技术领域
本发明涉及糖尿病研究技术领域，尤其涉及一种一型糖尿病动物模型的建立方法和用途。
背景技术
糖尿病是因为胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗造成高血糖的现象，是一种慢性代谢异常疾病。糖尿病中一型糖尿病又称胰岛素依赖型糖尿病，属于先天性基因异常，因胰脏β细胞遭受自体免疫破坏，导致胰岛素缺乏；二型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病。中国当前糖尿病患者长期处于全球前列。糖尿病亟待有效的治疗。对糖尿病的发病机理、进程的研究以及各种治疗手段和药物的开发是当前的医药行业和科研单位的重点，而可靠的实验动物模型显得尤为重要。
对于一型糖尿病的治疗由于缺乏有效而且稳定的非人灵长类动物模型而发展缓慢。因此，可靠的易操作的非人灵长类一型糖尿病动物模型的建立将极大促进一型糖尿病的治疗，包括新药的性价和胰岛细胞移植治疗技术的评价和新型一型糖尿病药物的筛选和评价。虽然诱导非人灵长类一型糖尿病模型的方法已有报道，包括胰腺切除术和链脲佐菌素的诱导。目前，这些一型糖尿病的建立方法都还有一些不足之处。比如，胰腺切除术需要专门的外科手术专家，手术期间麻醉和手术后的细心照顾，胰腺切除术后的动物因为胰腺缺陷，需要进行胰岛素治疗，而且消化系统也会受到严重损伤，手术后动物的长期维持非常困难。
另外，还可以用链脲佐菌素诱导一型糖尿病模型。链脲佐菌素是一种广谱的抗生素，能够特异性的破坏胰岛内负责产生胰岛素的β细胞。链脲佐菌素目前也被临床应用于胰腺转移性胰岛细胞癌的治疗。现在研究证明链脲佐菌素通过β细胞膜上的葡萄糖转运蛋白GLUT2吸收，导致DNA的烷基化，从而引起β细胞的死亡。考虑到链脲佐菌素的毒副作用，导致诱导形成完全的稳定的一型糖尿病动物模型并不引发强烈的并发症的最佳剂量很难确定。之前已有研究试图建立链脲佐菌素诱导的稳定的一型糖尿病的非人灵长类模型，但是结果重复性不是很高，链脲佐菌素的给予方法和剂量千差万别。报道称静脉给予30-50mg/kg的链脲佐菌素诱导一型糖尿病猴的成功率在43％-80％。Pitkin et al.研究发现致糖尿病剂量是50-60mg/kg。Thieriault et al.则发现150mg/kg链脲佐菌素能够导致年轻的食蟹猴形成一型糖尿病(6-8个月,1-2kg)，发病率最小而且不会导致死亡毒性。Thomas et al.发现140mg/kg链脲佐菌素能够导致年轻的雄性恒河猴(2-3岁,3.1-3.8kg)发展成为一型糖尿病而且不会致死，这些动物能够维持一型糖尿病状态大于一年，并且不存在逆转现象。另外，Shibata et al.检测了3种不同剂量的链脲佐菌素诱导恒河猴(2.5-7.5岁)一型糖尿病，发现125mg/kg的链脲佐菌能够安全稳定的诱导一型糖尿病，而100mg/kg的链脲佐菌素不足以诱导一型糖尿病，150mg/kg的链脲佐菌素导致猴子死亡。Koulmanda et al.发现55mg/kg的链脲佐菌素能够诱导食蟹猴(3-6岁,3.1-9kg)一型糖尿病而且对肝肾都没有大的毒副作用，更大剂量的链脲佐菌素将会导致肝肾毒性。相反的，Rood et al.报道60mg/kg的链脲佐菌素并不能导致食蟹猴完全形成一型糖尿病，1250mg/m2的链脲佐菌素才能完全导致食蟹猴形成一型糖尿病但是并发蛋白丢失性肾病，150mg/kg的临床级链脲佐菌素(Zanosar STZ)才能安全稳定的诱导食蟹猴一型糖尿病。Zou et al.使用3种不同浓度链脲佐菌素(60,68和100mg/kg)来诱导食蟹猴(2-3岁,2.7-4.1kg)一型糖尿病，认为68mg/kg和100mg/kg的链脲佐菌素能够安全有效的诱导成一型糖尿病。由于报道中的所用非人灵长类动物不同，链脲佐菌素配置方法和给予方法的差异，导致实验的重复性差且没有一个安全有效而且稳定的非人灵长类一型糖尿病的诱导模型。
发明内容
本发明提供一种一型糖尿病动物模型的建立方法和用途，在胰岛细胞移植治疗糖尿病的技术评价和新型一型糖尿病药物的筛选和评估中将有广泛的应用价值。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种一型糖尿病动物模型的建立方法，该方法包括通过已经设置于猴子体内的静脉置管一次性给予100mg/kg链脲佐菌素诱导建立一型糖尿病动物模型。
进一步地，上述猴子是食蟹猴。
进一步地，上述方法具体包括：首先给予食蟹猴0.12mg/kg盐酸托烷司琼以防止呕吐发生，然后通过已经设置于猴子体内的静脉置管一次性给予100mg/kg链脲佐菌素诱导一型糖尿病动物模型。
进一步地，上述方法还包括：通过给予胰岛素来维持上述一型糖尿病动物模型。
进一步地，上述胰岛素的给药标准是，对成型的一型糖尿病食蟹猴模型按照以下标准每天给予两次胰岛素：当血糖小于11.1mmol/L，不给予胰岛素；当血糖在11.1-16.6mmol/L，给予1-2U胰岛素；当血糖在16.6-22.2mmol/L，给予2-4U胰岛素；当血糖大于22.2mmol/L，给予4-6U胰岛素。
进一步地，上述方法还包括在给予上述盐酸托烷司琼之前，给予生理盐水。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种适量的链脲佐菌素在制备一型糖尿病动物模型中的用途，上述链脲佐菌素按照100mg/kg的量，通过已经设置于猴子体内的静脉置管一次性给予。
进一步地，上述猴子是食蟹猴。
进一步地，上述适量的链脲佐菌素与适量的盐酸托烷司琼联合使用，其中上述盐酸托烷司琼的给药量是0.12mg/kg，并且先给予0.12mg/kg盐酸托烷司琼，再给予上述链脲佐菌素。
根据本发明的第三方面，本发明提供第一方面的方法得到的一型糖尿病动物模型在胰岛细胞移植治疗糖尿病的技术评价和/或新型一型糖尿病药物的筛选和评估中的用途。
本发明通过已经设置于猴子体内的静脉置管一次性给予100mg/kg链脲佐菌素诱导的方法，建立了一型糖尿病食蟹猴模型。本发明的100mg/kg链脲佐菌素诱导的食蟹猴糖尿病模型表现为持续高血糖，建模后对动物模型进行有效的后期护理避免并发症的发生和动物死亡。在给予胰岛素后，动物没有发生其它脏器的损伤和病变，对模型的各项生理指标和器官形态进行了观察比较，除血糖、C-肽、胰岛素之外，其它生理生化指标正常。该方法能完全诱导形成一型糖尿病且不引发并发症的发生。本发明可用于胰岛细胞移植治疗技术的评价和新型一型糖尿病药物的筛选和评价。
附图说明
图1显示链脲佐菌素诱导前和诱导后的食蟹猴(M16001，M16004，M16005)糖耐量曲线。
图2显示链脲佐菌素处理后食蟹猴(M16001，M16004，M16005)血糖浓度的三相变化，葡萄糖注入如图所示，胰岛素治疗大约在链脲佐菌素处理后30-34小时(虚线)。
图3显示正常猴和糖尿病猴的胰脏、肝肾、肾脏组织的形态学比较(苏木素伊红染色)，比例尺：50μm。
图4显示正常猴和糖尿病猴的胰岛素(β细胞)和胰高血糖素(α细胞)的免疫组化分析。糖尿病猴胰岛中胰岛素(β细胞)表达消失，胰高血糖素(α细胞)表达增加，比例尺：50μm。
图5显示α细胞和β细胞在正常猴和糖尿病猴胰岛中的分布。(A)α细胞在正常猴胰岛中的分布(α细胞数目/104μm2)；(B)β细胞在正常猴胰岛中的分布(β细胞数目/104μm2).数据显示为mean±SEM.****n＝20.p<0.0001。
具体实施方式
下面通过具体实施例结合附图对本发明作进一步详细说明。应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
1.材料与方法
1.1实验材料
3只食蟹猴(M16001，M16004，M16005；3.7-3.85kg)，无结核分支杆菌、志贺菌、沙门氏菌、蠕虫、体外寄生虫，痢疾内变形虫和B疱疹病毒感染。购自广东蓝岛生物技术有限公司。实验所用食蟹猴单独饲养，环境温度控制在25℃，湿度维持在40-70％，一天灯光照射12小时(早7:30到晚7:30)，保持水的供应和喂食，每天补充2次水果。
1.2主要试剂
链脲佐菌素：购自sigma(sigma-S0130)；胰岛素；盐酸托烷司琼注射液：2mg配置到100ml生理盐水中；10％，50％葡萄糖溶液；Insulin(IRI)胰岛素检测试剂盒：购自西门子；C-peptide(CpS)C-肽检测试剂盒：购自西门子；DAB染色液(放大聚合物法)：购自迈新；胰岛素抗体：CST-3014S；胰高血糖素抗体：CST-2760。
1.3主要溶液配制
生理盐水。链脲佐菌素溶液：称取100mg链脲佐菌素，溶解于5ml生理盐水中，再加入15ml预冷的生理盐水，溶解后5分钟内通过通过已经设置于猴子体内的静脉置管静脉给药；按动物比重计算所需剂量，分批次溶解静脉给予直至所需剂量；该液要求随用随配，溶解后5分钟内使用完毕。胰岛素溶液：用生理盐水配制胰岛素(10U/100ml)。
1.4主要仪器
血气分析仪：雅培iSTAT-300血气分析仪，iSTATEC8+芯片；血糖检测仪：强生稳豪倍易型血糖仪，强生血糖试纸；胰岛素和C-肽检测在深圳市第二人民医院核医学科完成：西门子,ADVIAXP肝肾功能检测在深圳市第二人民医院检验科完成。
1.5实验方法
1.5.1食蟹猴静脉葡萄糖耐受实验
(1)动物禁食10-12小时，不禁水。
(2)检测食蟹猴的生化、血常规、血糖和空腹胰岛素和C-肽，标记为0分钟。
(3)立即给予50％葡萄糖0.5g/kg(30秒内完成)。
(4)计时第5、15、30、60、90分钟，分别检测血糖，胰岛素和C-肽。
1.5.2大剂量STZ诱导一型糖尿病模型
(1)iSTAT EC8+检测，并通过已经设置于猴子体内的静脉置管给予生理盐水(20ml/kg/ml)3小时。
(2)通过已经设置于猴子体内的静脉置管给予0.12mg/kg盐酸托烷司琼防止呕吐发生。
(3)通过已经设置于猴子体内的静脉置管一次性给予现配的链脲佐菌素(100mg/kg)，链脲佐菌素配置后5分钟内使用。
(4)监测动物是否有呕吐现象，持续给予10％葡萄糖(20ml/kg/hr)，每2小时检测一次葡萄糖浓度，每4小时用iSTAT EC8+检测分析血液酸碱度。
(5)通过血糖值调整葡萄糖和胰岛素的用量，保持血糖维持在8.3mmol/L，如果血糖值稍高也没有问题；
如果血糖<11.1mmol/L，给予10％葡萄糖10ml/hr；
如果血糖<8.3mmol/L，给予20％葡萄糖10ml/hr；
如果血糖<5.6mmol/L，给予1ml 50％；
发现酸中毒即给予胰岛素(0.025-0.035U/kg/hr)。
(6)当空腹血糖值>11.1mmol/L时，建模成功。
(7)糖尿病食蟹猴需要持续给予胰岛素。早九点到晚五点：0.045U/kg/hr；晚五点到早九点：0.025-0.035U/kg/hr。
1.5.3食蟹猴血清胰岛素测定
使用西门子Insulin(IRI)胰岛素检测试剂盒进行胰岛素检测；西门子C-peptide(CpS)C-肽检测试剂盒进行C-肽检测(西门子,ADVIAXP仪器，深圳市第二人民医院核医学科)。
1.5.4食蟹猴胰岛α和β细胞检测
(1)取材和包埋：取正常和糖尿病食蟹猴胰腺组织，浸泡在4％福尔马林溶液中固定8-24小时，脱水后石蜡包埋。
(2)切片：组织切片厚度为4μm黏附到多聚赖氨酸玻片上，60℃烤片两个小时。
(3)脱蜡和水化：石蜡切片置于新鲜的二甲苯中，浸泡15分钟×2次；无水乙醇中，浸泡3分钟×2次；95％乙醇中，浸泡3分钟；85％乙醇中，浸泡3分钟；自来水冲洗1分钟；PBS溶液冲洗3分钟×3次。
(4)抗原修复。
(5)阻断内源性过氧化物酶。将抗原修复后的切片用自来水冲洗1分钟，PBS溶液冲洗3分钟×3次；加100μl内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10分钟；PBS溶液冲洗3分钟×3次。
(6)封闭：用1％BSA封闭，室温孵育20～30分钟。
(7)一抗孵育：加100μl胰岛素抗体(1:100)或胰高血糖素抗体(1:100)，室温下孵育60分钟。PBS溶液冲洗3分钟×3次。
(8)加反应放大剂：加100μl反应放大剂，室温孵育10分钟，PBS溶液冲洗3分钟×3次。
(9)高敏型酶标二抗孵育：加100μl高敏型酶标抗兔二抗，室温孵育10分钟，PBS溶液冲洗3分钟×3次。
(10)显色：加100-200μl新鲜配制的DAB显色液，室温下孵育3-5分钟。
(11)复染：自来水冲洗，加100-200μl苏木素体细胞染色液孵育10-30秒，或自行配制的苏木素染色至细胞核浅蓝色；PBS溶液或自来水冲洗返蓝。
(12)脱水、透明、封片：85％乙醇中，浸泡3分钟；95％乙醇中，浸泡3分钟；无水乙醇中，浸泡3分钟；二甲苯透明；中性树胶和盖玻片封片。
(13)莱卡显微镜阅片拍照，计算胰岛素(β细胞)染色细胞个数和胰高血糖素(α细胞)染色个数和胰岛的面积。
1.5.5胰腺，肝和肾形态检测
(1)取材和包埋：取正常和糖尿病食蟹猴胰腺,肝和肾组织，浸泡在4％福尔马林溶液中固定8-24小时，脱水后石蜡包埋。
(2)切片：组织切片厚度为4μm黏附到多聚赖氨酸玻片上，56–60℃干燥箱烤片两个小时。
(3)脱蜡和水化：石蜡切片置于新鲜的二甲苯中，浸泡15分钟×2次；无水乙醇中，浸泡3分钟×2次；95％乙醇中，浸泡3分钟；85％乙醇中，浸泡3分钟；自来水冲洗1分钟；PBS溶液冲洗3分钟×3次。
(4)滴加苏木精染色，室温下5～10分钟。
(5)自来水分色(流水冲洗，浸泡3分钟～1小时)。
(6)伊红染色(伊红A室温5分钟，伊红B浸入立[10～20秒]取出)，水冲洗，95％乙醇分色适当时间(约数秒)。
(7)100％乙醇脱水3～5分钟，转入单独的二甲苯缸中2～3分钟，中性树胶封片。
(8)莱卡显微镜阅片拍照，观察比较正常猴和糖尿病猴胰脏，肝和肾的形态结构。
2.实验结果
通过已经设置于食蟹猴体内的静脉置管一次性给予100mg/kg链脲佐菌素诱导的方法能够成功诱导一型糖尿病食蟹猴模型。糖尿病猴出现糖代谢紊乱，胰岛素和C－肽分泌功能不足。
成功的建模标准包括(1)糖尿病猴胰腺不能正常分泌胰岛素和C-肽；(2)葡萄糖刺激后的C-肽水平低于0.5ng/ml；(3)链脲佐菌素诱导后发生血糖浓度的三相变化(升高-降低-升高)；(4)胰腺组织免疫组化染色，胰岛素染色阴性表示β细胞被破坏。本实验建模模型M16001，M16004，M16005均符合上述建模标准并没有明显的副反应和并发症的发生。
表1链脲佐菌素诱导前和诱导后食蟹猴(M16001，M16004，M16005)
血糖、胰岛素和C-肽水平
表2链脲佐菌素诱导前和诱导后食蟹猴(M16001，M16004，M16005)
肝肾功能检测
表3链脲佐菌素诱导前、诱导后一个星期、诱导后两个星期食蟹猴(M16001，M16004，M16005)体重变化
表1显示链脲佐菌素诱导后相比诱导前食蟹猴血糖水平明显升高，胰岛素和C-肽水平降低，显示胰岛β细胞分泌胰岛素功能不足。
图1的食蟹猴静脉葡萄糖耐受实验看出，100mg/kg的链脲佐菌素诱导后，葡萄糖代谢紊乱，血糖水平升高，葡萄糖刺激不能促进C-肽的分泌。
图2显示链脲佐菌素诱导后开始出现血糖浓度的增加，8hr左右达到峰值，主要是链脲佐菌素通过GLUT2进入β细胞，导致β细胞不能正确响应血糖浓度的变化，导致胰岛素分泌受阻；在诱导后约16hr左右出现血糖迅速降低，是由于链脲佐菌素进入β细胞后导致了DNA的烷基化损伤，从而致使β细胞被破坏释放大量的胰岛素，血糖水平迅速下降；最后在诱导后约32hr，由于β细胞被破坏，胰岛素分泌功能受损，出现血糖升高并且无法恢复到正常血糖水平。
图3免疫组织化学染色显示胰岛素(β细胞)在链脲佐菌素诱导之后几乎消失，而胰高血糖素染色(α细胞)正常。通过统计分析，发现α细胞在糖尿病猴的胰岛中所占比例相比正常食蟹猴显著增加，而β细胞在糖尿病食蟹猴胰岛中几乎消失不见(如图5所示)。
通过已经设置于食蟹猴体内的静脉置管一次性给予100mg/kg链脲佐菌素诱导的方法造的糖尿病模型没有引起严重的并发症和副反应。
通过已经设置于食蟹猴体内的静脉置管一次性给予100mg/kg链脲佐菌素诱导的方法造模前后，分别对食蟹猴的肝肾功能进行了检测，发现肝肾功能没有明显的损伤(如表2所示)，组织切片苏木素/伊红染色显示组织结构完整，没有组织病变和损伤(如图3所示)。对诱导后的一周和两周进行体重检测，发现诱导的糖尿病猴体重没有大的变化，进食和活动状态良好。
实验结果表明通过已经设置于食蟹猴体内的静脉置管一次性给予100mg/kg链脲佐菌素诱导一型糖尿病的方法，造成β细胞损伤，食蟹猴发生胰岛素和C-肽分泌功能不足，糖耐量受损，出现一型糖尿病的临床表现，成功建立了一型糖尿病食蟹猴模型。
本发明造模方法，能够形成稳定的和规范的一型糖尿病模型，可用于胰岛移植的临床前研究和一型糖尿病药物的筛选，相对于啮齿类动物模型，非人灵长类的一型糖尿病模型更加接近临床，对于评估胰岛细胞移植的疗效和新型一型糖尿病药物的筛选和评估的研究中有更大的应用价值。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。