技术领域
本发明涉及以氨基酸为连接子的多聚谷氨酸-药物偶合物及其 非毒性药学上可接受的盐，其中的药物为吉西他滨(gemcitabine)、 紫杉醇(paclitaxel)或多烯紫杉醇(docetaxel)。
背景技术
吉西他滨、紫杉醇及多烯紫杉醇是目前临床最常用的抗肿瘤药 物，其化学结构如下所示：
吉西他滨 紫杉醇 多西紫杉醇
吉西他滨为胞嘧啶核苷衍生物，是抗代谢类的抗肿瘤药物。临 床研究结果表明，吉西他滨对多种肿瘤有效。对于胰腺癌，吉西他 滨能够改善临床症状、提高生活质量和延长生存期，成为治疗胰腺 癌的一线药物；吉西他滨与顺铂联合用药，是非小细胞肺癌治疗的 首选方案之一；在欧洲，吉西他滨还被批准用于进展期乳腺癌治疗； 此外，吉西他滨还被用于膀胱癌、卵巢癌、淋巴瘤、消化道癌等肿 瘤的治疗。但是，吉西他滨生物半衰期短，体内易代谢为无活性代 谢物。
紫杉醇类药物是具有微管蛋白抑制活性的抗肿瘤药物。紫杉醇 及其衍生物多烯紫杉醇能促使微管蛋白聚集成微管，并结合到微管 上抑制微管的解聚，从而使细胞有丝分裂中止。紫杉醇和多烯紫杉 醇对卵巢癌、乳腺癌、非小细胞性肺癌、头颈部恶性肿瘤等有显著 的疗效，并且能够与其它抗肿瘤药物如顺铂联合用药以提高疗效， 成为应用最广泛的抗肿瘤药物。但是紫杉醇和多烯紫杉醇的水溶解 度很差。
尽管吉西他滨、紫杉醇及多烯紫杉醇在临床得到广泛应用，但 是作为细胞毒类的抗肿瘤药物，这些药物均具有骨髓抑制及胃肠道 反应等副作用，不良反应大。
将抗肿瘤药物与多聚谷氨酸、聚乙二醇等大分子载体偶合，利 用肿瘤血管组织对大分子偶合物的高渗透性，将药物选择性投放于 肿瘤组织，能够提高抗肿瘤药物的靶向性，降低毒副作用；而且利 用偶合物的缓释作用，延长药物的体内半衰期，可以提高疗效。
药物与大分子偶合物的偶联键是影响偶合物疗效的重要因素。 理想的偶联键必须在血液中保持稳定，而在靶组织中能够充分释放 活性药物。
中国专利CN1217662A及美国专利US 6262107、US 6515017、 US 6730699、US 6884817公开了水溶性的紫杉醇或多烯紫杉醇与多聚 谷氨酸(poly-(L)-glutamic acid，PLGA)的偶合物。在以上公开 的专利中，紫杉醇或多烯紫杉醇在缩合剂二环基碳二亚胺的作用下 直接与多聚谷氨酸分子中的羧基形成酯键偶联。
从化学结构可以看出，吉西他滨、紫杉醇及多烯紫杉醇分子中 含有多个羟基，因此，将药物分子中的羟基在碳二亚胺作用下直接 与多聚谷氨酸分子中的羧基偶联，将形成不同位置羟基与羧基连接 的混合物。由于化学性质或立体位阻的不同，吉西他滨、紫杉醇及 多烯紫杉醇分子中不同羟基与多聚谷氨酸的偶联键具有不同的化学 稳定性，因此具有不同的生物活性；根据上述专利技术不能分离得 到单一的多聚谷氨酸与药物分子中特定羟基连接的的偶合物。
发明内容
本发明的目的是提供吉西他滨、紫杉醇或多烯紫杉醇通过氨基 酸与多聚-(L)-谷氨酸连接形成的偶合物，在这些偶合物中，多聚 -(L)-谷氨酸通过氨基酸与药物分子中特定的羟基连接。通过选择适 当的氨基酸连接子可以实现游离药物的控制释放。
优选地，在药物通过氨基酸与多聚-(L)-谷氨酸连接形成的偶合 物中，氨基酸分子中的α位羧基与吉西他滨分子中5’-位羟基或 紫杉醇(多烯紫杉醇)分子中2’-位羟基成酯键，氨基酸分子中 α位氨基与多聚-(L)-谷氨酸分子中的羧基成酰胺键。
优选地，用于连接药物与多聚-(L)-谷氨酸的氨基酸为甘氨酸、 (L)-丙氨酸、(L)-亮氨酸、(L)-异亮氨酸、(L)-缬氨酸、 (L)-脯氨酸、(L)-苯丙氨酸、(L)-甲硫氨酸或(L)-谷氨酰 胺。
优选地，多聚-(L)-谷氨酸的分子量为25000-50000，其N 端为游离氨基或烷酰化氨基。
优选地，偶合物中吉西他滨的含量在5-30％(重量比)范围内， 偶合物中紫杉醇或多烯紫杉醇的含量在10-40％(重量比)范围内。
本发明还提供吉西他滨、紫杉醇或多烯紫杉醇通过氨基酸与多 聚-(L)-谷氨酸连接形成的偶合物的非毒性药学上可接受的盐，如无 机金属离子的钠盐、钾盐或有机胺的盐。
本发明还提供含有吉西他滨、紫杉醇或多烯紫杉醇通过氨基酸 与多聚-(L)-谷氨酸连接形成的偶合物及其非毒性药学上可接受的 盐作为活性成分的药物组合物。
本发明最后还提供吉西他滨、紫杉醇或多烯紫杉醇与多聚-(L)- 谷氨酸的偶合物及其非毒性药学上可接受的盐，以及包含式该偶合 物或其非毒性药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物及作为 抗肿瘤药物的用途。
具体实施方式
本发明中吉西他滨、紫杉醇或多烯紫杉醇通过氨基酸与多聚 -(L)-谷氨酸连接形成的偶合物的合成可以分为药物氨基酸衍生物 的合成及药物氨基酸衍生物与多聚-(L)-谷氨酸的偶联两个部分。
吉西他滨的氨基酸衍生物可以按照如下合成路线制备：
N-苄氧羰基氨基酸在二环己基碳二亚胺作用下与吉西他滨缩 合，将反应产物以硅胶柱层析分离得到5’-O-(N-苄氧羰基氨基 酰)-吉西他滨，催化氢化脱保护得到5’-O-(氨基酰)-吉西他滨。 R1为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基等氨基酸侧 链。
类似地，N-苄氧羰基氨基酸在二环己基碳二亚胺作用下与紫 杉醇或多烯紫杉醇缩合，将反应产物以硅胶柱层析分离得到2’- O-(N-苄氧羰基氨基酰)-紫杉醇或2’-O-(N-苄氧羰基氨基酰)- 多烯紫杉醇，催化氢化脱保护得到2’-O-(氨基酰)-紫杉醇或2’ -O-(氨基酰)-多烯紫杉醇：
R1为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基等氨基 酸侧链。R2＝苯基，R3＝乙酰基时为紫杉醇，R2＝特丁氧基，R3＝H时为多烯紫杉醇。
吉西他滨、紫杉醇或多烯紫杉醇的氨基酸衍生物分子中的氨基 可以在二环己基碳二亚胺作用下直接与多聚-(L)-谷氨酸分子中的 羧基缩合，形成酰胺键：
吉西他滨、紫杉醇或多烯紫杉醇的氨基酸衍生物也可以通过活 泼酯法与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸偶联：
多聚-(L)-谷氨酸先与乙酸酐反应，制得N-乙酰化的多聚-(L)- 谷氨酸，N-乙酰化的多聚-(L)-谷氨酸分子中的羧基在二环己基碳 二亚胺作用下与N-羟基琥珀酰亚胺成活泼酯，最后与吉西他滨、紫 杉醇或多烯紫杉醇的氨基酸衍生物分子中的氨基成酰胺键。
下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，这些实 施例不应作为对本发明的范围的限制。
实施例1[多聚-(L)-谷氨酸]-[5’-O-(甘氨酰)-吉西他 滨]偶合物(I1)的制备
1.15’-O-(甘氨酰)-吉西他滨的合成
将0.4克(2mmol)N-苄氧羰基-甘氨酸和0.02克4-二甲基 氨基吡啶溶解在2ml干燥的二甲基甲酰胺中，冷却至5℃，加入0.6 克(2mmol)吉西他滨。搅拌下，加入0.42克(2mmol)二环己 基碳二亚胺，于5℃搅拌反应5小时。过滤除去白色沉淀。将滤液 减压浓缩，然后以硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇 (5∶5∶0.1)洗脱，收集所需组分，减压蒸干，得5’-O-(N-苄氧羰 基甘氨酰)-吉西他滨0.34克。
将0.34克5’-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-吉西他滨溶于5毫 升二氧六环中，加入0.1克5％的钯炭，在1个大气压的氢气下搅拌 4小时后，滤去催化剂。将滤液减压浓缩，然后以硅胶柱层析分离， 用乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇(8∶2∶0.5)洗脱，收集所需组分，减压蒸干， 得5’-O-(甘氨酰)-吉西他滨0.23克。核磁共振氢谱：δ(ppm， DMF-d7)：8.02(d，1H)；6.32(d，1H)；6.15(d，1H)；4.48(m， 1H)；4.19(m，1H)；3.96(m，2H)；3.88(m，2H)。
1.2[多聚-(L)-谷氨酸]-[5’-O-(甘氨酰)-吉西他滨]偶 合物(I1)的合成
将2克多聚-(L)-谷氨酸钠(分子量范围25000-50000，Sigma 公司产品)用水溶解，用盐酸调节pH至酸性，用双蒸水透析，冰冻 干燥得到多聚-(L)-谷氨酸1.5克。
取多聚-(L)-谷氨酸100毫克溶于2毫升干燥的二甲基甲酰胺， 加入32毫克(0.1mmol)5’-O-(甘氨酰)-吉西他滨，20.6毫克 (0.1mmol)二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应6小时。过滤，将滤 液减压蒸干，将残留物用碳酸氢钠溶液溶解，用双蒸水透析，冰冻 干燥得到I1119毫克。取I120毫克用氢氧化钠溶液水解后，用HPLC 法测定游离吉西他滨的含量为3.8毫克，计算偶合物I1中吉西他滨的 含量为19％(重量比)。
实施例2[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[5’-O-(甘氨酰)- 吉西他滨]偶合物(I2)的制备
将2克多聚-(L)-谷氨酸钠用水溶解，加入0.5毫升乙酸酐，室 温搅拌2小时，然后将反应液用盐酸调节pH至酸性，用双蒸水透析， 冰冻干燥得到N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸1.4克。
取N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸100毫克溶于2毫升干燥的二甲 基甲酰胺，加入14毫克(0.1mmol)N-羟基琥珀酰亚胺，20.6毫 克(0.1mmol)二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应6小时。过滤，在 滤液中加入32毫克(0.1mmol)5’-O-(甘氨酰)-吉西他滨，搅拌 反应过夜，然后将反应液减压蒸干，将残留物用碳酸氢钠溶液溶解， 用双蒸水透析，冰冻干燥得到I2106毫克。
取I220毫克用氢氧化钠溶液水解后，用HPLC法测定游离吉西 他滨的含量为3.5毫克，计算偶合物I2中吉西他滨的含量为 17.5％(重量比)。
实施例3[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇] 偶合物(I3)的制备
3.12’-O-(甘氨酰)-紫杉醇的合成
将0.2克(1mmol)N-苄氧羰基-甘氨酸和0.01克4-二甲基 氨基吡啶溶解在2ml干燥的二甲基甲酰胺中，冷却至5℃，加入0.85 克(1mmol)紫杉醇。搅拌下，加入0.21克(1mmol)二环己基 碳二亚胺，于5℃搅拌反应5小时。过滤除去白色沉淀，将滤液减压 浓缩，然后以硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇(5∶5∶0.1) 洗脱，收集所需组分，减压蒸干，得2’-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)- 紫杉醇0.79克。
将0.79克2’-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-紫杉醇溶于5毫升 二氧六环中，加入0.1克5％的钯炭，在1个大气压的氢气下搅拌4 小时后，滤去催化剂。将滤液减压浓缩，然后以硅胶柱层析分离， 用乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇(8∶2∶0.5)洗脱，收集所需组分，减压蒸干， 得2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇0.62克。核磁共振氢谱：δ(ppm， DMSO-d6)：9.26(d，1H)；8.41(br s，2H)；8.02-7.20(m，15H)； 6.32(s，1H)；5.83(t，1H)；5.59(t，1H)；5.45(d， 1H)；5.41(d，1H)；4.92(dd，1H)；4.90(brs，1H)；4.63(s，1H)； 4.11(dd，1H)；3.95-4.06(m，3H)；3.57(d，1H)；2.34(m，1H)； 2.24(s，3H)；2.10(s，3H)；1.86(s，3H)；1.80(dd，1H)；1.64(t，1H)； 1.52(s，3H)；1.06(s，3H)；1.02(s，3H)。
3.2[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇]偶合 物(I3)的合成
取多聚-(L)-谷氨酸100毫克溶于2毫升干燥的二甲基甲酰胺， 加入46毫克(0.05mmol)2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，11毫克(0.05 mmol)二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应6小时。过滤，将滤液减压 蒸干，将残留物用碳酸氢钠溶液溶解，用二氯甲烷提取3次，将水 层用双蒸水透析，冰冻干燥得到I3126毫克。取I320毫克用氢氧 化钠溶液水解后，用二氯甲烷提取3次，合并提取液，依次用1M盐 酸、1M碳酸氢钠及饱和氯化钠溶液洗，将有机层干燥后，减压蒸干， 得游离的紫杉醇5.9毫克，计算偶合物I3中紫杉醇的含量为 29.5％(重量比)。
实施例4[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(甘氨酰)- 紫杉醇]偶合物(I4)的制备
取N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸100毫克溶于2毫升干燥的二甲 基甲酰胺，加入7毫克(0.05mmol)N-羟基琥珀酰亚胺，11毫克 (0.05mmol)二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应6小时。过滤，在滤 液中加入46毫克(0.05mmol)2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，搅拌反 应过夜，然后将反应液减压蒸干，将残留物用碳酸氢钠溶液溶解，用 二氯甲烷提取3次，将水层用双蒸水透析，冰冻干燥得到I4117毫 克。取I420毫克用氢氧化钠溶液水解后，用二氯甲烷提取3次，合 并提取液，依次用1M盐酸、1M碳酸氢钠及饱和氯化钠溶液洗，将 有机层干燥后，减压蒸干，得游离的紫杉醇5.4毫克，计算偶合物 I4中紫杉醇的含量为27％(重量比)。
实施例5[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(甘氨酰)-多烯紫 杉醇]偶合物(I5)的制备
5.12’-O-(甘氨酰)-多烯紫杉醇的合成
将0.2克(1mmol)N-苄氧羰基-甘氨酸和0.01克4-二甲基 氨基吡啶溶解在2ml干燥的二甲基甲酰胺中，冷却至5℃，加入0.81 克(1mmol)多烯紫杉醇。搅拌下，加入0.21克(1mmol)二环 己基碳二亚胺，于5℃搅拌反应5小时。过滤除去白色沉淀，将滤液 减压浓缩，然后以硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇 (5∶5∶0.1)洗脱，收集所需组分，减压蒸干，得2’-O-(N-苄氧羰 基甘氨酰)-多烯紫杉醇0.68克。
将0.68克2’-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-多烯紫杉醇溶于5 毫升二氧六环中，加入0.1克5％的钯炭，在1个大气压的氢气下搅 拌4小时后，滤去催化剂。将滤液减压浓缩，然后以硅胶柱层析分 离，用乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇(8∶2∶0.5)洗脱，收集所需组分，减压 蒸干，得2’-O-(甘氨酰)-多烯紫杉醇0.42克。核磁共振氢谱：δ (ppm，DMSO-d6)：9.25(d，1H)；8.48(br s，2H)；8.05-7.32(m，10H)； 6.38s，1H)；5.80t，1H)；5.57t，1H)；5.42(d，1H)；5.36(d，1H)； 4.94(dd，1H)；4.82(br s，1H)；4.61(s，1H)；4.14(dd，1H)； 3.95-4.06(m，3H)；3.57(d，1H)；2.34(m，1H)；2.24(s，3H)； 1.86(s，3H)；1.80(dd，1H)；1.64(t，1H)；1.52(s，3H)；1.40(s，9H)； 1.06(s，3H)；1.02(s，3H)。
5.2[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(甘氨酰)-多烯紫杉醇] 偶合物(I5)的合成
取多聚-(L)-谷氨酸100毫克溶于2毫升干燥的二甲基甲酰胺， 加入43毫克(0.05mmol)2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，11毫克(0.05 mmol)二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应6小时。过滤，将滤液减压 蒸干，将残留物用碳酸氢钠溶液溶解，用二氯甲烷提取3次，将水 层用双蒸水透析，冰冻干燥得到I5126毫克。取I520毫克用氢氧化 钠溶液水解后，用二氯甲烷提取3次，合并提取液，依次用1M盐酸、 1M碳酸氢钠及饱和氯化钠溶液洗，将有机层干燥后，减压蒸干，得 游离的多烯紫杉醇5.6毫克，计算偶合物I5中多烯紫杉醇的含量为 28％(重量比)。
实施例6[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(甘氨酰)- 多烯紫杉醇]偶合物(I6)的制备
参考实施例4的方法，用2’-O-(甘氨酰)-多烯紫杉醇代替2’ -O-(甘氨酰)-紫杉醇，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活泼酯反应， 制得I6，测定偶合物I6中多烯紫杉醇的含量为21％(重量比)。
实施例7[多聚-(L)-谷氨酸]-[5’-O-(L-丙氨酰)-吉 西他滨]偶合物(I7)的制备
参考实施例1.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-丙氨酸代替N- 苄氧羰基-甘氨酸，与吉西他滨反应得到5’-O-(N-苄氧羰基- L-丙氨酰)-吉西他滨，催化氢化后制得5’-O-(L-丙氨酰)-吉西他 滨。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMF-d7)：7.94(d，1H)；6.28(d， 1H)；6.13(d，1H)；4.45(m，1H)；4.16(m，1H)；3.88(m，2H)； 3.54(q，1H)；1.26(d，3H)。
参考实施例1.2的方法，用5’-O-(L-丙氨酰)-吉西他滨代替 5’-O-(甘氨酰)-吉西他滨，在二环己基碳二亚胺作用下与多聚 -(L)-谷氨酸缩合，制得I7，测定偶合物I7中吉西他滨的含量为 16.5％(重量比)。
实施例8[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[5’-O-(L-丙氨 酰)-吉西他滨]偶合物(I8)的制备
参考实施例2的方法，用5’-O-(L-丙氨酰)-吉西他滨代替5’ -O-(甘氨酰)-吉西他滨，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活泼酯反 应，制得I8，测定偶合物I8中吉西他滨的含量为15％(重量比)。
实施例9[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-丙氨酰)-紫杉 醇]偶合物(I9)的制备
9.12’-O-(L-丙氨酰)-紫杉醇的合成
参考实施例3.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-丙氨酸代替N- 苄氧羰基-甘氨酸，与紫杉醇缩合制得2’-O-(N-苄氧羰基-L- 丙氨酰)-紫杉醇，催化氢化脱保护得到2’-O-(L-丙氨酰)-紫杉 醇。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d6)：9.20(d，1H)； 8.02-7.22(m，15H)；6.31(s，1H)；5.86(t，1H)；5.61(t，1H)； 5.45(d，1H)；5.38(d，1H)；4.92(dd，1H)；4.90(br s，1H)； 4.64(s，1H)；4.10(dd，1H)；4.05(d，1H)；4.02(d，1H)； 3.59(d，1H)；3.54(q，1H)；2.35(m，1H)；2.26(s，3H)；2.12(s， 3H)；
1.86(s，3H)；1.64(t，1H)；1.52(s，3H)；1.24(d，3H)；1.06(s，3H)； 1.02(s，3H)。
9.2[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(丙氨酰)-紫杉醇]偶合 物(I9)的合成
参考实施例3.2的方法，用2’-O-(L-丙氨酰)-紫杉醇代替2’ -O-(甘氨酰)-紫杉醇，在二环己基碳二亚胺作用下，与多聚-(L)- 谷氨酸缩合，制得I6，测得偶合物I6中紫杉醇的含量为25.5％(重量 比)。
实施例10[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-丙氨 酰)-紫杉醇]偶合物(I10)的制备
参考实施例4的方法，用2’-O-(L-丙氨酰)-紫杉醇代替2’ -O-(甘氨酰)-紫杉醇，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活泼酯反应， 制得I10，测定偶合物中紫杉醇的含量为23.6％(重量比)。
实施例11[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-丙氨酰)-多烯 紫杉醇]偶合物(I11)的制备
11.12’-O-(L-丙氨酰)-多烯紫杉醇的合成
参考实施例5.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-丙氨酸代替N- 苄氧羰基-甘氨酸，与多烯紫杉醇缩合制得2’-O-(N-苄氧羰基 -L-丙氨酰)-多烯紫杉醇，催化氢化脱保护得到2’-O-(L-丙氨 酰)-多烯紫杉醇。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d6)：9.25(d，1H)； 8.48(br s，2H)；8.05-7.32(m，10H)；6.38s，1H)；5.80t，1H)； 5.57t，1H)；5.42(d，1H)；5.36(d，1H)；4.94(dd，1H)； 4.82(br s，1H)；4.61(s，1H)；4.14(dd，1H)；4.01(d，1H)； 4.04(d，1H)；
3.57(d，1H)；3.55(q，1H)；2.34(m，1H)；2.24(s，3H)； 1.86(s，3H)；1.80(dd，1H)；1.64(t，1H)；1.52(s，3H)；1.40(s，9H)； 1.22(d，3H)；1.06(s，3H)；1.02(s，3H)。
11.2[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(丙氨酰)-多烯紫杉醇] 偶合物(I11)的合成
参考实施例3.2的方法，用2’-O-(L-丙氨酰)-多烯紫杉醇 代替2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，在二环己基碳二亚胺作用下，与多 聚-(L)-谷氨酸缩合，制得I11，测得偶合物I11中多烯紫杉醇的含量 为23.4％(重量比)。
实施例12[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-丙氨 酰)-多烯紫杉醇]偶合物(I12)的制备
参考实施例4的方法，用2’-O-(L-丙氨酰)-多烯紫杉醇代 替2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活泼 酯反应，制得I12，测定偶合物中紫杉醇的含量为23.1％(重量比)。
实施例13[多聚-(L)-谷氨酸]-[5’-O-(L-异亮氨酰)- 吉西他滨]偶合物(I13)的制备
参考实施例1.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-异亮氨酸代替 N-苄氧羰基-甘氨酸，与吉西他滨反应得到5’-O-(N-苄氧羰基 -L-异亮氨酰)-吉西他滨，催化氢化后制得5’-O-(L-异亮氨酰)- 吉西他滨。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMF-d7)：7.94(d，1H)；6.28(d， 1H)；6.13(d，1H)；4.45(m，1H)；4.16(m，1H)；3.88(m，2H)； 3.54(q，1H)；1.35(m，1H)；1.03(m，2H)；0.82(d，3H)；0.64(t，3H)。
参考实施例1.2的方法，用5’-O-(L-异亮氨酰)-吉西他滨代 替5’-O-(甘氨酰)-吉西他滨，在二环己基碳二亚胺作用下与多聚 -(L)-谷氨酸缩合，制得I13，测定偶合物I13中吉西他滨的含量为 14.2％(重量比)。
实施例14[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[5’-O-(L-异亮 氨酰)-吉西他滨]偶合物(I14)的制备
参考实施例2的方法，用5’-O-(L-异亮氨酰)-吉西他滨代替 5’-O-(甘氨酰)-吉西他滨，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活泼 酯反应，制得I8，测定偶合物I14中吉西他滨的含量为13.4％(重量比)。
实施例15[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-异亮氨酰)-紫 杉醇]偶合物(I15)的制备
15.12’-O-(L-异亮氨酰)-紫杉醇的合成
参考实施例3.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-异亮氨酸代替 N-苄氧羰基-甘氨酸，与紫杉醇缩合制得2’-O-(N-苄氧羰基- L-异亮氨酰)-紫杉醇，催化氢化脱保护得到2’-O-(L-异亮氨酰)- 紫杉醇。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d6)：9.23(d，1H)； 8.02-7.22(m，15H)；6.31(s，1H)；5.86(t，1H)；5.61(t，1H)； 5.45(d，1H)；5.37(d，1H)；4.92(dd，1H)；4.90(br s，1H)； 4.64(s，1H)；4.12(dd，1H)；4.05(d，1H)；4.02(d，1H)；3.64(m，1H)； 3.59(d，1H)；2.35(m，1H)；2.26(s，3H)；2.12(s，3H)；1.86(s，3H)； 1.64(t，1H)；1.52(s，3H)；1.35(m，1H)；1.06(s，3H)；1.03(m，2H)； 1.02(s，3H)；0.82(d，3H)；0.64(t，3H)。
15.2[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(异亮氨酰)-紫杉醇] 偶合物(I15)的合成
参考实施例3.2的方法，用2’-O-(L-异亮氨酰)-紫杉醇代 替2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，在二环己基碳二亚胺作用下，与多聚 -(L)-谷氨酸缩合，制得I15，测得偶合物I15中紫杉醇的含量为 21.3％(重量比)。
实施例16[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-异亮 氨酰)-紫杉醇]偶合物(I16)的制备
参考实施例4的方法，用2’-O-(L-异亮氨酰)-紫杉醇代替2’ -O-(甘氨酰)-紫杉醇，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活泼酯反应， 制得I16，测定偶合物中紫杉醇的含量为20.8％(重量比)。
实施例17[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-异亮氨酰)-多 烯紫杉醇]偶合物(I17)的制备
17.12’-O-(L-异亮氨酰)-多烯紫杉醇的合成
参考实施例5.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-异亮氨酸代替 N-苄氧羰基-甘氨酸，与多烯紫杉醇缩合制得2’-O-(N-苄氧羰 基-L-异亮氨酰)-多烯紫杉醇，催化氢化脱保护得到2’-O-(L- 异亮氨酰)-多烯紫杉醇。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d6)： 9.25(d，1H)；8.48(br s，2H)；8.05-7.32(m，10H)；6.38s，1H)； 5.80t，1H)；5.57t，1H)；5.42(d，1H)；5.36(d，1H)； 4.94(dd，1H)；4.82(brs，1H)；4.61(s，1H)；4.14(dd，1H)； 4.01(d，1H)；4.04(d，1H)；3.64(m，1H)；3.57(d，1H)；2.34(m， 1H)；2.24(s，3H)；1.86(s，3H)；1.80(dd，1H)；1.64(t，1H)； 1.52(s，3H)；1.40(s，9H)；1.35(m，1H)；1.06(s，3H)； 1.03(m，2H)；1.02(s，3H)；0.82(d，3H)；0.64(t，3H)。
17.2[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(异亮氨酰)-多烯紫杉 醇]偶合物(I17)的合成
参考实施例3.2的方法，用2’-O-(L-异亮氨酰)-多烯紫杉 醇代替2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，在二环己基碳二亚胺作用下，与 多聚-(L)-谷氨酸缩合，制得I17，测得偶合物I17中多烯紫杉醇的含 量为22.1％(重量比)。
实施例18[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-异亮 氨酰)-多烯紫杉醇]偶合物(I18)的制备
参考实施例4的方法，用2’-O-(L-异亮氨酰)-多烯紫杉醇 代替2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活 泼酯反应，制得I18，测定偶合物中紫杉醇的含量为21.5％(重量比)。
实施例19[多聚-(L)-谷氨酸]-[5’-O-(L-缬氨酰)-吉 西他滨]偶合物(I19)的制备
参考实施例1.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-缬氨酸代替N- 苄氧羰基-甘氨酸，与吉西他滨反应得到5’-O-(N-苄氧羰基- L-缬氨酰)-吉西他滨，催化氢化后制得5’-O-(L-缬氨酰)-吉西他 滨。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMF-d7)：7.94(d，1H)；6.28(d， 1H)；6.13(d，1H)；4.45(m，1H)；4.16(m，1H)；3.69(m， 1H)；3.88(m，2H)；2.25(m，1H)；0.91(m，6H)。
参考实施例1.2的方法，用5’-O-(L-缬氨酰)-吉西他滨代替 5’-O-(甘氨酰)-吉西他滨，在二环己基碳二亚胺作用下与多聚 -(L)-谷氨酸缩合，制得I19，测定偶合物I19中吉西他滨的含量为 16.2％(重量比)。
实施例20[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[5’-O-(L-缬氨 酰)-吉西他滨]偶合物(I20)的制备
参考实施例2的方法，用5’-O-(L-缬氨酰)-吉西他滨代替5’ -O-(甘氨酰)-吉西他滨，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活泼酯反 应，制得I20，测定偶合物I20中吉西他滨的含量为15％(重量比)。
实施例21[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-缬氨酰)-紫杉 醇]偶合物(I21)的制备
21.11’-O-(L-缬氨酰)-紫杉醇的合成
参考实施例3.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-缬氨酸代替N- 苄氧羰基-甘氨酸，与紫杉醇缩合制得2’-O-(N-苄氧羰基-L- 缬氨酰)-紫杉醇，催化氢化脱保护得到2’-O-(L-缬氨酰)-紫杉 醇。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d6)：9.23(d，1H)； 8.02-7.22(m，15H)；6.31(s，1H)；5.86(t，1H)；5.61(t，1H)； 5.45(d，1H)；5.40(d，1H)；4.92(dd，1H)；4.90(br s，1H)； 4.64(s，1H)；4.10(dd，1H)；4.05(d，1H)；4.02(d，1H)；3.69(m， 1H)；3.59(d，1H)；2.35(m，1H)；2.26(s，3H)；2.21(m，1H)； 2.12(s，3H)；1.86(s，3H)；1.64(t，1H)；1.52(s，3H)；1.06(s，3H)； 1.02(s，3H)；0.91(m，6H)。
21.2[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(缬氨酰)-紫杉醇]偶 合物(I21)的合成
参考实施例3.2的方法，用2’-O-(L-缬氨酰)-紫杉醇代替2’ -O-(甘氨酰)-紫杉醇，在二环己基碳二亚胺作用下，与多聚-(L)- 谷氨酸缩合，制得I21，测得偶合物I21中紫杉醇的含量为25.5％(重 量比)。
实施例22[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-缬氨 酰)-紫杉醇]偶合物(I22)的制备
参考实施例4的方法，用2’-O-(L-缬氨酰)-紫杉醇代替2’ -O-(甘氨酰)-紫杉醇，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活泼酯反应， 制得I22，测定偶合物中紫杉醇的含量为23.6％(重量比)。
实施例23[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-缬氨酰)-多烯 紫杉醇]偶合物(I23)的制备
23.12’-O-(L-缬氨酰)-多烯紫杉醇的合成
参考实施例5.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-缬氨酸代替N- 苄氧羰基-甘氨酸，与多烯紫杉醇缩合制得2’-O-(N-苄氧羰基 -L-缬氨酰)-多烯紫杉醇，催化氢化脱保护得到2’-O-(L-缬氨 酰)-多烯紫杉醇。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d6)：9.25(d，1H)； 8.48(br s，2H)；8.05-7.32(m，10H)；6.38s，1H)；5.80t，1H)； 5.57t，1H)；5.42(d，1H)；5.36(d，1H)；4.94(dd，1H)； 4.82(br s，1H)；4.61(s，1H)；4.14(dd，1H)；4.01(d，1H)； 4.04(d，1H)；3.69(m，1H)；3.57(d，1H)；2.34(m，1H)；2.25(m， 1H)；2.24(s，3H)；1.86(s，3H)；1.80(dd，1H)；1.64(t，1H)； 1.52(s，3H)；1.40(s，9H)；1.06(s，3H)；1.02(s，3H)；0.91(m，6H)。
23.2[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(缬氨酰)-多烯紫杉醇] 偶合物(I23)的合成
参考实施例3.2的方法，用2’-O-(L-缬氨酰)-多烯紫杉醇 代替2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，在二环己基碳二亚胺作用下，与多 聚-(L)-谷氨酸缩合，制得I23，测得偶合物I23中多烯紫杉醇的含量 为23.4％(重量比)。
实施例24[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-缬氨 酰)-多烯紫杉醇]偶合物(I24)的制备
参考实施例4的方法，用2’-O-(L-缬氨酰)-多烯紫杉醇代 替2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活泼 酯反应，制得I24，测定偶合物中紫杉醇的含量为23.1％(重量比)。
实施例25[多聚-(L)-谷氨酸]-[5’-O-(L-苯丙氨酰)- 吉西他滨]偶合物(I25)的制备
参考实施例1.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-苯丙氨酸代替 N-苄氧羰基-甘氨酸，与吉西他滨反应得到5’-O-(N-苄氧羰基 -L-苯丙氨酰)-吉西他滨，催化氢化后制得5’-O-(L-苯丙氨酰)- 吉西他滨。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMF-d7)： 7.94(d，1H)；7.23(m，5H)；6.28(d，1H)；6.13(d，1H)； 4.52(m，1H)；4.45(m，1H)；4.16(m，1H)；3.88(m，2H)； 3.15(dd，1H)；3.01(dd，1H)。
参考实施例1.2的方法，用5’-O-(L-苯丙氨酰)-吉西他滨代 替5’-O-(甘氨酰)-吉西他滨，在二环己基碳二亚胺作用下与多聚 -(L)-谷氨酸缩合，制得I25，测定偶合物I25中吉西他滨的含量为 17.2％(重量比)。
实施例26[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[5’-O-(L-苯丙 氨酰)-吉西他滨]偶合物(I26)的制备
参考实施例2的方法，用5’-O-(L-苯丙氨酰)-吉西他滨代替 5’-O-(甘氨酰)-吉西他滨，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活泼 酯反应，制得I26，测定偶合物I26中吉西他滨的含量为16.5％(重量 比)。
实施例27[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-苯丙氨酰)-紫 杉醇]偶合物(I27)的制备
27.12’-O-(L-苯丙氨酰)-紫杉醇的合成
参考实施例3.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-苯丙氨酸代替 N-苄氧羰基-甘氨酸，与紫杉醇缩合制得2’-O-(N-苄氧羰基- L-苯丙氨酰)-紫杉醇，催化氢化脱保护得到2’-O-(L-苯丙氨酰)- 紫杉醇。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d6)：9.23(d，1H)； 8.02-7.22(m，20H)；6.31(s，1H)；5.86(t，1H)；5.61(t，1H)； 5.45(d，1H)；5.40(d，1H)；4.92(dd，1H)； 4.90(br s，1H)；4.64(s，1H)；4.52(m，1H)；4.10(dd，1H)； 4.05(d，1H)；4.02(d，1H)；3.59(d，1H)； 3.15(dd，1H)；3.01(dd，1H)；2.35(m，1H)；2.26(s，3H)；2.12(s，3H)； 1.86(s，3H)；1.64(t，1H)；1.52(s，3H)；1.06(s，3H)；1.02(s，3H)。
27.2[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(苯丙氨酰)-紫杉醇] 偶合物(I27)的合成
参考实施例3.2的方法，用2’-O-(L-苯丙氨酰)-紫杉醇代 替2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，在二环己基碳二亚胺作用下，与多聚 -(L)-谷氨酸缩合，制得I27，测得偶合物I27中紫杉醇的含量为 26.6％(重量比)。
实施例28[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-苯丙 氨酰)-紫杉醇]偶合物(I28)的制备
参考实施例4的方法，用2’-O-(L-苯丙氨酰)-紫杉醇代替2’ -O-(甘氨酰)-紫杉醇，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活泼酯反应， 制得I28，测定偶合物中紫杉醇的含量为24.5％(重量比)。
实施例29[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-苯丙氨酰)-多 烯紫杉醇]偶合物(I29)的制备
29.12’-O-(L-苯丙氨酰)-多烯紫杉醇的合成
参考实施例5.1的方法，用N-苄氧羰基-(L)-苯丙氨酸代替 N-苄氧羰基-甘氨酸，与多烯紫杉醇缩合制得2’-O-(N-苄氧羰 基-L-苯丙氨酰)-多烯紫杉醇，催化氢化脱保护得到2’-O-(L- 苯丙氨酰)-多烯紫杉醇。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d6)： 9.25(d，1H)；8.48(br s，2H)；8.05-7.32(m，15H)；6.38s，1H)； 5.80t，1H)；5.57t，1H)；5.42(d，1H)；5.36(d，1H)； 4.94(dd，1H)；4.82(br s，1H)；4.61(s，1H)； 4.52(m，1H)；4.14(dd，1H)；4.01(d，1H)；4.04(d，1H)；3.57(d， 1H)；3.15(dd，1H)；3.01(dd，1H)；2.34(m，1H)；2.24(s，3H)； 1.86(s，3H)；1.80(dd，1H)；1.64(t，1H)；1.52(s，3H)；1.40(s，9H)； 1.06(s，3H)；1.02(s，3H)。
29.2[多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(苯丙氨酰)-多烯紫杉 醇]偶合物(I29)的合成
参考实施例3.2的方法，用2’-O-(L-苯丙氨酰)-多烯紫杉 醇代替2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，在二环己基碳二亚胺作用下，与 多聚-(L)-谷氨酸缩合，制得I29，测得偶合物I29中多烯紫杉醇的含 量为24.0％(重量比)。
实施例30[N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸]-[2’-O-(L-苯丙 氨酰)-多烯紫杉醇]偶合物(I30)的制备
参考实施例4的方法，用2’-O-(L-苯丙氨酰)-多烯紫杉醇 代替2’-O-(甘氨酰)-紫杉醇，与N-乙酰基多聚-(L)-谷氨酸的活 泼酯反应，制得I30，测定偶合物中紫杉醇的含量为23.8％(重量比)。
实施例31小鼠体内抗人肝癌移植瘤的活性评价
取Ba l b/c-nu/nu裸鼠(5-7周龄，16-20克)，随机分组， 皮下接种0.1毫升含106个人肝癌细胞(HepG2)的细胞悬液，至瘤 体积达到50立方毫米。静脉注射一定剂量的偶合物及游离药物，于 该药后20天，处死动物，测定体重及肿瘤重量，按下式计算肿瘤抑 制率：
肿瘤抑制率(％)＝[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照 组平均瘤重]×100％
实验结果见表1。
表1目标化合物对人肝癌移植瘤的抑制作用
化合物 剂量 (mg/kg) 动物数 (终/始) 体重变化 (g) 瘤重 (g) 抑制率 (％) 生理盐水 6/6 +9.32 1.26 吉西他滨 5 4/6 +4.77 0.45 64.28 I1 5 6/6 +9.94 0.31 75.40 I8 5 6/6 +8.77 0.67 46.82 紫杉醇 100 5/6 +5.38 0.54 57.14 I4 100 6/6 +9.03 0.36 71.43 I10 100 6/6 +8.69 0.21 83.33 I22 100 6/6 +7.35 0.47 62.70 多烯紫杉醇 100 6/6 +6.92 0.56 55.56 I6 100 6/6 +8.49 0.32 74.60 I12 100 6/6 +9.00 0.44 65.08 I18 100 6/6 +8.75 0.38 69.84
给药剂量折算成游离药物量。
实施例32小鼠体内抗人乳腺癌移植瘤的活性评价
取Ba l b/c-nu/nu裸鼠(5-7周龄，16-20克)，随机分组， 皮下接种0.1毫升含106个人乳腺癌细胞(Bacp-37)的细胞悬液， 至瘤体积达到50立方毫米。静脉注射一定剂量的偶合物及游离药 物，于该药后20天，处死动物，测定体重及肿瘤重量，计算肿瘤抑 制率，结果见表2。
表2目标化合物对人乳腺癌移植瘤的抑制作用
化合物 剂量 (mg/kg) 动物数 (终/始) 体重变化 (g) 瘤重 (g) 抑制率 (％) 生理盐水 6/6 +9.76 1.38 吉西他滨 5 5/6 +5.08 0.51 63.08 I1 5 6/6 +9.42 0.46 71.01 I8 5 6/6 +8.25 0.39 71.73 紫杉醇 100 5/6 +5.91 0.48 65.22 I4 100 6/6 +9.24 0.42 69.56 I10 100 6/6 +9.06 0.29 78.99 I22 100 6/6 +8.30 0.41 70.29 多烯紫杉醇 100 6/6 +6.29 0.35 74.64 I6 100 6/6 +10.12 0.47 65.94 I12 100 6/6 +8.86 0.34 75.36 I18 100 6/6 +9.16 0.73 47.10
由表1、表2可知，与游离药物相比，目标化合物对实体瘤的 抑制作用相当或更好；而对体重的影响低于游离药物，表明目标化 合物的毒副作用较轻。