发明领域
本发明涉及体重管理的领域。本发明尤其涉及诱导饱满感(satiety)的方法。
发明背景
世界卫生组织(WHO)已经宣布超重为全世界风险最高的十种病症之一和发达国家中风险最高的五种病症之一(WHO)。在大部分人群中，过去20年间超重和肥胖症的流行率稳定增长(Vasan，RS et al.，2005)。在这种情况下，人群中递增的相对体重趋势在医疗保健提供者中引起了许多注意(Hill JO et al.，2003)。考虑到日益增长的超重流行率和相关的健康后果，对于经济并且有效的体重管理策略存在迫切的需要。
作为超重和肥胖症的一种非侵入性主要治疗策略，减少能量的饮食(食欲抑制)是一种被广泛推荐的途径。使用来自国家调查的数据估计，每天影响能量平衡100千卡(例如每天能量摄入的～4％)能够预防大部分美国人群的体重增加(Hill et al，2003)。在本文上下文中，被设计为影响调节饱满感的机制的成分可发挥作用，特别是当这些成分能够被掺入每日食物中时。
胃肠信号对于食物摄入、饱满感和饱满(satiation)的调节是决定性的。以进餐到进餐(meal-to-meal)为基础的饱满感很大程度上取决于一组协调的神经和体液信号，所述信号源自肠，其应答被摄入的食物的机械和化学性质(Woods SC et al.，2004)。
延长饱满感和减少食物摄入的一种选择是通过延迟胃排空和/或小肠通过时间来实现的(Geliebter A et al.，1988)(Jones KL et al.，1997)(Hveem K et al.，1996)。这可以通过回肠制动机制(ileal brake)的活化来实现(Van Citters GW et al.，1999)。回肠制动机制是控制进餐通过胃肠道传递的主要 抑制性远端到近端(distal-to-proximal)反馈机制，并且被认为调节并优化养分消化和吸收(Van Citters GW et al.，1999)。
已经显示出将小量脂肪餐后灌输进回肠中降低饥饿并且提高饱满感。小肠中脂肪的存在与胃排空的调控(Heddle R et al.，1989)和胃肠激素分泌(MacIntosh CG et al.，1999)相关，所述胃肠激素包括来自小肠近端的CCK(Buffa R et al.，1976)和来自小肠远端的肽YY(PYY)(Adrian TE，et al.，1985)。小肠(远端部分)中的脂肪也具有抑制食欲和能量摄入的能力(Chapman IM et al.，1999)。
若干研究显示将脂质直接递送进回肠中会延迟胃排空(Welch IM et al.，1988)，延长小肠通过时间(Read NW et al.，1984)并且诱导饱满感(Welch I et al.，1985)。
长链脂肪酸是回肠制动系统的有效触发器(Van Citters GW et al.，1999)(Read NW et al.，1984)，若干研究显示，回肠制动系统已经被小量脂肪或游离脂肪酸活化(Keller J et al.，2006)(Pironi L et al，1993)(Dobson CL et al.，1999)。游离脂肪酸对胃肠功能包括运动性(motility)、激素释放和能量摄入的影响(Feltrin KL et al.，2004)(Hunt JN et al.，1968)(Matzinger D et al.，2000)(McLaughlin J et al.，1999)也取决于它们的酰基链长度。Hunt and Knox(Hunt JN et al.，1968)首次证实链长度为12个和更多个碳原子的脂肪酸比含有10个或更少碳原子的脂肪酸从胃中排空得慢得多。
长脂肪酸链(＞C12)抑制后续能量摄入的机制尚不清楚。有一些证据显示，长链脂肪酸的作用取决于CCK的释放(Lal S et al.，2004)；例如，C12对胃排空和胃内体积感知的抑制效应被CCK1受体拮抗剂氯谷胺减弱(Lal S et al.，2004)。脂肪酸的作用还显示涉及迷走神经传入的直接活化或通过CCK的活化(Cox JE et al.，2004)(Lal S et al.，2001)。C12对能量摄入的影响也可以通过GLP-1(Feltrin KL et al.，2004)和可能由其他肽介导，并且由胃肠运动性的改变、尤其是幽门运动性的刺激来介导(Xu X et al.，2005)。
脂肪代谢
大部分膳食脂质在空肠的近端三分之二中被吸收。通常，超过94％的 膳食脂肪被吸收。(主要由甘油三酯组成的)膳食脂质必须被乳化，从而将大的表面积暴露于脂肪分解酶(lipolytic enzyme)。乳化通过咀嚼和胃混合在上胃肠道中开始。通过这些机械手段释放的脂肪微滴被磷脂包被，形成稳定的乳液。被摄入的磷脂(主要是磷脂酰胆碱)以约1∶30的对甘油三酯的比例存在，这足以进行包被。一旦乳液到达十二指肠，来自胆汁的额外的磷脂被加入。
脂肪水解通过舌脂肪酶(lingual lipase)和胃脂肪酶的作用在胃中开始。通过胃脂解作用释放的游离脂肪酸有助于刺激胰脂肪酶和辅脂肪酶(colipase)，它们负责大部分脂质水解。
随后十二指肠中的脂质乳液暴露于胰脂肪酶并被降解成甘油单酯和脂肪酸。通过这种形式，脂质被溶解成也称作混合微胶粒(mixed micelle)的小脂质微粒(lipid particle)，其由磷脂和胆汁组成。这些混合微胶粒将游离脂肪酸和甘油单酯运输至肠壁，在那里脂质通过肠壁被吸收。
尽管在调节饱满感的中枢信号的鉴定中取得了巨大的进展，并且在控制食欲的药物中进行了可观的投资，但是仍然需要改进。
发明内容
本发明人鉴定了能够诱导饱满感的一种新颖途径。显示在施用某些脂质后，部分所述脂质在胃肠道中(任选地在胃肠脂解作用后)采取晶体形式。在不受理论束缚的情况下，我们认为这些晶体脂质在空肠中不被吸收或仅被较差地吸收并且被运输至小肠的更低、更远端的部分。我们认为，如果脂质为晶体形式，则脂质吸收速率将降低。在小肠下部(即回肠)中，晶体缓慢溶解成混合微胶粒，脂质由此可运输到回肠壁并被身体吸收。我们认为，身体会由此注意到脂质仍存在于小肠更远端的部分中。然后身体向脑发出其处于饱满状态的信号，并向胃发出减少胃排空的信号：回肠制动机制。换言之，胃肠道中脂质吸收的调节用于引发饱满感。因此，本发明涉及脂肪酸晶体(特别是在胃肠道中，尤其是在回肠中)用于提高人或动物的饱满感的用途。
发明详述
在本说明书及所附权利要求书全文中，术语“包含”和“包括”及其改变形式解释为开放式表述。即，这些用语旨在表达上下文允许时，可能包括其他未具体指明的药物或整体。晶体和结晶在本文中可互换使用。
除非另外指明，否则所描述的脂质百分比是基于脂质总重量的重量百分比(即重量/重量％)。
冠词“一个/种”(“a”和“an”)在本文中指一种或多种/一个或多个(即多于一或至少为一)被修饰的物体。例如，“要素”可指一个要素或多于一个要素。
在一个实施方案中，本发明提供了在人或动物中诱导饱满感的方法，所述方法包括对所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式。
优选地，这种方法为美容用途或非治疗用途。本发明还提供了用于治疗目的的治疗受试者(即动物或人)的方法，这将在下文中具体讨论。
因此，本发明提供了可用于治疗理由(例如划分为超重的个体)、用于预防理由或用于美容或其他非治疗理由(例如未划分为超重的个体)的方法。
本发明提供了用于诱导饱满感的方法，即用于诱导餐后事件的方法，所述餐后事件减少进食需求，并影响至下一餐的间隔事件，从而调节进食频率或进食量，并减少两餐之间的进食或零食。这也可称为提供食欲抑制效应的方法。
或者，本发明提供了提供在人或动物的胃肠道(特别是小肠)中形成脂质晶体的方法，所述方法包括对所述人或动物施用有效量的脂质。此外，本发明提供了在人或动物的胃肠道(特别是小肠)中提供脂质晶体的方法，所述方法包括对所述人或动物施用有效量的脂质晶体。本发明的方法还可用于在受试者如人或(非人)动物中诱导饱满感。优选地，本发明的方法用于在人中诱导饱满感。
用于诱导饱满感的脂质经肠道提供，或优选经口提供。如下文所更详细讨论的，所提供脂质的部分能在其经过胃肠道时为晶体结构，或者脂质 的至少部分经过处理以使得所述脂质的至少部分在施用前具有晶体结构。此外，所述脂质还可由于脂解而形成，并继而采取晶体结构。与选择的途径无关，所述脂质的部分为晶体结构。晶体(或结晶固体)是一种固体物质，其组成原子、分子或离子以有序的重复构型在全部三个空间维度中延伸。晶体可具有不同的形状或结构。在一个优选的实施方案中，本发明方法中所用脂质的部分能采取针状结构或形状。以光学显微镜观察，这种针的平均长度可为5至50μm，平均大小为约20μm。通常，所述晶体大小是指单晶、多个独立单晶的聚集体可以更大。晶体可以为针状外形，由此可具有至少为5的典型长宽比(长度比宽度)。
如本文实验部分中所公开的，在摄入某些脂质的人的空肠样品中可见晶体。在其一个方面中，所用晶体必须能够在小肠中(更特别是在空肠中或在脂质进入空肠前)采取晶体结构。因此，本发明提供了在人或动物中诱导饱满感的方法，所述方法包括对所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所述脂质的至少部分在空肠中为晶体形式。
相当的晶体结构还可存在于例如胃、十二指肠和/或回肠(即小肠的远端下部)。
当分析取自人或非人动物的样品时，这种样品中至少20％(重量/重量)的脂质通常为晶体形式，这取决于脂质组合物中确实形成晶体的成分与不形成或几乎不形成这种晶体的其他成分之间的差异(例如取自允许摄入包含乳脂肪的奶的人或动物体的样品)。
因此，术语“至少部分为晶体形式的脂质”在本文中通常指“以脂质的总重量为基础，至少20％的重量为晶体形式(在小肠中，优选空肠中)的脂质”。更优选地，这是指至少25w/w％、30w/w％、35w/w％、40w/w％、45w/w％、50w/w％或更高如至少60w/w％、70w/w％、80w/w％、90w/w％。
所用脂质通常是固体或液体组合物中的部分。此类组合物中的其他组分可以为乳化剂(将在下文详细讨论)或调味剂组分或防腐剂。优选地，所述组合物包含脂质和乳化剂。在另一方面中，所述脂质为组合物中的唯 一(活性，即诱导饱满感的)成分，优选处于下述分散液中，其中所述脂质作为小颗粒(小于100μm)分散在水相中。优选地，所述水相包含如至少一种额外组分，其选自蛋白质、碳水化合物、调味剂、防腐剂、人工甜味剂或纤维构成的组。在另一方面中，所述脂质(可能还有乳化剂)是所述组合物中的唯一(活性，即诱导饱满感的)成分，优选处于下述分散液中，其中所述脂质作为小颗粒(小于100μm)分散在固体载体中。优选地，所述固体载体包含如麦芽糊精或葡萄糖浆，并还可包含至少一种额外组分，其选自蛋白质、碳水化合物、调味剂、防腐剂、人工甜味剂或纤维构成的组。
脂质的类型可以多种多样，例如甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯或者游离脂肪酸或游离脂肪酸的盐。因此，本发明提供了在人或动物中诱导饱满感的方法，所述方法包括向所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所述脂质优选地包含甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯或者游离脂肪酸或游离脂肪酸的盐。优选地，所述脂质为甘油单酯或者游离脂肪酸或游离脂肪酸的盐或其组合。更优选地，所述脂质为游离脂肪酸或游离脂肪酸的盐。此外，术语“脂质”用于指代由脂解产生的脂质组分。因此，术语“脂质”包括由胃肠道中的脂解产生的脂质组分。
本文使用的术语“甘油三酯”指三酰甘油(或三酰甘油酯)，即与三个脂肪酸链发生酯化的甘油。
术语“甘油二酯”或二酰甘油用于指代由通过酯键与甘油分子共价结合的两个脂肪酸链组成的甘油酯。甘油二酯可以是1，2-甘油二酯或1，3-甘油二酯。
术语“甘油单酯”(或单酰甘油)通常用于描述由通过酯键与甘油分子共价结合的一个脂肪酸链组成的甘油酯。甘油单酯可以是1-甘油单酯或2-甘油单酯。
术语“脂肪酸”用于指代脂肪族单羧酸，其衍生自动物或植物脂肪、油或蜡，或以酯化形式包含在动物或植物脂肪、油或蜡中。天然脂肪酸通常具有4至28个碳(通常无支链并为偶数)，可以是饱和或不饱和的 (顺式或反式、单不饱和或多不饱和)。术语“游离脂肪酸”用于指代未与甘油酯化的脂肪族单羧酸。
术语“游离脂肪酸的盐”用于指代与盐(例如但不仅限于钠(Na)、钾(K)或钙(Ca))形成键的游离脂肪酸。
任何这些脂质的商业来源可以是动物或植物，并且也可以合成产生。术语合成或半合成是指不完全是天然的和/或通过化学合成获得的物质。
甘油三酯类油优选为糕饼用油如棕榈油、乳木果油、allanblackia油、可可脂等。这种油的其他实例有完全氢化或部分氢化的大豆油、菜籽油、玉米油、棉籽油和葵花子油等或其级分。或者，所述甘油三酯组合物可通过上述油的掺和物的相互酯化而获得。
此外，本发明还涉及下述方法，其中甘油三酯类油包含油或脂肪的级分，例如棕榈油级分。也就是说，本发明所用的甘油三酯类油可得自经分级分离的棕榈油。该棕榈油级分可得自市售棕榈油，其可以被分级分离成合适的甘油三酯的特定混合物(基于主要分别为甘油的棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂酸酯的组合)，或得自来自上文所述其他来源的(部分)氢化并任选地相互酯化的油。棕榈油级分也称为例如棕榈酯。
因此，用于本发明的优选脂肪酸选自棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂酸构成的组。甚至更优选的组合物包含选自棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂酸构成的组的至少两种脂肪酸。
当所用脂肪酸的20-95w/w％(如20-80w/w％或如30-70w/w％)选自棕榈酸和硬脂酸，并且5-95w/w％(如80-20w/w％或如70-30w/w％)的脂肪酸选自油酸和亚油酸时，取得了特别好的结果。应该注意，这些量不一定必须总和为100w/w％，即不一定排除存在其他脂肪酸如月桂酸、豆蔻酸和亚麻酸。
在本发明的另一方面中，所用脂肪酸的至少80w/w％、优选至少90w/w％选自棕榈酸和硬脂酸及其组合构成的组。
脂肪酸组成可使用American Oil Chemists′Society，AOCS method Ce 1-62(参见www.aocs.org)所述脂肪酸甲酯(FAME)法，通过气-液层析来测定。
甘油三酯类油可以含有至少90％重量的甘油三酯，例如大于95％重量。此外，棕榈油级分中甘油三酯的含量可以为99％重量或更高。纯度可通过常规层析法来检测，例如薄层层析或高效液相层析。就甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和游离脂肪酸而言的脂质组成可通过层析来测定。标准方法描述于American Oil Chemists′Society(AOCS)，AOCS method Cd 1lc-93(参见www.aocs.org)。
工业规模的脂质生产是公知的，并已引入日常实践中，并已广泛描述于公开文献中，例如The Lipid Handbook：Edited by D.Gunstone，John L.Harwood，Fred B.Padley；第二版，Chapman and Hall，CRC Press，1994。甘油单酯和甘油二酯通常由母体甘油三酯和甘油制备，通过将甘油三酯/甘油混合物与痕量的催化剂(如氢氧化钠)一起加热来实现。所得混合物含有甘油单酯和甘油二酯。然后通过例如蒸馏来获得甘油单酯。游离脂肪酸通过水和催化剂存在下的化学水解经相似的过程获得。
在另一方面中，本发明方法中的脂质是游离脂肪酸，即不含甘油或与甘油分离的脂肪酸。在另一方面中，本发明方法中的脂质是游离脂肪酸的盐。
脂质的晶体形成对于甘油单酯特别显著(noticed)，尤其是基于包含至少16个碳原子的饱和脂肪酸的甘油单酯以及游离饱和脂肪酸或由游离脂肪酸的盐。因此，本发明提供了在人或动物中诱导饱满感的方法，包括对所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所述脂质是甘油单酯或游离脂肪酸或游离脂肪酸的盐。
所述甘油单酯中的脂肪酸或所述游离脂肪酸优选包含至少16个碳原子，例如16、18、20、22或24个碳原子，即，所述脂肪酸优选为C16、C18、C20、C22或C24脂肪酸。在其一个方面中，本发明提供了在人或动物中诱导饱满感的方法，所述方法包括向所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所述脂质包含至少一种C16或更高级的脂肪酸(即具有至少16个碳原子的脂肪酸)。对于甘油三酯或甘油二酯的情况，脂肪酸链的至少一个为C16或更 高级的脂肪酸。
另外优选的是饱和脂肪酸，即脂肪酸链的碳原子之间不具有双键的脂质，因此碳原子被氢原子完全饱和。
在另一方面中，本发明提供了在人或动物中诱导饱满感的方法，所述方法包括对所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所述脂质包含至少一种饱和脂肪酸。对于甘油三酯或甘油二酯的情况，脂肪酸中至少一个是饱和的。
在一个甚至更优选的实施方案中，所述游离脂肪酸或存在于甘油三酯、甘油二酯和/或甘油单酯中的脂肪酸或为C16或饱和的更高级的脂肪酸，即C16或饱和更高级的脂肪酸。
甚至更优选地，所用脂质包含至少一个16个碳原子且饱和的脂肪酸链。合适的实例是包含至少一个棕榈酸(具有16个碳原子)或硬脂酸(具有18个碳原子)的甘油三酯和甘油二酯。一种优选的甘油单酯包含棕榈酸或硬脂酸作为脂肪酸链。一种优选的游离脂肪酸是饱和的C16:0、C18:0、C20:0、C22:0、C24:0脂肪酸。此处及下文的“:0”这一标记表示不存在不饱和情况，即，16:0表示饱和的棕榈酸，C18:0表示饱和的硬脂酸。“:1”这一标记表示(游离)脂肪酸中存在一个不饱和碳-碳键，“:2”这一标记表示(游离)脂肪酸中存在两个不饱和碳-碳键。
另一个优选的实施方案中包括使用这样的甘油三酯，其在甘油部分的sn1或sn3位(即外侧碳原子位置之一)具有16个碳原子或更长的饱和脂肪酸。在甘油部分的sn2位(即中央碳原子位置)上优选地连接有不饱和脂肪酸或较短的脂肪酸(14个碳原子或更少)。优选地，所用脂质为植物油，即植物来源的脂质。
在另一优选的实施方案中，所用脂质在室温至体温下为固体。“在室温至体温下为固体”这一用语表示在室温与体温的整个区间中应有固体脂肪内含物(content)。“固体脂肪内含物”为本领域技术人员已知，并可使用标准方法测定，如 www.minispec.com/applications/solid_fat_content.html所提供。换言之，该术语表示在体温下应至少有固体残留物和可检测固体脂肪内含物。残留物 和可检测固体脂肪内含物可以大致为多于0,1w/w％，例如0,5w/w％、1w/w％、2w/w％、3w/w％、5w/w％、10w/w％或更多。固体脂肪内含物可通过桌上型NMR(如Brucker Minispec)使用ISO 8292或IUPAC 2.150法测定。这些方法得出熔融曲线，由此可容易地确定给定的脂质组合物是否在室温至体温范围中具有固体脂肪内含物。测定固体脂肪内含物的其他方法包括AOCS法：2000年修改的AOCS Cd 16b-93；Direct Method；以及2000年修改的AOCS Cd 16-81，Indirect Method，参见www.aocs.org。
室温用于表示大致室温，其是根据本发明使用组合物的温度。其通常为约20℃，例如18、19、20、21或22℃。
体温在物种之间稍有差异，本文中该术语用于表述待治疗的人个体或动物的体温。通常约为37℃，例如36、36.5、37、37.5、38、38.5或39℃。
在另一实施方案中，本发明提供了在人或动物中诱导饱满感的方法，所述方法包括向所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，还包括施用乳化剂。所用脂质和乳化剂可在短时间内(如10分钟内)彼此独立地施用。更优选地，在9、8、7、6、5、4、3、2、1或0.5分钟内施用包含所述脂质和所述乳化剂的组合物。所述脂质和所述乳化剂优选同时施用。还可以由所述脂质和所述乳化剂制备组合物(如水包油乳液)，并向人或动物施用所述组合物(即乳液)。或者，可以由所述脂质和所述乳化剂制备分散液，并向人或动物施用所述分散液。
本领域已知，良好的乳化剂能促进从乳液液滴形成脂质组分晶体(Boode和Walstra，1993)。尽管蛋白质可以作为乳液的良好稳定剂，但它们不能促进晶体形成。因此，本发明的一部分是，所述脂质组合物在发生胃肠道脂解后存在良好乳化剂。本发明情况下的良好乳化剂包括能刺激在胃肠道脂解后由乳液形成脂质晶体的乳化剂。所述晶体可从脂质液滴生长至水相中。
任何乳化剂均可用于本发明方法中，然而优选食品乳化剂。食品乳化剂是普遍用于食品应用中的乳化剂，通常是由亲水部分和亲脂部分组成的 酯。通常，亲脂部分包含硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸或亚麻酸或者所述脂肪酸的组合。亲水部分通常包含羟基、羧基、氧乙烯基、糖、碳水化合物、磷酸卵磷脂或乙醇胺。
食品级乳化剂家族的实例有卵磷脂、甘油单酯和甘油二酯、丙二醇一酯、甘油单酯和甘油二酯的乙酸酯、甘油单酯和甘油二酯的乳酸酯、甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯、甘油单酯和甘油二酯的酒石酸酯、甘油单酯和甘油二酯的的单乙酰基和二乙酰基酒石酸酯、聚甘油酯、硬脂酰乳酸钠或镁、山梨坦酯、乙氧基酯、聚山梨酯、琥珀酰酯、果酸酯、磷酸甘油单酯和甘油二酯、以及蔗糖酯。脂质乳液也可通过将脂质与合适的食品或食品产品混合而获得，其利用所述食品或食品产品或该食品或食品产品中组分的固有乳化特性。本发明方法中所用食品乳化剂能乳化脂质总重量的大于20％重量的脂质，更优选大于40w/w％，得到分散液(优选乳液)，其仍为液体，以利于加工可掺入该分散液(优选乳液)的食品产品。
本发明优选的乳液是卵磷脂，例如从卵黄、乳、大豆油、葵花子油或菜籽油中制备的卵磷脂，其由主要为磷脂(如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸丝氨酸和磷脂酸)及其溶血磷脂等同物的混合物组成。本文中，卵磷脂指所述磷脂的粗制混合物，其通过粗制植物油去胶获得，并且可作为食品乳化剂购得。本发明另一优选的乳化剂由聚山梨酯类(聚氧乙烯失水山梨醇酯，也称为商品名吐温，例如Roche，Germany的吐温80)以及用食品级酸(如乳酸、柠檬酸、酒石酸或二乙酰基酒石酸)衍生的甘油单酯和甘油二酯。
特别优选的乳化剂是基于半乳糖脂的乳化剂或其衍生物。因此，用于本发明方法的乳化剂可包含一种或多种半乳糖脂。半乳糖脂属于糖脂类，是植物细胞膜的熟知组分。其最重要的类别包含与二酰甘油或单酰甘油以糖苷键连接的一个或四个糖。两个丰度最高的类别分别包含一个和两个半乳糖单元，其普遍使用的命名和缩写为单半乳糖甘油二酯和双半乳糖甘油二酯(MGDG和DGDG)或者单半乳糖基甘油单酯和双半乳糖基甘油单酯(MGMG和DGMG)，又是称为半乳糖脂。已经研究了半乳糖脂(主要为DGDG和富含DGDG的材料)并发现其是工业应用(例如食品、化妆 品和药物产品)中有意义的表面活性材料。半乳糖脂乳化剂描述于WO 95/20943和WO 97/11141。半乳糖脂乳化剂的优选来源为谷物和谷类，特别是燕麦。优选地，半乳糖脂乳化剂的来源是经分级分离的燕麦油。
在本发明的一个方面中，本发明提供了在人或动物中诱导饱满感的方法，包括向所述人或动物施用有效量的包含这种的组合物，所述这种的至少部分在小肠中为晶体形式，还包括施用乳化剂，其选自卵磷脂、基于半乳糖脂的乳化剂或其衍生物或其混合物。
本发明的一个优选方面是下述组合物的用途，其中本发明方法中所用的半乳糖脂与棕榈油、分级分离的棕榈油和/或所有其他上文所述油组合相组合。例如，适用于本发明方法的组合物可包含甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、游离脂肪酸或游离脂肪酸的盐(或其任何组合)以及棕榈油或分级分离的棕榈油。
此外，在使用分级分离的燕麦油作为基于半乳糖脂的乳化剂时获得了特别好的结果。因此，本发明还涉及下述组合物的用途，其中基于半乳糖脂的乳化剂是分级分离的燕麦油。
脂质和乳化剂的水包油乳液可通过将乳化剂单独使用或与其他两亲混合物(如助表面活性剂)组合使用而制备。水包油乳液还可包含任选的本领域已知改进组合物不同方面的添加剂，如调味剂、甜味剂、着色剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂等。
水包油乳液可通过常规方法制得。例如，水中30wt％脂质的乳液可通过将乳化剂加入所述脂质中来制得。连续相可以是纯水或含有水溶性添加剂(如等渗剂、甜味剂、调味剂和防腐剂)的水溶液。必要时，随后可以调整水相的pH。将油相和水相预热，然后在高剪力混合条件下将油相加入水相中。然后可对预制乳液进行高压匀浆。或者，可将乳化剂分散到水相中，其后在高剪力条件下添加油相，任选地随后进行高压匀浆。
应该强调，乳化剂的乳化能力取决于乳化剂的性质和特性。上述分级分离的燕麦油可以不经进一步纯化而以组合物总重1-20％的量用作乳化剂，以制备甘油三酯总量5-60％的水包油乳液。WO 95/20943的半乳糖脂乳化剂应以组合物总重0.1-5.0％的量使用，以制备甘油三酯重量5-80％的 水包油乳液。
本发明方法所用的脂质组合物中至少16个碳原子的饱和脂肪酸的量可以改变。优选地，基于所述组合物中所存在脂肪酸的总量，具有至少16个碳原子的饱和脂肪酸的量为至少45w/w％，即，本发明提供在人或动物中诱导饱满感的方法，包括对所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所述C16或更高级的饱和脂肪酸以所述组合物中脂肪酸总量的至少45w/w％存在。更优选地，该量为46，47，48，49，50，55，60，65，70，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或甚至100w/w％。本领域技术人员熟知如何获得这种脂质组合物。例如，能够获得食品级的棕榈酸或硬脂酸。
本发明提供了在人或动物中诱导饱满感的方法，所述方法包括对所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所述脂质包含棕榈酸(即C16:0)或硬脂酸(即C18:0)或其组合。
本发明提供了在人或动物中诱导饱满感的方法，所述方法包括向所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所述脂质包含至少45w/w％的棕榈酸和/或硬脂酸。
如果所述脂质同时包含棕榈酸和硬脂酸，则这两种脂肪酸之间的重量比可以不同。例如，可以使用10∶90，20∶80，40∶70，40∶60，50∶50，60∶40，70∶30，80∶20或90∶10的棕榈酸∶硬脂酸比例。
本发明方法中所用的脂质可以已经包含一定量的晶体形式的脂肪酸。例如，可通过将棕榈酸(优选食品级)加热至其熔点并分散在水中或含水物质中(优选在高剪力混合条件下)来获得棕榈酸晶体。然后可对分散液进行匀浆。最后，使棕榈酸分散液冷却。所得产物将包含棕榈酸晶体。在另一优选的实施方案中，在上文所述方法中将棕榈酸与良好乳化剂(如富含半乳糖脂的脂质级分)一起进行分散以形成晶体。
在另一实例中，可通过将硬脂酸(优选食品级)加热至其熔点并分散在水中或含水物质中(优选在高剪力混合条件下)来获得硬脂酸晶体。然后可对分散液进行匀浆。最后，使硬脂酸分散液冷却。所得产物将包含硬 脂酸晶体。在另一优选的实施方案中，在上文所述方法中将硬脂酸与良好乳化剂(如富含半乳糖脂的脂质级分)一起进行分散以形成晶体。
通过相似的方法，可获得棕榈酸和硬脂酸晶体的组合，例如通过使用食品级棕榈酸和食品级硬脂酸作为起始原料。在一个优选的实施方案中，本发明提供在人或动物中诱导饱满感的方法，包括向所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所施用脂质的至少部分在施用前为晶体形式。在另一方面中，所施用的脂质不是其将在胃肠道中所形成的最终晶体形式。在运输通过胃肠道时，所述脂质可发生(部分)脂解，并因此在经消化的脂质组合物中形成不同的脂质组分。新形成的脂质更易于形成在小肠中的混合微胶粒(促进脂质运输至肠壁的微胶粒)中难溶的晶体。在这种情况下，优选还加入乳化剂，因为乳化剂的存在可促进胃肠道中脂质晶体的形成。
在另一方面中，在向人或动物提供食品、饲料或饮料之前、之时或之后向所述人或动物提供包含脂质(任选与乳化剂组合)的组合物。术语“之前”或“之后”指与所述食品、饲料或饮料相比为约0.1至180分钟的时间范围。换言之，在向人或动物提供食品、饲料或饮料之前0.1至180分钟或之后0.1至180分钟提供脂质和任选的乳化剂。更优选地，所述时间差异为0.1至60分钟、0.1至30分钟、0.1至15分钟、0.1至10分钟或0.1至5分钟。
在本发明的一个方面中，本发明提供在人或动物中诱导饱满感的方法，包括向所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分为晶体，其中所述脂质至少包含棕榈酸或硬脂酸或其组合。
因此，本发明提供在人或动物中诱导饱满感的方法，包括向所述人或动物施用有效量的包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所述组合物在食品、饲料或饮料产品之前、同时或之后施用。在该实施方案中，所述脂质作为包含脂质的补充剂提供，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式。这种补充剂可以是液体或固体组合物。液体补充剂的合适实例是小体积的液体突击或水中的分散液，包装在例如杯、小杯或袋中。固体补充剂的合适实例是片剂或喷雾干燥的粉剂。适用于人或动物摄入的补充剂在此处和下文中也可称为食品补充剂或饲料补充剂。
合适的食品、饲料或饮料的实例为乳制品，包括但不仅限于酸奶、奶、奶酪、酸奶油、乳粉、黄油、乳备选物、冰淇淋、人造黄油、抹料、蘸料、酱汁或酱料、加工肉制品、糕饼、填料、汤、水果饮品、基于茶或咖啡的饮料、软饮料、水感饮料、包含最高35％体积乳和／或乳组分的饮料、咖啡奶精、点心、巧克力、糖果或其他糕饼、烘焙食品、能量棒、谷物棒、基于蛋白质的棒、意面产品和其他谷物产品、早餐谷物或麦片、卡士达酱、餐食替代产品。任选地，所述合适的食品与其他方法(如某些纤维)相组合以诱导饱满感。
如上文所述，包含脂质(任选地与乳化剂组合)的组合物可与食品、饲料或饮料一起提供。这可如下进行：将所述食品、饲料或饮料与所述脂质作为两个单独的物品提供，并同时施用它们，或将所述脂质掺入食品、饲料或饮料中。
因此，本发明还提供在人或动物中诱导饱满感的方法，包括对所述人或动物施用有效量的脂质(任选地与乳化剂组合)，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所述组合物是食品、饲料、饮料或补充剂的部分。
本文所述方法可在体重减轻过程中或之后使用。这种体重减轻可以是通过治疗介入或个人努力而实现的。通常，术语“体重减轻”指体重减轻了原始或基线体重的至少约2％，例如至少约3％，至少约4％，至少约5％，至少约7％，至少约10％或至少约15％。这种体重减轻可以在例如1、2或3至5、6、10、18或更多周中实现。或者，体重减轻也可以表达为体重指数(BMI)在上述时间中减少2或更多。本文所述诱导饱满感的方法通常与减肥或体重保持计划一起使用或在其之后使用。使用本发明方法的个体可以采取导致负能量平衡的膳食方案。也就是说，本发明方法可用于处于负能量平衡的个体。能量平衡定义为能量摄入减去能量输出。如果能量摄入不足以满足维持和生产的需求，则称个体处于负能量平衡。因此，负能量平衡的个体是能量摄入(从食品和饮料中)小于能量消耗(通过代谢和日常获得的能量消耗)的个体。
当能量摄入大致等于能量输出时，个体处于中性能量平衡。就本发明而言，负能量平衡的个体可以处于任何负能量平衡程度。通常，个体将基于每日测定为负能量平衡，但就本发明而言，个体也可以基于长于或短语一周的时间测定为负能量平衡，例如约12小时或约1周、约2周、约6周或更久，优选地为摄入本文所述混合物的全部时间。
负能量平衡的个体可以是这样的个体，其能量摄入为获得中性能量平衡所需能量摄入的约90％或更少、约80％或更少、约70％或更少、约60％或更少、约50％或更少。
维持中性能量平衡所需的能量摄入将根据取决于多种变量而变化。然而，中等活动生活方式的女性的推荐能量摄入为每天约2000至2200千卡。中等活动的男性的数字为每日约2500至约2800千卡。这些数字可根据年龄调整，例如老年(约70岁以上)或年幼(约10岁以下)的个体实现中性能量平衡所需的能量摄入通常较低。此外，活动更多的个体很可能需要更高的能量摄入来实现中性能量平衡。营养师能够给出实现中性能量平衡的大致能量摄入(并因此给出实现特定的负能量平衡程度所需的能量摄入)。
因此，就本发明而言，如果个体摄入每天小于约2000至约2200千卡(女性)或每天约2500至2800千卡(男性)，则通常认为其处于负能量平衡。然而，尽管如此，摄入更多或更少能量的个体也可能处于负能量平衡，这取决于其具体的情况。
当个体处于负能量平衡或体重降低计划时，这种膳食方案可优选为低热量膳食(LCD)。能量摄入为800千卡或更低的膳食定义为极低热量膳食(VLCD)。使用本发明混合物的个体可进行LCD或VLCD。
瑞典食品管理局建议，每日三餐并1至3次零食，以维持中性能量平衡。能量分布推荐为：早餐约20％至约25％，午餐约25％至约35％，晚餐约25至约35％。这提示，午餐能量摄入可为约500千卡至约770千卡(女性)和约625千卡至约890千卡(男性)。因此，负能量平衡可通过减少一餐或多餐(如午餐(与上述能量相比)和/或晚餐和/或早餐)的能 量摄入而维持其他餐的正常(中性)能量摄入来实现。
使用本发明方法的个体可以正经历膳食替代方案。也就是说，可以实施本发明的方法，其中个体(即人或动物)实施膳食替代方案，即使用膳食替代产品。这可以是实现负能量平衡的一种便利方法。在这种方案中，个体摄入膳食替代物(如液体产品或固体棒的形式)来代替一次、两次或更多次的常规日常进餐。此外，节食者可摄入一餐、两餐或更多餐的真实食物(可以是控制热量的，例如提供每日约400千卡至约600千卡)。一些液体膳食计划为这些“真实”餐食提供预包装的餐食选择。膳食替代产品通常含有约100至约400千卡，例如约150至约250千卡。它们可包含至少约25％蛋白质和至少约3种维生素和矿物质。多数市售的产品含有约2至10g纤维。
这种膳食通常可提供每日约1000千卡至约1500千卡的总能量摄入，例如每日约1200千卡至约1400千卡。
实施本发明方法的个体可实施VLCD。这在医学上定义为每天800千卡或更低的膳食。VLCD是配方的营养完全的液体或固体餐食。VLCD还含有推荐的每日维生素、矿物质、微量元素、脂肪酸和蛋白质需求。VLCD产品通常是粉末，其与水、果汁或其他低热量液体混合。这种膳食通常在医学督导下进行。
本发明方法可用于提高膳食替代方案、LCD或VLCD的顺应性。这是因为本发明方法中所用液体导致后续的膳食替代无、LCD或VLCD产品诱导或加强饱腹感，使得个体更易于忍受膳食替代产品、LCD或VLCD的低热量水平。提高顺应性是指在膳食替代方案、LCD或VLCD情况下，摄入混合物的个体可在更长的时间中维持该方案(与不摄入该混合物与膳食替代方案、LCD或VLCD的个体相比)。
因此，本发明提供在人或动物中诱导饱满感的方法，包括对所述人或动物施用有效量的脂质，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式，其中所述人或动物处于负能量平衡和/或其中所述人或动物正进行膳食替代方案、体重降低计划或体重保持计划。
本发明方法中所用脂质可在至少1周、至少2周、至少4周、至少8 周、至少12周、至少16周或更长时间中每天摄入。可以在单个时间段中或者多个时间段中(以不摄入该混合物的膳食(例如中性能量平衡的膳食)为间隔)摄入所述脂质，实现本发明的目的。
在另一实施方案中，本发明提供了包含下述脂质的组合物，其中所述脂质的至少部分为晶体形式或能形成晶体。例如，脂质的量为至少0.5克结晶脂质(由C16:0和更高级的饱和游离脂肪酸(任选地与合适的乳化剂组合)构成)，其以该状态通过胃进入小肠。在另一实例中，该量为至少1克C16:0或更高级的饱和脂肪酸(为任何类型的脂质组分——甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯或游离脂肪酸或游离脂肪酸的盐(任选地与合适的乳化剂组合))，其在进入胃肠道之前即为晶体形式或在转移至胃肠道时转变成晶体形式。
如上文所述，脂质的类型可以多种多样，例如甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯或游离脂肪酸或游离脂肪酸的盐。因此，本发明提供包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分为晶体形式，其中所述脂质为甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯或游离脂肪酸或游离脂肪酸的盐。上文所述所用脂质的特征同样适用于本发明的这一部分。
这种组合物可原样提供(即作为补充剂)或者掺入或加入食品、饲料或饮料中。所用脂质优选包含(或者是)具有至少16个碳原子的饱和脂肪酸。在一个优选的实施方案中，所述C16或更高级的饱和脂肪酸得自棕榈油或棕榈脂。棕榈油含有约45w/w％的C16:0+C18:0，棕榈脂含有约60w/w％的C16:0及以上。
更优选地，这种组合物包含至少50，55，60，65，70，75，80，85，90，95w/w％或甚至更高百分比的C16:0或更高级的饱和脂肪酸。
本发明还提供包含下述脂质的组合物，所述脂质中至少约45w/w％的脂肪酸是C16或更高级的饱和脂肪酸。
本发明的还提供了包含下述脂质的组合物，所述脂质中至少约45w/w％的脂肪酸是C16或更高级的饱和脂肪酸，其中所述脂质至少包含棕榈酸、硬脂酸或其组合。
本发明的另一方面提供了包含下述脂质的组合物，所述脂质中至少约 45w／w％的脂肪酸是C16或更高级的饱和脂肪酸，其中所述脂质得自(任选地分级分离的)棕榈油、棕榈脂或乳木果油。
本发明还提供包含至少1克额外脂质的食品、饲料、饮料或食品补充剂，所述额外脂质包含45w／w％的C16或更高级的饱和脂肪酸。优选地，所述食品含有至少1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8或1.9克额外脂质，并且中所述脂质的至少45w／w％是C16或更高级的饱和脂肪酸。本发明还提供包含至少2克额外脂质的食品、饲料、饮料或食品补充剂，所述额外脂质包含45w／w％的C16或更高级的饱和脂肪酸。
本文所述额外脂质是不原始存在于所述食品、饲料或饮料成分中，而是作为额外成分添加的脂质。
如上文所述，本发明方法优选地为美容方法或非治疗方法。然而，本发明人的知识也可用于治疗方法中。因此，本发明还提供了下述脂质用于制备治疗或预防肥胖症、超重、心血管疾病和／或糖尿病的药物的用途，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式。换言之，本发明还提供了治疗患有肥胖症、超重、心血管疾病和／或糖尿病的人或动物的方法，包括向所述人或动物施用有效量的下述脂质，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式。
在另一实施方案中，本发明提供制备食品、饲料、饮料或食品补充剂的方法，包括向所述食品、饲料或饮料中添加或掺入上文所述组合物，优选与乳化剂相组合。原则上，这种组合物包含本文所述脂质，并可加入或掺入多种食品、饲料、饮料或补充剂(通常为食品补充剂)中。在一个优选的方面中，所述食品、饲料或饮料为乳制品、乳备选物、冰淇淋、人造黄油、抹料、蘸料、酱汁或酱料、加工肉制品、糕饼、填料、汤、水果饮品、基于茶或咖啡的饮料、软饮料、水感饮料、包含最高35％体积乳和／或乳组分的饮料、咖啡奶精、点心、巧克力、糖果或其他糕饼、烘焙食品、能量棒、谷物棒、基于蛋白质的棒、意面产品和其他谷物产品、早餐谷物或麦片、卡士达酱、餐食替代产品。任选地，所述合适的食品与其他方法(如某些纤维)组合，以诱导饱满感。
水感饮料是稍带口味的饮料，其具有低热量，如低于20kcal／100ml， 优选10kcal/100ml或更低。其也可以是茶类水感饮料，例如包含柠檬的茶蒸汽蒸馏提取物。
本发明还提供了制备食品、饲料、饮料或补充剂产品的方法，包括向所述食品、饲料或饮料中加入或掺入上文所述组合物，其中所述食品、饲料或饮料是增强饱满感的食品、饲料、饮料或补充剂产品。
在一个优选的实施方案中，所述食品、饲料或饮料产品具有每份50-250千卡范围内的卡路里含量。
在另一实施方案中，本发明提供了食品、饲料或饮料产品，其可通过包括向所述食品、饲料、饮料或食品补充剂中添加或掺入上文所述组合物的食品、饲料、饮料或食品补充剂产品制备方法来制备。
如上文所述，在人或动物中诱导饱满感的方法(其包括向所述人或动物施用有效量的脂质，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式)可与膳食替代、体重降低计划或体重保持计划组合。
本发明还提供了用于诱导饱满感或抑制食欲的试剂盒，其包含膳食替代产品和包含下述脂质的组合物，所述脂质的至少部分在小肠中为晶体形式。
在另一方面中，本发明提供了减肥或体重保持计划，包括提供本文所述组合物或者本文所述食品、饲料、饮料或食品补充剂。
通过以下实施例来说明本发明。
实施例
通过棕榈油的分级分离获得分级分离的棕榈油，例如可以使用Akofrite(来自瑞典Karlshamn的棕榈油的商品名)。棕榈油分别基于主要是棕榈酸甘油酯、油酸甘油酯、亚油酸甘油酯和硬脂酸甘油酯的组合而被分级分离成合适的甘油三酯的特定混合物。优选地，棕榈油级分中甘油三酯的含量应当不少于按重量计99％。分级分离的棕榈油在20℃和35℃下分别具有31％和6％的固体脂肪含量(N20和N35)。使用的分级分离燕麦油包含约20％的DGDG，并且根据WO 97/11141从燕麦制备。
实施例1
为了显示将具有高C16:0含量的脂肪与乳化剂体内组合的乳液的晶体形成效应，进行了以下的实验。
使用LOC-I-GUT技术(由Knutson et al.(1989)和 et al.(1992)全面描述)，在瑞典Uppsala的University Hospital，Clinical Research Department进行单程空肠灌注研究(Single-pass jejunal perfusion studies)。十六位健康的志愿者参与该研究，所述志愿者年龄23到36岁(男性平均28.0，女性平均27.9)，体重66-86kg(男性)和50-70kg(女性)，平均BMI为23.1(男性)和22.2(女性)。研究者以下述方式对所述研究不知情：实验室中的工作人员或受试者均未被告知在两种不同的研究情况下被给予何种化合物。还以随机化交叉方式进行研究，研究访视之间有至少5天的间歇期。所述随机化的处理顺序确保正确的统计学。
所有的受试者在实验前一天采取标准化的膳食，因为他/她们从机构接受要被消耗的所有食品。根据分别针对20-50岁具有正常体力活动的男性和女性的Swedish Nutrition Recommendations(SNR)设置能量和常量营养素水平(男性2900Kcal，女性2200Kcal；En％C/F/P 55/30/15)。
在禁食过夜10小时后，通过嘴引入LOC-I-GUT输注管(Synectics Medical，Stockholm，瑞典)，并在荧光指导(Philips BV 21-S)下置于小肠近端中。
在16个受试者中的11个中，从所有时间段和两个胃肠取样位点获得样品。在5个受试者中一些胃肠样品缺失，因为这些实验未能持续180分钟，或者未能获得样品。通过重复测量的方差分析，对两个处理组中多次测量的数据进行研究(ANOVA)(Univariate Mixed Effect Model Approach)。
LOC-I-GUT 灌注技术设定如下：将多通道管放进测试目标(志愿者)中。管(瑞典Synectics Medical，Stockholm)长175cm，并且由聚氯乙烯制成，外径5.3mm。其含有六个通道，远侧有两个40mm长的、伸长的乳胶气球，分开10cm放置，每个单独与更小的通道之一连接。在该研究中，只膨胀远端的气球，从而避免流体从胃肠道进一步向下。
管中心两个更宽的通道用于灌输和灌注液的抽吸。剩下的两个外周更 小的通道被用于施用标记物质和/或用于引流。管的远端是附加的钨重物，以便于管进入空肠。独立的管进行胃抽吸。
在荧光指导(Philips BV 21-S)下将LOC-I-GUT 输注管置于受试者小肠的近端部分中。用利多卡因喷雾对喉应用局部麻醉(Xylocain 10mg/剂，AstraZeneca， 瑞典)后，通过口引入LOC-I-GUT 管。插入期间，使用仪器内被Teflon包裹的导线帮助管进入小肠(Amplatz extra stiff wire guide，William Cock Europe A/S，Bjaereskov，丹麦)。在该研究期间，肠区段和咬合的气球被置于空肠的近端部分中。
在所有受试者中，管被放置在肠中大致相同的位置处，这使用自动化200毫秒关闭的盘式存储器测定和计算，所述盘式存储器含有来自完成的荧光透视法的不同框架。通过所述盘式存储器的帮助，检查近端空肠中管放置所需的总荧光透视时间总是小于15秒。完成每个实验后，受试者被再次带进荧光透视室，并且测定每个实验结束时管的位置。进行所述第二研究，从而测定实验期间管是否进一步向下传递进入肠。与LOC-I-GUT 灌注管一起，将另一管置于胃中，用于灌输不同的测试物质，以及用于从胃获得样品用于不同的分析(Salem sump tube，Sherwood Medical，U.K.)。
一旦灌注管到位，用约26-30ml空气使气球膨胀。在每个实验开始时，从胃管顶部(不同的食品从此处灌输)到近端空肠中咬合的气球(在此处收集与不同的乳化合物混合的肠液)之间的距离约为35cm。
通过胃管灌输酸奶之前，收集所有胃流体并用20ml盐水溶液代替。灌输后，以有规律的时间间隔采样。30分钟后采取约10ml胃样品并用10ml盐水溶液代替。180分钟后实验结束时，恢复胃的总含量。在三小时期间，每30分钟在小瓶中收集肠样品并保持在37℃下。将获得的所有样品精确称重，并用每克样品0.1g 1M HCl溶液将pH直接调节至低于3，使用液氮立即冷冻，并储存于-80℃下直至冻干。之后干燥的样品仍储存于-80℃下。用HCl降低pH之前，保留一滴样品进行显微镜分析。
对该研究而言，研究了两种酸奶制品，一种含有乳脂肪(也称作参照组合物)，另一种含有经纯化的棕榈油和作为乳化剂的经分级分离的燕麦 油的乳液(也称作活性组合物)。后一组合物以下述方式制造。
制备含有42.5wt％的具有经纯化的棕榈油和分级分离的棕榈油的乳液。(活性组合物脂肪)
成分 wt％
水 57.5
分级分离的棕榈油 40.0
分级分离的燕麦油 2.5
如上文所述获得分级分离的棕榈油和分级分离的燕麦油。
通过将棕榈油经过二氧化硅柱来纯化棕榈油，使用乙醇萃取粗制燕麦油后获得燕麦油。在50℃下融化棕榈油并与分级分离的燕麦油混合。将油相和水相预加热至65-70℃，然后在15,000rpm下高剪力混合4分钟的条件下将油相加至水相中。在60℃下，以1000Bar将预乳液匀化6个循环(Rannie homogenizer，Model Mini-Lab 8.30 H，APV Rannie，丹麦)。
乳液可作为FabulessTM从荷兰DSM商业获得。
在较早的研究(WO99/02041)中显示，此类经纯化的棕榈油和分级分离棕榈油的乳液是在人中具有饱满感诱导效应的组合物。
A)具有乳脂肪的酸奶(参照组合物)
在83.5℃下将商业(品牌Albert Heijn)全脂奶和脱脂奶的混合物(6∶1)巴氏消毒35分钟。将其冷却至15℃并储存过夜。将稳定设定为43℃并且添加176μl/L的引发剂CY222。约4.5小时后pH低于4.6，使用Rannie实验室匀化器(APV匀化器，AS，Albertslund，丹麦)在150bar下匀化酸奶。将Cream Flavour(540040H，Givaudan)搅拌成酸奶(0.1g/L)。将酸奶在150g罐中储存于4℃下。酸奶的热含量在表1中给出。以这种方式生产了两批用于实验。两批的平均颗粒尺寸分别为621/572nm且21.6/16.2％＞1μm，用pH 12的EDTA溶液处理酸奶(1份酸奶比10份EDTA溶液)以溶解蛋白质后通过Beckman Coulter的LS 13 320激光衍射颗粒尺寸分析仪测定。
B)具有活性组合物脂肪的酸奶(活性组合物)
使用微波炉将1120g脱脂奶加热至～45℃。将活性组合物 (KLB06027)加热至～35℃，并将80g小心添加进奶中。使用L4RT型实验室混合仪(Silverson Machines Inc，East Longmeadow，MA，USA)，在900rpm下将混合物匀化10分钟。巴氏消毒和所述方法的剩余部分与具有乳脂肪的酸奶相同。以所述方式生产两批用于实验。两批的平均颗粒尺寸分别为589/520nm且13.8/11.7％＞1μm。
表1：具有活性组合物的酸奶和具有乳脂肪的酸奶的组成
分析所有样品中的脂质组成：按甘油酯类别计的总脂质组合物：甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯，和游离脂肪酸(“MDT方法”)和脂肪酸组成(总脂质组合物的游离脂肪酸含量和脂肪酸含量(“FAME”))。
通过高压液相色谱法(HPLC)测定总脂质组成(“MDT”)。首先提取冻干的样品：用1ml溶剂混合物(庚烷氯仿3∶1)提取20mg匀化的样品。然后使用0.2μm PVDF膜通过过滤去除固体材料，并将10μl注入装有极性(氰基)柱的正相HPLC(Agilient 1100液相色谱仪，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)中，并进行蒸汽光散射检测(ELSD；Sedex 75；Polymer Laboratories Ltd，Shropshire，UK)。使用庚烷叔丁基甲基醚的梯度作为过柱介质。使用校准线和Chromeleon Chromatography Management System程序(Dionex Corporation，Sunnyvale，CA)测定组分。通过使用根据测试产物的脂肪酸组成计算的平均分子量将数值转化成摩尔。使用有机溶剂梯度，用正相色谱系统分离脂质。用已知组成的商业样品测定滞留时间。
通过FAME方法(脂肪酸甲基酯)测定整个脂质组合物的脂肪酸模式。将样品量的粗制样品皂化和酯化成其甲基酯，并且针对十五酸甲基酯的内部标准原样定量。在顶空小瓶中精确称重约30mg样品和20mg十五酸酯。向每个管中添加磁性搅拌器、1ml甲苯/BHT-溶液和4ml 0.5N NaOH-溶液。用波纹帽(crimp cap)封闭小瓶，轻柔搅拌并在加热模块中于100℃下加热5分钟。冷却后添加5ml BF3-溶液(三氟化硼-甲醇-复合物：Merck；801663)，将小瓶再次封闭并在100℃下再次加热30分钟。冷却后添加4ml庚烷和5ml饱和的NaCl溶液。彻底混合后，在10分钟内将小管于3000rpm下离心。使用装有火焰电离检测器、熔融二氧化硅柱(CP-Sil-88)的Hewlett Packard 5890系列2GC进行气象色谱分析，注入体积1μL，以氮作为载体气体。
通过先前描述的FFA方法测定脂质组合物游离脂肪酸部分的模式(de Jong C，Badings HT.Determination of free fatty acids in milk and cheese，J High Res Chrom 1990；13：94-8.)。
30分钟(胃)和60与180分钟(空肠)后采取用于显微镜观察的样品。在MV 1500下用具有成像程序Lucia GF的Nikon Eclipse E800光学显微镜观察样品。将一滴样品置于显微镜载玻片上并覆盖。立即通过光学显微镜观察，使用相差模式，通常使用40x物镜。立即采取至少4张图像，每个测试目标的每个样品的每个象限一张图像。
下表针对灌输酸奶后60分钟和180分钟采取的空肠样品给出(使用MDT分析的所有脂质：甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯和游离脂肪酸)脂质组成和脂肪酸组成(仅MDT分析)。
从表2中可以看出，游离脂肪酸是所有空肠样品的主要脂质组分。在整个时间段中，活性处理中的总脂质水平比乳脂肪处理中显著(P＜0.05)更高，即使对两种处理而言施用了相同水平的脂质。这说明与乳脂肪处理相 比，来自活性处理的脂质被人体更少地吸收。
这还阐述于表3中，其中提到了相对FFA含量。
表2：60或180分钟后空肠样品中的绝对甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯与游离脂肪酸(FFA)量(MDT方法，以mg计)的平均值(J60，J180)
表3：60或180分钟后空肠样品中的相对甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯与游离脂肪酸(FFA)量(以脂质总量的重量为基础wt％(即w/w％))的平均值(J60，J180)
表3中给出了甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和游离脂肪酸的相对水平。从表中可以看出，对两种处理而言，60和180分钟时空肠中的大部分脂质都由游离脂肪酸组成。
从表4中可以看出，与起始组合物相比，活性处理的C16:0和C18:0可观地被富集并且C18:1可观地被耗竭，而具有乳脂肪的对照产品未被提高(C16:0 FFA比起始组合物，最丰富的组合物—见表3)，或多少有些提高(C18:0 FFA)或C18:1多少有些降低。活性处理中更高的脂质水平尤其显示更高的棕榈酸水平。
显微镜观察结果中最令人惊讶的特征是在摄入具有活性组合物的酸奶后获得的空肠样品(60和180分钟)中，在几乎所有样品中找到针状晶体，而在具有乳脂肪的对照中，在少得多的案例中观察到晶体。这也概括于下表5中，显示在光学显微镜图像中观察到的每个处理(人)晶体量的评分。
对来自空肠(在60分钟时采取，冷冻干燥后)的少量样品进行X-射线衍射，以测定观察到的晶体的特征。观察到典型的衍射模式，其可以通过由棕榈酸(在2θ＝21.5和24°折射，在2θ＝7、10和12.5°下有更小的峰)和NaCl与KCl(主要在2θ＝28°时折射)制成的结晶材料来解释。更特定地，指定以下的折射：对NaCl而言2θ＝27.3、31.7、45.4、53.8、56.4°，对KCl而言2θ＝28.2、40.4、50.1°。然而，通过光学显微镜观察的晶体不会是NaCl或KCl晶体，因为这些会溶于空肠的主要水相中。
还使用以下设定对一组干燥样品进行DSC(差示扫描量热Mettler Toledo DSC 821)：温度范围-15到200℃；速率：5℃/分钟；参照：Empty Al-40pan；样品：约10mg in Al-40pan。消耗活性组合物后得自空肠的样品显示58℃的熔融温度(峰值)，来自用参照(乳脂肪)组合物处理的干燥空肠样品显示52℃左右的熔融温度。
活性组合物样品58℃的熔融温度接近纯棕榈酸63℃的数值，而棕榈酸钠在270℃下熔融。
具有晶体特征的对象也用Raman显微术分析。使用Jobin Yvon LabRAM HR800系统(600沟/mm光栅和λ＝514.5nm激光)对冷冻干燥的材料进行Raman显微术。与100μm共聚焦针孔组合使用Olympus LM PlanFL物镜(100x)。
将从通过光学显微术鉴定了结晶对象的位点获得的Raman光谱与记录的棕榈酸、棕榈酸钠和棕榈酸钙的参照光谱比较。结晶对象的信号归因于棕榈酸。
总而言之可以得出结论：使用活性组合物的活性处理在胃肠道中产生许多晶体，而参照产品仅产生相对较少的晶体。
结合相对高水平的(游离)棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)和物理特征得出结论：晶体由棕榈酸和硬脂酸组成。
实施例2
在以下测试中，使用TNO，Zeist，荷兰开发的模型肠装置(一般被称作TNO Intestinal Model，TIM)对具有高C16:0的甘油三酯与乳化剂组合的酸奶进行体外处理。该体外胃肠模型模型胃、小肠和大肠中连续的动态过程。所述模型是研究胃肠道中养分、化学品、生物活性化合物和药物的稳定性、释放、溶解、吸收和生物转化的独特工具。其还由例如Minekus讨论(Minekus，M.(1998)and Minekus，M.；Marteau，P；Havenaar，R.；Huis in’t Veld，J.H.J.，ATLA Antern.Lab.Anim.1995，23，197-209)。
TIM模拟胃-小肠道中连续的动态条件，例如胃和小肠中的体温、pH曲线、电解质浓度和酶活性，肠不同部分中的胆汁盐浓度，和食糜经过胃和小肠的动力学，和低分子量分子与水的吸收。材料(食物)经过一系列 模拟传输效应的模块，连续通过胃、十二指肠、空肠和回肠。在两个位点处，中空纤维半透膜模拟被消化的材料经过肠壁。在特定的位点处添加胃肠液：在胃区室中添加胃液(脂肪酶和胃蛋白酶)，在十二指肠区室中添加碳酸氢钠溶液和胰酶和胆汁。
制造两种酸奶产品；制造酸奶的程序与实施例1中所述相同。如实施例1中所述包含5.88wt％的42wt％含脂质乳液(FabulessTM)的酸奶(A)对应于2.5wt％的总脂质。酸奶B是两种酸奶的混合物：具有精细分散的燕麦油的酸奶，和具有精细分散的棕榈油的酸奶。以下述比例混合具有棕榈油的酸奶和具有燕麦油的酸奶，所述比例使得混合物的总组成与酸奶A相同。然而，酸奶A和酸奶B的微结构不同：在酸奶A中，棕榈油表面被燕麦油覆盖，而在酸奶B中，酸奶中的棕榈油不被来自燕麦油的极性脂质覆盖，而是棕榈油和燕麦油独立地被分散。测试产品经过胃和小肠期间采取小尺寸的样品(约1ml)。从胃区室的内腔(将酸奶插入胃中后60、120和180分钟)和从空肠和回肠区室(将酸奶插入胃中后60、120、180、240和300分钟)中采取样品。在显微镜下视觉分析内腔样品(相差或明视野400x)。分析内腔样品从而测定它们的甘油三酯—甘油二酯—甘油单酯和游离脂肪酸脂质组成。除了内腔样品以外，从位于空肠和回肠区室的半透膜收集滤液样品。用KOH/乙醇在70℃下提取1小时后，通过气象色谱分析测定滤液样品的脂肪酸组成。
根据光学显微术，得自空肠和回肠区室的样品令人惊讶地几乎均含有晶体，通常是大量晶体的聚集物。晶体均比它们来源的油微滴更大。对酸奶A以及酸奶B发现，开始时棕榈油和极性燕麦油是物理上分离的。
所有内腔样品(两种酸奶)的脂质主要由游离脂肪酸组成。在空肠样品中观察到一些甘油单酯和甘油三酯。回肠样品最富含游离脂肪酸，接着是一些甘油三酯(表中未展示)。滤液样品脂质组成的相对脂肪酸含量概括于表6中。给出了四种最相关的脂肪酸。这些滤液样品代表了在(人工)肠壁上被吸收的脂质。在第二列中给出了胃摄入，代表被摄入胃组件的样品中脂质的脂肪酸组成。在设备的十二指肠区室中还添加了小量胆汁，并且也含有大量以大致等量富含四种主要组分的脂质。表6显示与部 分来自样品和部分来自胆汁的起始组合物相比，滤液样品高度富含C18:1和C18:2。然而，这些样品基本上耗竭C16:0和C18:0，意味着饱和脂肪酸未被过滤出内腔。因此，内腔中剩余的材料(未被吸收的脂质)相对富含这些饱和脂肪酸。
表6.
因此可以得出结论：对两种酸奶而言，来自空肠和回肠的内腔样品均含有大量的晶体，并且富含C16:0棕榈酸和C18:0硬脂酸，均为游离脂肪酸形式。因此很可能观察到的晶体由这些饱和的游离脂肪酸建成。另外，该实验显示，胃肠脂解期间良好的乳化剂(例如包含半乳糖脂的乳化剂)的存在可促进这些结晶的形成，即使它们以物理上与甘油三酯分离的状态被摄入。
实施例3
与实施例2相似，在TNO肠模型(TIM)中输送期间追踪具有3.5％脂肪(脂质)的四种酸奶。胃小肠模型TIM在文献(40)中描述。
将模型中的消化过程监测5小时。在前3小时中，胃内容物逐渐通过幽门瓣递送到小肠。在实验结束时，约80％的小肠内容物逐渐通过回盲瓣 递送至大肠。
胃分泌物由来自猪胃粘膜的胃蛋白酶(EC 3.4.23.1；Sigma-Aldrich Canada)和脂肪酶(EC 3.1.1.3，from Rhizopus oryzae，Amano Pharmaceuticals，Japan)组成，均溶于胃电解质溶液(GES：3.1g/l NaCl；1.1g/l KCl；0.15g/l CaCl2；0.6g/l NaHCO3)中。实验开始时，将来自猪胰腺的胰蛋白酶溶液(EC 3.4.21.4；Sigma-Aldrich Canada)直接引入十二指肠。此外，将猪胆汁提取物(来自冷冻的新收集猪胆汁的解冻胆汁的离心上清液)、胰腺液(Pancrex V powder；Paines and Byrne，UK)和肠电解质溶液(5.0g/l NaCl；0.6g/l KCl；0.3g/l CaCl2 at pH 7.0)递送至十二指肠区室中。
然后在TIM输送过程中有四种含有3.5％脂质的酸奶(分别为分级分离的棕榈油、乳木果油、棕榈油和乳脂)。测试前，轻轻摇动酸奶容器以使内容物均匀。每个实验开始时，将270g量的酸奶引入TIM的胃区室中。以特定的间隔从胃肠道的不同区室(胃、空肠和回肠腔)中取样。还通过装有相差模式的明视野显微镜(Leica ATC2000双目显微镜)直接目测研究一系列新鲜腔样品。研究后，将显微镜样品保持在-20℃。
所有酸奶均一式二份测试。
测试了以下脂质(脂肪)：
a)分级分离的棕榈油，
b)乳脂，来自全脂乳，
c)乳木果硬脂，得自乳木果油的甘油三酯级分，
d)棕榈酸。
乳木果硬脂得自AarhusKarlshamn(AAK)。分级分离的棕榈油得自Lipid Technologies Provider(LTP)。棕榈酸(90％)得自Aldrich。用作乳化剂的分级分离的燕麦油得自Swedish Oat Fibre AB(SOF)的粗制燕麦油的提取物。
乳液制备(分级分离的棕榈油和乳木果硬脂)
如上述获得分级分离的棕榈油和分级分离的燕麦油。利用实施例1所述方法，由分级分离的棕榈油和分级分离的乳木果硬脂制备乳液，使用分 级分离的燕麦油作为乳化剂。应用以下设置：通过turrax将脂肪和乳化剂高剪力混合2分钟，然后以600巴匀浆4次。包含分级分离的棕榈油的乳液由荷兰DSM以FabulessTM销售。
制备棕榈酸分散液
通过将棕榈酸和分级分离燕麦油混合物(比例92.3％/7.7％)在水中高剪力混合(超turrax)来制备包含棕榈酸晶体的分散液。Turrax处理在80℃进行15分钟，边搅拌边使混合物缓慢冷却至室温。这样获得的分散液具有28wt％脂质含量。
酸奶生产
用非表多糖(EPS)培养物(Delvo-Yog CY222，得自DSM，the Netherlands)，从市售0％脱脂乳(商标Albert Heijn)开始进行酸奶发酵。在酸奶生产过程中不加入额外的脂肪。酸奶中未添加甜味剂或调味剂。所有酸奶的最终脂质含量为3.5％。该脂质含量通过以下获得：
-将脂质乳液引入脱脂乳中并由包含该乳液的乳(脂质a和c)生产酸奶；
-或从市售的均质全脂乳(脂质b)(3，5％脂肪，商标Albert Heijn)开始，不添加额外的脂肪或乳化剂；
-或通过轻柔混合将棕榈酸晶体分散液加入新制备的酸奶(脂质b)中。
所述酸奶是等热量的。使脂肪与蛋白质的比例尽可能相等。
通过脂肪酸FFA分析测定的乳液或分散液(分级分离的棕榈油和分级分离的燕麦油、乳木果硬脂脂质和分级分离的燕麦油、棕榈酸和分级分离的燕麦油、原样的乳脂)的脂质组成示于表7。
通过NIZO开发的方法测定脂质组合物的游离脂肪酸谱(FFA分析)。(de Jong C，Badings HT.Determination of free fatty acids in milk and cheese，J High Res Chrom 1990；13：94-8).
表7.脂质组成
*比例(C16:0+C18:0+C20:0)/(C10:0+C12:0+C14:0+C18:1+C18:2+C18:3)
从胃空肠(即空肠回肠)中抽取样品(在胃区室中引入酸奶后t＝60和180分钟时)并在抽取样品后直接通过光学显微镜观察回肠(即回肠腔)(在胃区室中引入酸奶后t＝120和240分钟时。获取至少4幅图像。通过人观察对空肠和回肠样品中观察到的晶体量进行定量估计，并按以下分类：
0：在至少75％的图像中没有晶体；
+：在一些或大多数图像中有少量晶体(最多10个)；
++：在大多数或全部图像中有许多晶体(多于10个)。
结果示于表8。
表8.光学显微镜观察结果(在胃区室中引入酸奶后的分钟数)
*刺团：针状晶体的聚集体
使用上文所述FFA法测定回肠中全部脂肪酸的游离脂肪酸水平以及空肠腔中C16:0和C18:0和更高级的饱和脂肪酸(FA)
表9.随时间变化的回肠腔中总FFA水平(在胃区室中引入酸奶后的小时数)(重复测量的平均值)(g FFA/kg干物质)
时间(小时)→酸奶 1 2 3 4 5 分级分离的棕榈油 125.2 236.4 308.0 326.3 317.5 乳脂 101.1 171.3 244.0 241.5 252.0 乳木果硬脂 84.3 234.4 320.5 340.4 353.5 棕榈酸 171.5 348.3 504.8 461.6 466.2
表10.随时间变化的回肠腔中饱和FFA(C16:0+C18:0+C20:0)基于总FFA的重量百分比(重复测量的平均值)
时间(小时)→酸奶 1 2 3 4 5 分级分离的棕榈油 58.4 66.0 73.7 79.5 83.7 乳脂 48.4 54.6 61.1 65.7 69.5 乳木果硬脂 57.9 73.5 80.9 86.7 90.3 棕榈酸 91.4 96.6 97.8 97.5 97.6
包含棕榈酸的酸奶在回肠腔中显示最高量的FFA，然后是乳木果油，然后是分级分离的棕榈油，然后是乳脂。观察了饱和脂肪酸相对丰度，对于棕榈酸而言最显著，然后是乳木果硬脂，然后是分级分离的棕榈油，然后是乳脂。所有差异均具有统计学显著性(P＜0.05)。
用拉曼光谱术(见实施例1)分析有结晶特征的物体。结晶物体的信号可归因于游离饱和脂肪酸和/或相应的盐(如游离饱和脂肪酸的盐，如棕榈酸钙和/或硬脂酸钙)。
通过FFA和拉曼分析，我们认为，晶体主要由饱和棕榈酸和饱和硬脂酸构成，可能为其相应的盐或包括其相应的盐。
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