技术领域：
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及维拉帕米脂质体及其制备方法。
背景技术：
维拉帕米为芳烷基胺类钙拮抗剂，通过调节心肌传导细胞、心肌收缩 细胞以及动脉血管平滑肌细胞细胞膜上的钙离子内流，发挥其药理学作用， 但不改变血清钙浓度。维拉帕米常用于治疗变异型心绞痛、不稳定性心绞 痛、慢性稳定性心绞痛；与地高辛合用控制慢性心房颤动和/或心房扑动时 的心室率；预防阵发性室上性心动过速的反复发作；原发性高血压。
随着对其药理学研究的不断深入，维拉帕米的临床应用也日趋广泛。 如：治疗支气管哮喘、肝硬化、偏头痛、躁狂症等。近年来，发现了其对 眼部的药理作用，并逐渐受到重视，主要有：
1.抗青光眼：研究证实，维拉帕米能有效降低青光眼患者眼压。 Abelson等对15例患有青光眼而未接受任何治疗的志愿者局部滴眼0.125％ 的盐酸维拉帕米40μL，30min后检查发现眼内压有了显著的下降，进一步 研究表明这种作用能够持续10小时。Goya1等的研究发现，三次/d，共两 周局部滴眼的0.125％盐酸维拉帕米溶液能持续地降低青光眼患者的眼内 压，而对全身血压的降低作用很小。
2.抗白内障：维拉帕米作为一种Ca2+通道阻滞剂能阻止房水中Ca2+进入晶状体内，因而可以有效减少Ca2+在晶状体内的堆积，阻止或延缓Ca2+堆积而造成的代谢紊乱，减轻白内障的发生和发展，可望成为治疗白内障 的新药。Ettl等研究证实，0.2％盐酸维拉帕米滴眼液能够有效抑制糖尿病 型白内障的发展。Bardak等的研究表明大鼠皮下注射维拉帕米可防止辐射 导致的晶状体内钙离子、镁离子和铁离子浓度升高，提示维拉帕米对辐射 导致的白内障有潜在的保护作用。钟一声等研究了维拉帕米在半乳糖性白 内障形成和发展过程中的作用，结果表明皮下注射维拉帕米能够抑制晶状 体混浊的形成，且降低了晶状体中Ca2+的含量。王祥群等的研究显示，维 拉帕米对地塞米松诱发的白内障具有阻断作用。
3.其他：除白内障和青光眼外，盐酸维拉帕米等钙拮抗剂在防治增 生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、特发 性眼睑痉挛、视网膜中央动脉阻塞及眼部肿瘤的实验研究中也显示了较广 阔的前景，将会在眼科领域得到越来越多的应用。
由于人眼的特殊生理结构，普通滴眼液滴眼后损失很大，在泪液的冲 刷作用下迅速流失，保留时间仅几分钟，生物利用度很低，一般不超过5％。 而且长期、频繁给药时会导致全身吸收的药量增加，副作用增加。
为了改善常规局部滴眼制剂的缺陷，而兴起了眼部给药系统(Ocular Drug Delivery System)的研究，其重点在于使药物具有缓、控释和长效 作用，增加药物的角膜透过性，增加生物利用度，降低副作用等。
对于青光眼和白内障的治疗，要求药物滴眼后能够有效透过角膜，在 房水中达到一定的治疗浓度。且青光眼和白内障的防治过程较长，需要长 期给药。因此要求给药系统具有缓释和长效作用，尽量减少滴眼次数，减 少全身副作用和对眼部的刺激性。综上所述，维拉帕米眼部给药系统至少 应具有以下三个特点：1)增加药物的角膜透过性；2)延长药物的作用时 间，减少用药频率；3)无毒无刺激性。
脂质体作为新型药物载体，是近年来药剂领域的一个研究热点，具有 极强的实际应用价值。脂质体作为药物载体，能够：(1)增强药物的溶解性； (2)减低药物毒性；(3)赋予药物靶向性；(4)增加药物的缓释作用；(5)保 护药物，提高药物的稳定性；(6)通过膜融合作用将药物送入细胞内部，实 现细胞内给药。近年来，脂质体作为眼用药物的载体的研究和应用日益受 到关注。脂质体释药机制独特，可通过融合作用使药物透过角膜上皮细胞。 脂质体能够起到药物储库的作用，实现缓释和长效给药，且脂质体具有一 定的生物黏附性，能增加药物与角膜的接触时间，因此有利于药物的角膜 透过；尤其地，脂质体具有优良的生物相容性和可降解性，对眼部组织无 毒无刺激性，不影响眼部的正常生理功能，是优秀的眼部给药系统。因此， 将维拉帕米制成脂质体滴眼液，可实现药物的缓释和长效作用，减少用药 次数，减少药物浓度的波动，提高药物的生物利用度，降低药物的毒副作 用，提高患者的顺应性。中国专利CN1206987C将非甾体抗炎药吲哚美辛制 备成脂质体滴眼液，大大减少了滴眼后眼部的灼烧感及刺痛感，疗效优于 普通吲哚美辛滴眼液。
壳聚糖是天然的阳离子聚多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解 性，已有用于眼部给药系统的研究。壳聚糖用于眼部给药时，具有良好的 生物膜黏附性和渗透促进性。使用壳聚糖对脂质体表面进行修饰，可结合 二者的优势，同时发挥壳聚糖独特的生物黏附性、增渗性和脂质体的膜融 合性、缓释性与较大的载药量的特点，因此，壳聚糖修饰的维拉帕米脂质 体相对于普通脂质体，具有更高的生物利用度，能更好地发挥药物的眼部 治疗作用。
发明内容：
本发明的目的是提供一种具有缓释和长效作用的维拉帕米脂质体及 其制备方法。
本发明的维拉帕米脂质体，含以下组分及重量百分比：
维拉帕米 0.01％-50.00％
磷脂 10.00％-99.99％
胆固醇 0.00％-65.00％
壳聚糖 0.00％-89.99％
壳聚糖衍生物 0.00％-89.99％
阳离子脂质 0.00％-89.99％
抗氧剂 0.00％-40.00％。
本发明的维拉帕米脂质体，其中维拉帕米可以是外消旋体(RS-)维 拉帕米、左旋(S-)维拉帕米和右旋(R-)维拉帕米中的任何一种，或其 中任何一种的盐酸盐、乳酸盐、硫酸盐、硝酸盐、枸橼酸盐、马来酸盐、 酒石酸盐或重酒石酸盐等。
本发明的维拉帕米脂质体，其中磷脂可以是两条脂肪烃链各含有8至 26个饱和或不饱和碳原子的天然来源、人工合成、人工半合成或人工修饰 的磷脂类物质，可以是大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化 蛋黄卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、 磷脂酰肌醇或烷基醚磷脂酰胆碱等，或其中任何一种的衍生物。衍生物可 以是聚乙二醇修饰的磷脂等，例如聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (PEG2000-DSPE)。可选用上述磷脂中的一种或任意几种的混合物来制备维 拉帕米脂质体。
本发明的维拉帕米脂质体，可使用壳聚糖或壳聚糖衍生物对脂质体表 面进行包覆或修饰。
本发明的维拉帕米脂质体，其中阳离子脂质可以是硬脂酰胺、十八胺、 2，3-二油酰氧丙基-1-溴化三甲胺(DOTMA)、1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷 (DOTAP)、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)或N’，N’-二甲氨基乙基-3-氨 甲酰基胆固醇(DC-Chol)等。可选用上述任意一种或任意几种的混合物。
本发明的维拉帕米脂质体，其中抗氧剂为氢醌、羟基香豆素、维生素 E、维生素C、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸棕榈酸酯、没食子酸烷酯、丁羟 基茴香醚(BHA)、丁羟基甲苯(BHT)、去甲二氢愈创木酸、亚硫酸钠、亚 硫酸氢钠、焦亚硫酸钠或硫代硫酸钠等。可选用上述任意一种或任意几种 的混合物。
本发明的维拉帕米脂质体，可进一步加入渗透压调节剂，渗透压调节 剂为：氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、甘油、玻璃酸钠或透 明质酸等。可选用上述任意一种或任意几种的混合物。
本发明的维拉帕米脂质体，可进一步制备成滴眼液或注射液，并可加 入冻干保护剂(赋形剂)进一步制备成冻干制剂，其中冻干保护剂(赋形 剂)为蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、甘露醇 或亮氨酸等。可选用上述任意一种或任意几种的混合物。
本发明的维拉帕米脂质体，可进一步制备成凝胶剂，其中凝胶基质为 卡波姆(carbomer)、泊洛沙姆(Poloxamer)、羟丙甲纤维素(HPMC)、海藻酸 盐、乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、甘油、丙二醇、壳聚糖、 琼脂、西黄蓍胶、明胶或淀粉等。可选用上述任意一种或任意几种的混合 物。
本发明的维拉帕米脂质体的制备方法如下：
一、脂质体的制备：维拉帕米脂质体可以通过以下四种方法制得：
1.硫酸铵梯度法：将处方量的磷脂、胆固醇、去氧胆酸钠和抗氧剂 溶于少量乙醇中，缓慢注入到一定温度、磁力搅拌下的一定浓度的硫酸铵 溶液中，保温一定时间使乙醇挥发完全，超声或匀质处理，即得空白脂质 体。将所得空白脂质体置于透析袋中，两端扎紧，置于一定量的水相中透 析除去脂质体外水相中的硫酸铵。将透析好的空白脂质体于一定温度下、 在搅拌下加入一定量的维拉帕米水溶液，继续保温一定时间，调整终体积， 即得。
2.薄膜分散法：取处方量的维拉帕米、磷脂、胆固醇、去氧胆酸钠 和抗氧剂，以适量有机溶剂溶解，置于圆底烧瓶中，于一定条件下旋转蒸 发除去有机溶剂，使之在瓶壁上形成一层均匀、干燥的薄膜，充氮气，真 空干燥过夜。所得薄膜加入一定量的水相，在一定条件下充分水化，超声 或匀质处理，即得。
3.乙醇注入法：将处方量的维拉帕米、磷脂、胆固醇、去氧胆酸钠 和抗氧剂溶于少量乙醇中，缓慢注入到一定温度、磁力搅拌下的一定浓度 的硫酸铵溶液中，保温一定时间使乙醇挥发完全，超声或匀质处理，即得。
4.逆相蒸发法：将处方量的磷脂、胆固醇、去氧胆酸钠和抗氧剂溶 于适量乙醚中，将处方量的维拉帕米溶于适量水相中。将二者混合，剧烈 振摇、超声使之形成W/O型乳剂，倒入圆底烧瓶中，于一定条件下旋转蒸 发，小心控制蒸发速率，当混合物达到粘稠的胶态时，再加入适量水相， 继续旋转蒸发除去残余乙醚，超声或匀质处理，即得。
二、壳聚糖或其衍生物对脂质体的包覆：
将壳聚糖或其衍生物在一定条件下溶于水中，将一定量此溶液滴加至 制备好的维拉帕米脂质体混悬液中，在搅拌下，调整体系的pH值至7.0， 继续搅拌均匀即得。
本发明的维拉帕米脂质体，制成滴眼剂时，其推荐的药物浓度为2.5 mg/mL；制成注射剂时，其推荐的药物浓度为5mg/mL。
本发明使用壳聚糖或其衍生物对脂质体表面进行修饰，并将其应用于 眼用制剂，能够进一步增加脂质体的角膜滞留性，显著提高药物的角膜透 过量，相对于普通脂质体具有明显的优势，是非常具有实用价值的眼部给 药系统。
本发明所研制的维拉帕米脂质体，其包封率可达99.7％，粒径分布均 匀，可达到静脉注射或局部药用标准。其稳定性良好，4℃下充氮气储存， 6个月内稳定性良好，其包封率、粒径与外观均无显著变化，并且可以通 过制成冻干品进一步提高其稳定性。同时，本发明所采用的空白脂质体- 硫酸铵梯度载药制备工艺非常适合工业化大生产，有非常广阔的产业化前 景。
动物实验研究结果表明，本发明的维拉帕米脂质体，具有缓释和长效 作用，能够提高药物的生物利用度，减少药物浓度的波动，因此能很好地 发挥维拉帕米的抗青光眼和抗白内障等作用，较之普通滴眼液具有明显的 优势。动物实验具体如下：
1.家兔离体角膜透过性实验
目的：研究眼用制剂的角膜透过性。
动物：新西兰白兔，体重2.5-3.0kg，雌雄不限。
试药：维拉帕米脂质体(实施例1)、维拉帕米壳聚糖包覆脂质体(实 施例2)、维拉帕米生理盐水溶液(2.5mg/mL)。
方法：采用改进的Franz立式扩散池为实验装置，如图1所示，它由 供给池和接受池组成，内径0.90cm，有效扩散面积0.70cm2，接受池7.8 mL。将家兔耳缘静脉注射空气处死，立即分离角膜，置于扩散池的供给池 与接受池之间，接受池中装满谷胱甘肽-碳酸氢钠林格溶液作为扩散介质， 供给池中加入供试品2mL，置于34℃恒温磁力搅拌器中，于不同时间点取 样，样品经0.22μm微孔滤膜过滤后，HPLC测定，计算累计透过量。
结果：实验结果见图2。在6小时内维拉帕米的角膜透过量为壳聚糖 包覆脂质体＞脂质体＞滴眼液，证明本发明的脂质体能够有效促进维拉帕 米的角膜透过性，使更多的药物透过角膜到达房水，提高药物在房水中的 浓度，从而更好地发挥药效。
2.家兔在体角膜滞留性实验
目的：研究眼用制剂对角膜的黏附性。
动物：新西兰白兔，体重2.5-3.0kg，雌雄不限。
试药：维拉帕米脂质体(实施例1)、维拉帕米壳聚糖包覆脂质体(实 施例2)、维拉帕米生理盐水溶液(2.5mg/mL)。
方法：给药时，将家兔固定，轻轻拉开眼睑使与眼球成袋状，分别用 微量加样器滴入脂质体或滴眼液150μL，再轻轻放开下眼睑，使药物不 会溢出。给药后，于不同时间点，用已称重的定量滤纸条(5mm×2mm)， 置于家兔眼结膜囊下穹窿处粘取泪液，取出后立即称重(泪液体积由滤纸 条采样前后的重量差求得)。：滤纸条置离心管中，加入甲醇0.5mL，超声 提取15min，离心，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤后HPLC测定，计 算不同时间点泪液中的药物浓度。
结果：实验结果见图3。结果表明，3小时内，药物的角膜滞留性的 大小顺序为壳聚糖包覆脂质体＞脂质体＞滴眼液，证明了脂质体和壳聚糖 对角膜具有黏附作用。这种黏附作用能够减少制剂在眼部由于泪液冲刷造 成的损失，从而提高生物利用度，并发挥长效和缓释作用。
3.微渗析法测定清醒家兔房水中药物浓度
目的：研究眼用制剂对角膜的黏附性。
动物：新西兰白兔，体重2.5-3.0kg，雌雄不限。
试药：维拉帕米脂质体(实施例1)、维拉帕米壳聚糖包覆脂质体(实施例 2)、维拉帕米生理盐水溶液(2.5mg/mL)。
方法：将微渗析探针经手术植入兔眼前房中，经2天恢复期，即开始 进行药动学实验。以生理盐水为灌注液，流速3.0μL·min-1，冲洗0.5h 后，在结膜囊内滴入150μL制剂，最初的40min每10min收集样品， 之后每20min收集样品，样品进行HPLC测定，计算不同时间段内房水中 的平均药物浓度。
结果：结果见表1。在6小时内，脂质体与壳聚糖包覆脂质体的峰浓度(Cmax) 分别为滴眼液的1.22倍与1.55倍，曲线下面积(AUC)分别为滴眼液的 1.47倍与2.08倍，药物的达峰时间(Tmax)长于滴眼液。脂质体与壳聚糖 包覆脂质体的相对生物利用度分别为146.7％与207.7％，并具有缓释和长 效作用。
表1微渗析法测定维拉帕米在清醒家兔房水中药动学参数 (n＝6，mean±SD)
样品 Cmax/μg·mL-1 Tmax/min AUC/μ g·mL-1·min 相对 生物利用度 滴眼液 脂质体 壳聚糖包 覆脂质体 0.317±0.043 0.388±0.065* 0.490±0.081** 43.33±8.16 63.33±8.16 90.00±10.95 60.78±11.42 89.16±14.72** 126.22±18.30** - 146.7％ 207.7％
*P＜0.05，**，P＜0.01，与滴眼液组比较
上述实验表明，将维拉帕米制成脂质体，并以壳聚糖对其进行包覆， 能够有效促进维拉帕米的角膜透过性，提高药物在房水中的浓度，与此同 时，脂质体和壳聚糖对角膜的黏附作用能够减少制剂在眼部由于泪液冲刷 造成的损失，从而提高生物利用度，并发挥长效和缓释作用。因此能够减 少用药次数，减少药物浓度的波动，提高药效。且壳聚糖包覆脂质体相对 于未包覆的脂质体具有显著的优势。
本发明的维拉帕米脂质体可用于眼用、静脉注射和透皮给药等途径， 尤其是眼用时，能够提高药物的角膜透过量，提高药物的生物利用度，降 低药物的毒副作用，实现缓释和长效作用，减少用药次数，减少药物浓度 的波动，因此能更好地发挥维拉帕米的抗青光眼和抗白内障等作用。
本发明的脂质体不仅对维拉帕米适用，作为理想的眼部药物载体，对 于其他抗青光眼药物和抗白内障药物，也可适用，或作为有价值的参考。
本发明首次将维拉帕米制成脂质体，目前，在国内外均未见维拉帕米 脂质体的报道，更没有相关制剂的上市，因此本发明具有令人瞩目的实际 应用前景与潜在经济价值。
附图说明：图1为改进的Franz立式扩散池示意图。图中1为供给池，2 为角膜，3为接受池，4为搅拌子，5为取样口。
图2为维拉帕米脂质体(2.5mg/mL)家兔离体角膜渗透曲线，以滴眼 液为对照(n＝3)。
图3为维拉帕米脂质体(2.5mg/mL)家兔在体角膜滞留性曲线，以滴 眼液为对照(n＝3)。
图4为微渗析法测定维拉帕米在清醒家兔房水中药物浓度-时间曲线 (n＝6)。
具体实施方式：
实施例1
盐酸维拉帕米 25mg
磷脂酰胆碱 120mg
十八胺 5mg
胆固醇 50mg
制备方法：将处方量的磷脂、胆固醇和十八胺溶于4mL乙醇中，缓 慢注入到50℃、磁力搅拌下的8mL 0.125mol/L硫酸铵溶液中，50℃保 温搅拌1h使乙醇挥发完全，置冰浴中探头超声5min，即得空白脂质体。 将所得空白脂质体置于透析袋中，两端扎紧，置1000mL 0.9％NaCl溶液 中透析24h，除去脂质体外水相中的硫酸铵。将透析好的空白脂质体于60 ℃下保温，在搅拌下缓慢加入1mL含25mg盐酸维拉帕米的水溶液，继续 保温20min，以0.9％NaCl溶液调节终体积至10mL，即得盐酸维拉帕米 脂质体。
实施例2
盐酸维拉帕米 25mg
磷脂酰胆碱 120mg
十八胺 5mg
胆固醇 50mg
壳聚糖 10mg
制备方法：将处方量的磷脂、胆固醇和十八胺溶于4mL乙醇中，缓 慢注入到50℃、磁力搅拌下的8mL 0.125mol/L硫酸铵溶液中，50℃保 温搅拌1h使乙醇挥发完全，置冰浴中探头超声5min，即得空白脂质体。 将所得空白脂质体置于透析袋中，两端扎紧，置1000mL 0.9％NaCl溶液 中透析24h，除去脂质体外水相中的硫酸铵。将透析好的空白脂质体于60 ℃下保温，在搅拌下缓慢加入1mL含25mg盐酸维拉帕米的水溶液，继续 保温20min，即得盐酸维拉帕米脂质体。壳聚糖溶于1mL pH6.0醋酸溶 液中，在磁力搅拌下，将此溶液加入到盐酸维拉帕米脂质体中，并用0.1M NaOH溶液调节pH至7.0，即得壳聚糖包覆的盐酸维拉帕米脂质体。
实施例3
盐酸维拉帕米 50mg
磷脂酰胆碱 300mg
PEG2000-DSPE 10mg
胆固醇 100mg
制备方法：取处方量的盐酸维拉帕米、磷脂、PEG2000-DSPE和胆固醇 以5mL乙醇溶解，缓缓注入到50℃、磁力搅拌下的10mL 0.9％NaCl溶 液中，50℃保温搅拌30min使乙醇挥发完全，置冰浴中探头超声5min， 即得。
实施例4
盐酸维拉帕米 50mg
磷脂酰胆碱 300mg
去氧胆酸钠 100mg
维生素E 10mg
制备方法：将处方量的磷脂、去氧胆酸钠和维生素E溶于10mL乙醚 中；将处方量的盐酸维拉帕米溶于5mL pH7.4磷酸盐缓冲液中，得内水相。 将二者混合，剧烈振摇、超声使之形成W/O型乳剂，倒入50mL圆底烧瓶 中，于30℃下旋转蒸发，当混合物达到粘稠的胶态时，再加入5mL pH7.4 磷酸盐缓冲液，继续在30℃下旋转蒸发30min，置冰浴中探头超声5min， 即得。
实施例5
盐酸维拉帕米 75mg
二棕榈酰磷脂酰胆碱 400mg
胆固醇 20mg
维生素E 10mg
壳聚糖 10mg
制备方法：取处方量的盐酸维拉帕米、磷脂、胆固醇和维生素E，以 20mL乙醇溶解，置于100mL圆底烧瓶中，45℃旋转蒸发除去乙醇，使之 在瓶壁上形成一层均匀、干燥的薄膜，充氮气，真空干燥过夜。在圆底烧 瓶中加入9mL 0.9％NaCl溶液，在45℃下水化4h，使薄膜充分脱落、 浸泡，置冰浴中探头超声5min。壳聚糖溶于1mL pH6.0醋酸溶液中， 在磁力搅拌下，将此溶液加入到上述脂质体中，并用0.1M NaOH溶液调节 pH至7.0，即得。