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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610539882.8 (22)申请日 2016.07.08 (71)申请人 南京大学医学院附属鼓楼医院 地址 210008 江苏省南京市鼓楼区中山路 321号 (72)发明人 李爱梅 林夏雯 郭爱斌 张炜 汪彦扬 谭千倩 陈德柱 (74)专利代理机构 南京钟山专利代理有限公司 32252 代理人 戴朝荣 (51)Int.Cl. A61K 51/10(2006.01) (54)发明名称 一种特异性诊断黑色素瘤的PET示踪剂及其 制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种特异性。
2、诊断黑色素瘤的 PET示踪剂， 采用双功能改良螯合剂(Df-Bz-NCS) 标记方法合成黑色素瘤PET显像示踪剂89Zr- Df-Bz-NCS-Melan-A抗体， 合成方法简便， 产率较 高， 约54.7511.02， 放化纯度达95以上， 体 外稳定， 168h室温下经TLC分析， 未见明显脱锆表 现。 具有高灵敏度和特异性， 有效提升了PET-CT 在黑色素瘤早期诊断和疗效监测中的作用， 提升 黑色素瘤病人的生存质量。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 106110343 A 2016.11.16 CN 106110343 A 1.一种特异性诊断黑色素瘤的PET示踪剂， 其特征。
3、在于， 该示踪剂是89Zr标记melan-A抗 体的标记产物。 2.根据权利要求1所述的特异性诊断黑色素瘤的PET示踪剂的制备方法， 其特征在于， 包括如下几个步骤： 1)melan-A抗体溶剂置换： 采用碳酸氢钠溶液置换法， 将1.5mg melan-A抗体冻干粉剂 溶解于溶剂中， 并离心浓缩； 2)melan-A抗体的-Df-Bz-NCS-修饰： 取步骤1)置换溶剂并浓缩后的melan-A抗体溶液， 调节PH值为7.0， 加入20mg/mL的以DMSO为溶剂的DFO溶液， 在36油浴中反应1h， 每隔10min 充分振荡反应管， 得到-Df-Bz-NCS-修饰的melan-A抗体； 3)-。
4、Df-Bz-NCS-修饰的melan-A抗体的纯化： 将步骤2)得到的-Df-Bz-NCS-修饰的 melan-A抗体通过PD10柱及0.15mol/L(PH7.2)醋酸钠缓冲溶液纯化； 4)89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗体的合成： 取放射性活度为3mCi的89Zr草酸溶液0.5ml， 加入0.1mol/L的碳酸钠溶液， 调节PH值为7.0， 再加入0.3ml的0.15mol/L(PH7.2)的醋酸 钠缓冲溶液， 然后向前述体系中加入步骤3)得到的-Df-Bz-NCS-修饰的melan-A抗体， 室温 下反应40min； 5)89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗体的纯。
5、化： 将步骤4)所得的89Zr-Df-Bz-NCS- Melan-A抗体通过PD10柱及0.15mol/L(PH7.2)醋酸钠缓冲溶液纯化， 即得到89Zr-Df- Bz-NCS-Melan-A抗体即特异性诊断黑色素瘤的PET示踪剂。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106110343 A 2 一种特异性诊断黑色素瘤的PET示踪剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于核医学领域， 具体涉及一种特异性诊断黑色素瘤的PET示踪剂及其制 备方法。 背景技术 0002 黑色素瘤是目前所有恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤， 由位于皮肤表皮基底部 的黑色素细胞恶变而成， 多由痣或色素斑发展而。
6、来， 一旦进入快速生长期， 则预后差、 死亡 率高。 90黑色素瘤发生于皮肤， 最常见于背部、 胸腹部和腿部。 世界范围内欧美白种人发 病率明显高于其它肤色人种， 且欧美各国的黑色素瘤发病率不断上升。 0003 Melan-A蛋白作为特异性较强的标志物， 被广泛独用或联用于诊断黑色素瘤病理 切片染色。 Melan-A是一种在黑色素瘤细胞表面特异性表达的蛋白质， 它是由MLANA基因编 码的蛋白14， 该蛋白质片段由9个氨基酸组成， 该蛋白质可以被免疫系统T细胞上的MHC I 复合物识别， 进而激活T淋巴细胞， Melan-A的高表达被认为与黑色素瘤的转移密切相关 15。 早期既有研究指出， 在。
7、黑色素瘤多数转移病灶中Melan-A蛋白亦有高表达。 Melan-A蛋 白的表达主要定位于细胞膜， 为将Melan-A蛋白作为靶向位点的应用研究提供了理论依据。 0004 正电子发射断层显像(Positron Emission Tomography， PET)是目前唯一用解剖 形态方式进行功能、 代谢和受体显像的核医学影像技术， 它可以无创伤地、 动态地、 定量地 观察药物或代谢物质进入人体内的生理、 生化变化。 PET是利用正电子放射性核素及其标记 化合物为示踪剂， 以功能图像方式、 从分子水平显示机体及病灶组织细胞的代谢、 功能、 血 流、 细胞增殖和受体密度分布状况， 为临床提供更多的生。
8、理和病理方面的诊断信息。 PET显 像结果更能客观准确地显示活体的生物信息， 近年来， 发展较为迅速， 在肿瘤诊断、 分期、 再 分期及疗效监测和预后判断等方面具有重要临床价值。 0005 “免疫成像PET(immune-PET)” 单克隆抗体放射性标记在正电子成像术(PET) 中的应用， 真正的成为一种非创伤性的根据特定靶向分子的体内成像技术， 特别是针对体 内原发肿瘤及转移病灶的检测。 用于抗体同位素标记的常见同位素有锆89( 89Zr， t1/2 3.3d)， 碘124(124I， t1/24.2d)， 铜64(64Cu， t1/212.7h)， 钇89(89Y， t1/23.3d)。 。
9、89Zr， 半 衰期与抗体药物基本一致， 其能量介乎18F和68Ga之间， 能获得有高分辨率的PET成像图片 等独特优势18， 正成为近十年来immune-PET研究的热门同位素。 89Zr标记方式有很多种， 现阶段常用的方式是Df-Bz-NCS螯合剂标记方法， 该方法标记产率高， 稳定性好,耗时短， 技 术成熟， 被应用于多个抗体-89Zr标记研究中。 本研究中采用双功能改良螯合剂(Df-Bz-NCS) 标记方法合成黑色素瘤PET显像示踪剂89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A polyclonal antibody， 合成方法简便， 产率较高， 约54.7511.02， 放化纯度达9。
10、5以上， 体外稳定， 168h室温下 经TLC分析， 未见明显脱锆表现。 0006 Melan-A是一种在黑色素瘤细胞表面特异性表达的蛋白质， 它由MLANA基因编码的 蛋白， 该蛋白质片段由9个氨基酸组成， 该蛋白质可以被免疫系统T细胞上的MHC I复合物识 别， 进而激活T淋巴细胞， melan-A的高表达被认为与黑色素瘤的转移密切相关。 因为melan- 说 明 书 1/4 页 3 CN 106110343 A 3 A蛋白在黑色素瘤细胞上表达的特异性， 因此被临床上用来做为病理切片染色诊断黑色素 瘤。 然而， 如上所述， 病理切片只能诊断局部区域的组织， 并不能反映全身的整体情况， 因 。
11、此， 开发出一种新型的识别melan-A蛋白的黑色素瘤PET诊断试剂具有现实的临床应用价 值。 0007 目前主要依赖影像学手段比如CT、 MRI和PET-CT等手段来评估黑色素瘤病情， CT和 MRI仅提供形态学方面信息， 有一定局限性。 18F-FDG对原发恶性黑色素瘤的检出率较高， 但 是对淋巴结转移性恶性黑色素瘤病灶早期检出率为18.75， 该结果说明18F-FDG在黑色素 瘤转移的诊断中发挥的作用十分有限。 因而亟待解决黑色素瘤PET-CT成像的特异性强的分 子探针， 既提高灵敏度， 又兼顾特异性。 发明内容 0008 发明目的： 本发明的目的是提供一种既提高灵敏度， 又兼顾特异性的。
12、特异性诊断 黑色素瘤的PET示踪剂及其制备方法。 0009 技术方案： 0010 特异性诊断黑色素瘤的PET示踪剂的制备方法， 包括如下几个步骤： 0011 1)melan-A抗体溶剂置换： 采用碳酸氢钠溶液置换法， 将1.5mg melan-A抗体冻干 粉剂溶解于溶剂中， 并离心浓缩； 0012 2)melan-A抗体的-Df-Bz-NCS-修饰： 取步骤1)置换溶剂并浓缩后的melan-A抗体 溶液， 调节PH值为7.0， 加入20mg/mL的以DMSO为溶剂的DFO(去铁胺B， 一种可与各种金属离 子结合的螯合剂)溶液， 在36油浴中反应1h， 每隔10min充分振荡反应管， 得到-Df。
13、-Bz- NCS-修饰的melan-A抗体； 0013 3)-Df-Bz-NCS-修饰的melan-A抗体的纯化： 将步骤2)得到的-Df-Bz-NCS-修饰的 melan-A抗体通过PD10柱及0.15mol/L(PH7.2)醋酸钠缓冲溶液纯化； 0014 4)89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗体的合成： 取放射性活度为3mCi的89Zr草酸溶液 0.5ml， 加入0.1mol/L的碳酸钠溶液， 调节PH值为7.0， 再加入0.3ml的0.15mol/L(PH7.2) 的醋酸钠缓冲溶液， 然后向前述体系中加入步骤3)得到的-Df-Bz-NCS-修饰的melan-A抗 体， 室温下。
14、反应40min； 0015 5)89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗体的纯化： 将步骤4)所得的89Zr-Df-Bz-NCS- Melan-A抗体通过PD10柱及0.15mol/L(PH7.2)醋酸钠缓冲溶液纯化， 即得到89Zr-Df- Bz-NCS-Melan-A抗体即特异性诊断黑色素瘤的PET示踪剂。 0016 本发明通过放射性纸层析(RTLC)检测放射性化学纯度， 通过放射性纸层析(RTLC) 检测产品在室温放置168h内的稳定性。 0017 有益效果： 本发明采用双功能改良螯合剂(Df-Bz-NCS)标记方法合成黑色素瘤PET 显像示踪剂89Zr-Df-Bz-NCS-Mel。
15、an-A抗体， 合成方法简便， 产率较高， 约54.7511.02， 放化纯度达95以上， 体外稳定， 168h室温下经TLC分析， 未见明显脱锆表现。 具有高灵敏度 和特异性， 有效提升了PET-CT在黑色素瘤早期诊断和疗效监测中的作用， 提升黑色素瘤病 人的生存质量。 附图说明 说 明 书 2/4 页 4 CN 106110343 A 4 0018 图1是本发明的89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗体的合成过程示意图。 0019 图2是本发明应用实施例的细胞系Melan-A蛋白表达western blot鉴定图。 0020 图3是本发明应用实施例的melan-A高表达细胞株荷瘤鼠。
16、microPET扫描图。 具体实施方式 0021 实施例1 0022 如图1所示， 特异性诊断黑色素瘤的PET示踪剂的制备方法， 包括如下几个步骤： 0023 1)melan-A抗体溶剂置换： 将1.5mg Melan-Apolyclonal antibody冻干粉制剂溶 于1ml 0.1mol/L碳酸氢钠溶液， 取PD10柱一支， 用超纯水清洗后， 加入0.1mol/L碳酸氢钠溶 液平衡， 平衡好后， 取1mL melan-A抗体原液加入PD10柱柱头端， 再加入适量碳酸氢钠溶液， 待柱内液体流干后， 弃去所有流出液， 继续加入3mL 0.1mol/L碳酸氢钠溶液， 收集所有液 体。 取超滤。
17、离心管一支， 将收集液体离心(1500rpm5min)、 浓缩； 0024 2)melan-A抗体的-Df-Bz-NCS-修饰： 取步骤1)置换溶剂并浓缩后的melan-A抗体 溶液， 调节PH值为7.0， 加入20mg/mL的以DMSO为溶剂的DFO溶液， 在36油浴中反应1h， 每隔 10min充分振荡反应管， 得到-Df-Bz-NCS-修饰的melan-A抗体； 0025 3)-Df-Bz-NCS-修饰的melan-A抗体的纯化： 将步骤2)得到的-Df-Bz-NCS-修饰的 melan-A抗体通过PD10柱及0.15mol/L(PH7.2)醋酸钠缓冲溶液纯化， 取PD10柱一支， 用超。
18、 纯水清洗后， 加入0.15mol/L(PH7.2)的醋酸钠缓冲溶液平衡。 平衡结束后加入上述反应 粗品， 再加入醋酸缓冲溶液， 待柱内液体流干后， 弃去所有流出液。 继续加入3mL醋酸缓冲溶 液， 收集所有液体。 取超滤离心管一支， 将收集液体离心(1500rpm5min)、 浓缩并用醋酸缓 冲溶液洗涤数次； 0026 4)89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗体的合成： 取放射性活度为3mCi的89Zr草酸溶液 0.5ml， 加入0.1mol/L的碳酸钠溶液， 调节PH值为7.0， 再加入0.3ml的0.15mol/L(PH7.2) 的醋酸钠缓冲溶液， 然后向前述体系中加入步骤3)。
19、得到的-Df-Bz-NCS-修饰的melan-A抗 体， 室温下反应40min； 0027 5)89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗体的纯化： 将步骤4)所得的89Zr-Df-Bz-NCS- Melan-A抗体通过PD10柱及0.15mol/L(PH7.2)醋酸钠缓冲溶液纯化， 即得到89Zr-Df- Bz-NCS-Melan-A抗体即特异性诊断黑色素瘤的PET示踪剂。 0028 对实施例1得到的产物进行纯度和稳定性检测： 0029 1.通过放射性纸层析(RTLC)检测放射性化学纯度。 0030 iTLC法测定放射性化学纯度： 吸取10 l的标记产物中得到的89Zr-Df-Bz-NC。
20、S- Melan-A抗体溶液， 以iTLC玻璃纤维为固定相(1cm x 8cm instant silica gel strip)， 然 后以浓度为20mmol/L、 pH值为6.5的柠檬酸-柠檬酸钠为展开剂展开， 干燥， 依据中国药典 2010年版二部附录XIII放射化学纯度测定法第一法， 测定其放射性化学纯度； 其结果 无游离89Zr离子。 0031 2.通过放射性纸层析(RTLC)检测产品在室温放置168h内的稳定性， 操作方法 0032 取送药留样药品， 按照时间点1h、 2h、 6h、 24h、 48h、 72h、 120h和168h进行iTLC分析。 各个时间点的比移值分别为： 0。
21、.185、 0.179、 0.163、 0.168、 0.169、 0.169、 0.163和0.168， 未 发现明显的89Zr离子单峰。 说 明 书 3/4 页 5 CN 106110343 A 5 0033 89Zr草酸溶液与Df-Bz-NCS-Melan-A抗体反应后， 溶液中未结合的89Zr草酸溶液 (Rf0.5)， 89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗体产物接近源点(Rf0.1)， 说明已无游离的89Zr， 放射性化学纯度99。 在本发明得到的标记产物在室温保存168h内， 其放射性化学纯度 99， 稳定性好。 0034 应用实施例 0035 小动物PET扫描和生物分布：。
22、 0036 SK-MEL-28及A375细胞总蛋白Melan-A表达western blot验证 0037 筛选出melan-A阳性的表达的人源性细胞株SK-MEL-28及melan-A阴性的A375细 胞， 在细胞培养箱培养扩增， 异位接种于裸鼠腋下， 采用western blot实验鉴定两种细胞 melan-A的表达情况。 由图2可知， SK-MEL-28细胞系Melan-A表达阳性， 高表达Melan-A； A375 细胞系Melan-A表达阴性， 低表达Melan-A 0038 89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗体在荷瘤BALB/c裸鼠体内microPET显像: 0039 。
23、SK-MEL-28荷瘤鼠注射89Zr-DFO-Df-Bz-Melan-A抗体后2h， 6h， 24h， 72h， 120h和 168h显像如图3所示。 ROI半定量分析显示， SK-MEL-28荷瘤鼠肿瘤部位对于显像剂摄取于 72h后达到最大， 摄取值约15.852.56ID/g。 0040 由此实施例可知， 本实施例制备的89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗体， 具有制备方法 简单、 产率高、 放化纯度高、 体外稳定好、 特异性高等优点， 可客观准确的反应活体中肿瘤中 Melan-A的表达情况， 可更加早期的诊断黑色素瘤。 另外动物和人体采用相同的PET示踪剂， Melan-A蛋白在不同种属表达高度保守， 本实施例制备的89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗体可 广泛应用于临床早期黑色素瘤PET诊断和肿瘤疗效评估， 并为黑色素瘤早期转移诊断提供 可靠的影像学依据。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106110343 A 6 图1 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 106110343 A 7 图2 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 106110343 A 8 。