技术领域
本发明涉及植物领域，具体是涉及一种提高栽培红豆杉中紫杉烷 类化合物含量和产量的方法。
背景技术
红豆杉(Taxus spp.)，俗称“水松”，国家一级保护植物，含紫杉烷 类化合物，其次生代谢化合物紫杉醇是治疗乳腺癌和卵巢癌的特效药，对 肺癌、卡波氏肉瘤等其它多种恶性肿瘤也有很好的疗效，是当今世界上公 认的广谱、强活性抗癌药；可特异地促进微管蛋白的聚合，阻断细胞分裂， 是细胞学研究的得力工具。紫杉醇在生长缓慢的红豆杉中含量很低，提取 分离的成本很高，价格非常昂贵。临床和科研需求的日益增加使许多地方 的红豆杉大面积地消失，导致本来有限的自然资源更加匮乏。为此，国内 外许多政府机构、医药公司及个人已投入了巨额资金，建立了药用林，以 定期采集枝叶，相对稳定地获得紫杉醇及其10-deacetylbaccatin III、 Baccatin III等化学半合成前体，这也与保护野生资源的利益一致。
但是很多盲目性的投资和种植园建设导致了很严重的问题。据调查， 红豆杉中紫杉醇含量很低，且随品种、年龄、季节的不同而变化，在国内 一些地方栽培的红豆杉枝叶中检测不到紫杉醇，已造成了资源、财力、人 力和物力的浪费。紫杉烷类化合物在红豆杉中合成量非常小甚至于不合 成，相关的酶活力也很低。因此，能否找到一种提高红豆杉紫杉烷类化合 物含量的方法显得特别重要。迄今，尚未有对栽培的红豆杉小树施以 不同浓度铜化合物的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对上述红豆杉中紫杉烷类化合物含量低的 问题，提供一种可以提高栽培红豆杉中紫杉烷类化合物含量的方法。
本发明通过大量的实验研究，发现在适宜栽培红豆杉的条件下施 入适量的Cu2+可以提高红豆杉中紫杉烷类化合物的含量。在土壤栽培 中，在每株红豆杉的根部施入0.00002～0.0002摩尔的含铜化合物可以 明显提高紫杉烷类化合物的含量，含铜化合物的最佳施入值为0.0002 摩尔/株。在水栽培中，在红豆杉水培养液中施入含铜化合物，使其 水培养液Cu2+浓度为0.0001～0.001mol/L，可以明显提高紫杉烷类化 合物的含量，Cu2+浓度的最佳值为0.001mol/L。
上述红豆杉为2～3年生的曼地亚红豆杉或南方红豆杉。
上述含铜化合物为CuSO4·5H2O。
对于植物Cu2+是必要的微量元素，作为很多酶的活化剂和辅酶参 与很多氧化还原反应。当以大剂量施加于植物时，铜往往导致氧化胁 迫或各种活性氧因子的产生。而氧化逼迫或各种活性氧因子具有细胞 毒性，致使光和与呼吸作用、酶活性、DNA构型和膜的完整性发生 变化，而这些变化又都可进一步的抑制植物的生长。在本研究中，施 用的剂量大时都会导致植物生长受阻和针叶枯死，尤其是老叶。
栽培试验的结果显示，适当剂量的Cu2+能大大提高10-脱酰基巴 卡丁III的含量和产量。基于紫杉烷类化合物的生物合成途径，可以推 测Cu2+应能够通过提升10-脱酰基巴卡丁III水平提高紫杉醇的含量。
本发明的有益效果：本发明通过大量的实验研究，发现在栽培红 豆杉过程中施入适量的Cu2+可以提高红豆杉中紫杉烷类化合物的含 量，从而缓解了红豆杉中紫杉烷类化合物的含量低的难题。由于紫杉 烷类化合物具有极高的经济价值，本发明的应用前景广阔。
附图说明
图1为不同剂量的Ag+和Cu2+盐处理的各栽培实验组紫杉醇和10-脱酰 基巴卡丁III含量的柱状图；
图2为不同剂量的Ag+和Cu2+盐处理前后的各栽培实验组每棵树苗的 鲜生物量均重柱状图；
图3为不同剂量的Ag+和Cu2+盐处理的各栽培实验组总的紫杉醇和10- 脱酰基巴卡丁III产量柱状图；
图4为水培Taxus wallichiana var.mairei小苗的图片；
图5为不同浓度的Cu2+处理的水培红豆杉组紫杉醇和10-脱酰基巴卡 丁III的含量图；
图6为不同浓度的Cu2+处理前后红豆杉实验组和对照组每棵小苗平均 鲜生物量重柱状图；
图7为用含不同浓度Cu2+盐的培养基处理的各栽培Taxus wallichiana var.mairei小苗实验组总的紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁III产量的柱状 图；
其中，图4中，a：浓度为10-2M Cu2+的培养基栽培的小苗的根；b：浓 度为10-3M Cu2+的培养基栽培的小苗的根；c：对照栽培的小苗的根； d：浓度为10-3M Cu2+的培养基栽培的小苗的茎和叶；e：对照组小苗 的茎和叶。
具体实施方式
实施例1土壤栽培
1.植物材料和处理
野外栽培实验的材料是于2003年5月从成都植物微繁有限公司 购买的二年生曼地亚红豆杉(Taxus×media)小树，种植在广东省清远 市连山县上草镇红豆杉实验园中(海拔647m)。每棵植株于2003年5 月26日栽培时进行了第一次称鲜重并于2004年5月26日连根挖出， 用水冲干净土壤基质后再次称鲜重。种植的土壤疏松肥沃，适合红豆 杉的生长。
实验设置了14组Taxus×media小树，每组20棵，12组用于实 验，2组用于作对照。每个实验组都施加了不同剂量的蓝矾溶液(见 表1)。2004年3月26日采集了每组中每棵植株枝叶，合成混合样品。 每组新鲜样品都在通风的地方阴干，并磨成粉末用于下一步的化学分 析。样品的干鲜生物量重量的比率亦经过测量后作了估算(见表2)。
表1 Taxus×media小树的土壤栽培中对各实验组中每棵小树的蓝矾施用量。
重金属盐 处理
化合物 10-1M Cu2+ 10-2M Cu2+ 10-3M Cu2+ 对照
CuSO4·5H2O 500mg/plant 50.0mg/plant 5.00mg/plant -
各种剂量的蓝矾都用20ml水溶解，于2003年7月1日，即移栽的一个月之后，一次性施加 于每个试验组的每一株植株。
表2 Taxus×media样品的干/鲜生物量重比率估测
样品序号 1 2 3 4 平均±标准误
鲜生物量重 40.00 40.00 40.00 40.00 40.0±0.00
干生物量重 16.12 15.88 16.56 15.92 16.12±0.31
干/鲜生物量重比率 40.3％ 39.7％ 41.4％ 39.8％ 40.3±0.78％
2.结果和结论
如表3所示，高剂量下蓝矾都明显地抑制Taxus×media小树生 物量的积累，小剂量下则对其影响轻微。与细胞培养中出现的结果不 同，额外施加AgNO3不同程度上降低了两种紫杉烷类的含量，尤其 是大剂量施加时，如图1、2、3所示。虽然大剂量的时候也会有负作 用，铜盐作为肥料的添加剂适量施用能不同程度的提高两种紫杉烷类 的含量和产量，(表3和图1、3)。各组紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁III 产量由各组估算的干重和含量估算。栽培实验各组总的干重是根据总 的鲜重和平均干/重比率的乘积估算的，估测平均干/鲜重比率见表2。 施加50.0mg CuSO4·5H2O/株的组，10-脱酰基巴卡丁III的含量和 产量分别显著地提高了37.9±0.3％和35.6±2.5％。
表3土壤栽培的Taxus×media每株的平均生物量鲜重(g)和每组紫杉烷类化合物的含量
处理 顺序 平均鲜重(g) 紫杉烷类含量(％)
移栽前 采样时 紫杉醇 10-DAB III
10-1M 1 1.89±0.55 5.01±0.65** 0.0380±0.0014** 0.0218±0.0012
Cu2+ 2 2.06±0.40 4.39±1.10** 0.0386±0.0020** 0.0210±0.0015
10-2M 1 2.11±0.45 6.22±0.86 0.0517±0.0031 0.0290±0.0014**
Cu2+ 2 2.00±0.39 6.38±1.18 0.0508±0.0027 0.0285±0.0020**
10-3M 1 1.95±0.52 6.51±1.05 0.0496±0.0025 0.0254±0.0013**
Cu2+ 2 2.04±0.48 6.33±1.31 0.0502±0.0016 0.0243±0.0019**
Control 1 2.04±0.31 6.34±0.99 0.0489±0.0044 0.0207±0.0020
2 1.97±0.43 6.47±1.07 0.0494±0.0028 0.0210±0.0016
每纵行中数据与对照的t-检验，**1％和*5％水平。
实施例2水栽培
1.植物材料和处理
用于水培实验的一年生Taxus wallichiana var.mairei树苗2003 年6月24日购买于中国广东省北部的大东山自然保护区。所有用于 实验的小苗是根据相似的高度，近似的生物量进行筛选的。用双蒸水 冲洗掉根系中的土壤基质，并且处理时尽可能地减少了对根部的伤 害。然后将植株转移到32公升(17(高)×65(长)×29(宽)厘米)盛满相应 处理培养液的塑料容器中，培养基中用气泵连续不断地、均匀地通以 气体，培养基塑料容器的塑料板上穿有直径6厘米的10个孔洞。每 棵植株用中间劈开带有小孔的橡胶塞固定于一个长孔中，每两棵水培 的Taxus wallichiana var.mairei小苗相距10厘米。各种处理的塑料容 器随机放置于遮阴棚下，每个处理设两个重复，每个重复10棵小苗。
所有水培植株全部都水培于Hogland培养液(Hoagland and Amon，1950)中，根据实验处理的不同额外施加不同剂量的 CuSO4·5H2O(见表4)。为了避免盐分沉淀以及营养匮乏，每个月 更换培养液，并且定期补加双蒸水以维持培养液的浓度和体积。所有 营养溶液的pH值是用Sartorius pH测量仪测量，用NaOH和HCl溶 液调节pH值至5.5～6.0。
表4水培的Taxus wallichiana var.mairei小树Hogland培养液中CuSO4·5H2O的添加量
处理 10-2M Cu2+/L 10-3M Cu2+/L 10-4M Cu2+/L 空白对照
CuSO4·5H2O 2.5g/L 0.25g/L 0.025g/L -
“-”表示末加CuSO4·5H2O的处理。所有处理组均用Hogland培养液(Hogland培养液每 升含：490mg MgSO4·7H2O，950mg Ca(NO3)2·4H2O，610mg KNO3，120mg NH4H2PO4， 0.45mg MnCl2·4H2O，0.03mg ZnCl2，0.01mg CuCl2·2H2O and 0.006mg Na2MoO4·2H2O)。
水培植株上方1米处覆盖以透明的塑料板，并且于其上再覆盖以 透光率为40％左右黑色的遮阳网，使之生长于光照强度为 1813.4±226.7MJm-2year-1的环境中。植株从2003年6月24日到2004 年6月26日在环境温度下水培了367天。每棵植株在2003年6月 26日水培之前进行了称重，并且于2004年6月26日收获时再次称 重。所有的新鲜植株在通风干燥的环境中风干并磨成粉末用于随后的 化学分析。
2.结果和结论
对于水培的Taxus wallichiana var.mairei小苗，其生长都依Cu2+的浓度的不同而不同程度地受到抑制。与对照相比，根的伸长强烈受 阻，针叶出现黄白色。根不但明显的偏短，而且尖端苍白膨大(图4)。 水培培养液中Cu2+的浓度为10-4Mol/L时能显着地分别提高红豆杉 10-脱酰基巴卡丁III的含量和产量11.1±1.27％和10.0±3.53％，同时紫 杉醇的含量和产量也有轻微但不显着的增长(表5，图5，7)。当培 养基中Cu2+的浓度最高，即为10-2M时，紫杉醇与10-脱酰基巴卡丁 III的含量和生物量鲜重都会显着下降。当培养基中Cu2+的浓度为 10-3M时10-脱酰基巴卡丁III的含量提高了42.4±0.7％之多，同时轻 微地提高了紫杉醇的含量，但也显着地抑制了植株的生长。各组紫杉 醇和10-脱酰基巴卡丁III产量由各组干重(见表6)和含量估算。
表5水培Taxus wallichiana var.mairei小苗各组每株平均鲜生物量重(g)和各组紫杉醇与 10-脱酰基巴卡丁III的含量
处理 顺序 平均鲜重(g) 紫杉烷类含量
移栽前 采样时 紫杉醇 10-DAB III
10-2M Cu2+ 1 1.54±0.33 2.66±0.47** 0.0121±0.0015** 0.0298±0.0028**
2 1.62±0.28 2.54±0.51** 0.0118±0.0013** 0.0281±0.0019**
10-3M Cu2+ 1 1.56±0.25 4.38±0.61** 0.0218±0.0024* 0.0784±0.0051**
2 1.48±0.22 4.46±0.54** 0.0227±0.0011* 0.0772±0.0035**
10-4M Cu2+ 1 1.59±0.39 8.14±0.80 0.0208±0.0016 0.0605±0.0037**
2 1.60±0.31 7.98±1.06 0.0212±0.0010 0.0612±0.0021**
对照 1 1.55±0.27 8.02±0.96 0.0207±0.0028 0.0549±0.0039
2 1.51±0.35 8.25±1.20 0.0197±0.0016 0.0544±0.0046
每纵行中数据与对照的t-检验，**1％和*5％水平。
表6各实验组和对照组的总的生物量干重，水培组的干重都是鲜植株用电烤箱在60℃下 烤至恒重。
处理 10-2M Cu2+ 10-3M Cu2+ 10-4M Cu2+ 对照
重复1 10.67 17.59 32.31 31.78
重复2 10.34 18.12 31.47 32.95
总之，在合适的剂量处理下，Cu2+能促进栽培的红豆杉小树紫杉 烷类化合物的产量但Ag+达不到这种效果，Ag+在各种剂量处理下都 因剂量施加的不同而不同程度地抑制了紫杉烷类化合物的合成和红 豆杉植株的生长。CuSO4·5H2O在红豆杉的栽培中显示了比较好的应 用前景。