
3、产品的水平和发展趋势
目前国内该产品的质量达到国际公认的WHO标准，生产工艺技术水平 也基本相同。但我国主要生产单价疫苗，联合疫苗刚起步，远远不能满足 社会需求。
发展趋势：WHO倡导的“全球儿童疫苗计划”，将开发联合疫苗作为 其中的一项主要内容。联合疫苗的优越性在于：将多种单价疫苗的功能集 于一个制品，发挥出一针防多病，减少针次，便于临床上推广使用，进一 步提高计划免疫工作的效果，还可节约预防工作的间接成本。国内近几年 才研究病毒类联合疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种国产化、价格低、减少针次、一针防三病， 用于儿童预防麻疹、腮腺炎和风疹的联合减毒活疫苗的制备方法。
本发明所述的一种麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗的制备方法，具 体通过以下步骤得以实现：1、用10日龄的无特定病原体(SPF)鸡胚制 成原代鸡胚细胞，采用10L瓶旋转培养成单层细胞，分别接种沪-191株 麻疹病毒和S79株腮腺炎病毒，经培养收集麻疹病毒液和腮腺炎病毒液， 再经外源因子等检定合格，通过澄清过滤合并成两种单价病毒原液；2、 用MRC-5株人二倍体细胞培养BRD II株风疹病毒，收获病毒液，经外源因 子等检定合格，通过澄清过滤合并成单价病毒原液；3、将合格的麻疹、 腮腺炎和风疹单价病毒原液按一定比例配制，加入冻干保护剂制成半成 品，最后分装冻干制成最终成品。
在上述麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗的制备方法中，麻疹、腮腺 炎和风疹单价病毒原液配制比例优选为麻疹:腮腺炎:风疹＝1:20:1，冻 干保护剂优选5％蔗糖、1％明胶、1％谷氨酸钠、0.5％尿素、0.5％人白蛋白。
通过本发明制备的麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗，其产品的质量达 到三种单价疫苗的国家标准，并且主要质量指标均达到WHO对麻疹、腮腺 炎和风疹联合疫苗的质量标准。
本产品与国外MMR同步进行的临床安全性和有效性比较：观察到的局 部和全身反应的发生率虽略高于进口产品，但都属于一般活疫苗可接受的 临床轻微反应；观察有效性的免疫后抗体阳转率和抗体滴度：麻疹分别为 99.5％和57(进口产品94.6％和46)；腮腺炎分别为85.9％和4.2(进口产 品89.2％和5.7)；风疹分别为100％和890(进口产品100％和825)；经统 计学处理均无显著性差异，说明该产品达到国际同类产品的质量。
具体实施方式
以下结合具体的实施例，对本发明做进一步的阐述。这些实施例仅用 于对本发明做说明而不是对本发明的限制。
实施例1：
高滴度的麻疹疫苗病毒原液的生产工艺：采用10L瓶细胞旋转培养 取代静止培养的方法，增加单层细胞贴壁面积，以细胞数量的增 加提高病毒滴度；改进细胞培养和病毒培养的pH和营养成分等 条件，以改善细胞质量提高病毒滴度；减少病毒培养的最终加液 量，以增加单位体积中的病毒量提高病毒滴度。
具体参数和比较结果列表如下：
实施例2：
高滴度的腮腺炎疫苗病毒原液的生产工艺：采用3L瓶细胞旋转培 养取代10L瓶旋转培养，进一步控制瓶内空间和pH变化，以改善 细胞质量提高病毒滴度；严格控制腮腺炎病毒繁殖的收获时间， 掌握细胞病变的最佳程度(细胞病变达80-90％)，以获得高滴度 病毒原液；减少病毒培养的最终加液量，以增加单位体积中的病 毒量提高病毒滴度。
具体参数和比较结果列表如下：
实施例3：
高滴度风疹疫苗病毒原液的生产工艺：采用进口罗氏瓶，调整细胞浓 度和培养液，以改进二倍体细胞质量，提高病毒滴度；探索细胞 及病毒培养的最佳条件，如病毒与细胞接种比例、细胞洗涤换液 的时间、收液时细胞病变的程度等，以此提高风疹病毒原液滴度； 在提高二倍体细胞质量的基础上，通过适当调整pH和控制培养 液成分及温度，有效延长细胞维持时间，从而可进行多次收液， 提高病毒原液产质量。
具体参数和比较结果列表如下：
病毒与细胞不同接种比例的病毒培养时间及滴度
可见病毒接种量高，病变出现早，病毒滴度高峰出现时间早， 则细胞维持时间短。而随着病毒接种量减少，病变出现及病毒滴 度高峰出现时间后移，细胞维持时间也延长。所以，根据生产需 要，采用1:100-1:1000的病毒接种比例较合适。
实施例4：
三种疫苗病毒原液联合配制的最佳比例和避免三种病毒的相互干扰 作用：
1、根据稀释倍数确定单价病毒原液的最低病毒滴度：将单价麻疹、 腮腺炎、风疹三种病毒原液分别用不同体积的M199维持液做配制比例试 验，并进行病毒滴度测定，以了解病毒滴度下降幅度，确定三种病毒原液 的最低滴度。结果如下：
可见三种疫苗原液1:1配比病毒滴度下降0.4-0.61gCCID50/ml，1:2 配比病毒滴度下降0.7-0.91gCCID50/ml，1:3配比病毒滴度下降 0.9-1.11gCCID50/ml，1:4配比病毒滴度下降1.4-1.61gCCID50/ml。考虑国 际上MMR最低免疫的病毒含量(麻疹和风疹3.31gCCID50/ml，腮腺炎 4.01gCCID50/ml)，以及加冻干保护剂的稀释和热稳定性的病毒损失等 因素，确定三种疫苗原液的最低病毒滴度为：麻疹≥ 5.01gCCID50/ml，腮腺炎≥5.51gCCID50/ml，风疹≥ 5.01gCCID50/ml。
2.观察三种病毒之间的干扰现象及确定三种病毒原液的配 比：用同一批单价原液配制三批不同比例的MMR，并以单价原液 用M199维持液作相应配制稀释的对照，分别滴定配制前后的病毒滴度， 结果如下：
麻疹、腮腺炎、风疹三种病毒混合前后的滴度比较(1gCCID50/ml)
可见三种疫苗原液配比后相互之间稀释倍数的病毒滴度下降，2、3、 4和5倍稀释分别为0.61g、0.8-0.91g、0.9-1.11g和1.4-1.51g而相应 稀释倍数的对照病毒滴度下降与MMR配比时基本一致，说明滴度下降 由相互稀释造成，三种病毒之间无明显干扰现象。
根据WHO规程要求MMR中腮腺炎病毒量至少比其他两种病毒高 5-20倍，并兼顾三者相互的稀释作用，最后确定产品的三种病毒含量 适宜配比为1:20:1(麻疹:腮腺炎:风疹)。
实施例5：
优化冻干保护剂及冷冻干燥技术：疫苗的冻干保护剂及冻干工艺是在 三种单价疫苗的经验基础上，调整冻结、抽真空和保温时间等的冻干工艺 曲线，获得较满意的结果。
保护剂的优选采用蔗糖、乳糖、山梨醇、味精、明胶、尿素、人白蛋 白等成分，按不同种类和浓度配制成20组进行试验，结果第5号保护剂 (由蔗糖、明胶、味精、尿素、人白蛋白组成)较优越。以后经过调整冻 干工艺进一步证实了该保护剂的适宜性，并推广应用于麻疹腮腺炎联合减 毒活疫苗的冻干工艺得到进一步验证，使产品尤其在37℃7天的热稳定性 中具有明显的优越性。
试制的三批MMR冻干前后的滴度(1gCCID50/ml)变化如下：
可见冻干前后麻疹、腮腺炎、风疹平均滴度下降分别为0.471g、 0.631g和0.431g，37℃7天热稳定性滴度下降分别为0.371g、0.631g 和0.201g。所以，该保护剂同样适用于MMR。
实施例6：
MMR制备及检定：按上述工艺制备10批产品，以单价麻疹、腮腺炎、 风疹疫苗的制检规程标准检定全部合格，其中的7批由中国药品生物制品 检定所检定，结果也全部达到规程要求。
10批MMR的主要质量项目的检定结果
中国药品生物制品检定所对7批MMR的主要质量项目的检定结果
与同类制品比较研究资料：用试制的3批疫苗与北京生物制品研究所 生产的2批及进口(默克公司)1批的MMR，进行成品质量同时全检的比 较试验。
3批疫苗与同类制品比较的检定结果
以上检测结果表明，本发明所研制的3批疫苗的成品质量与北京所和 进口默克疫苗无明显差异，各项指标均达到规程的要求。