技术领域
本发明属于植物组培技术领域，涉及一种香蕉组织培养过程中试管苗的提纯复壮方法。
背景技术
香蕉采用植物组织培养的方法进行工厂化生产是当今香蕉最重要的繁殖途径，因为传统的香蕉繁殖方法已经不能满足香蕉大规模生产的需要，香蕉工厂化育苗已经成为香蕉种植中的重要种苗来源，但是香蕉的组培苗存在一个退化问题，尤其是在连续继代10代左右就会普遍产生退化现象，10代以后生产的组培苗植株矮小、产量低，因此香蕉组培苗的品种退化问题一直是香蕉快速繁殖中的瓶颈问题
因此，目前存在的问题是研究开发一种能够解决香蕉组培苗多次继代后的品种退化问题的香蕉组培方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种香蕉组织培养过程中试管苗的提纯复壮方法，包括将香蕉原试管苗茎尖生长点经过三段培养脱毒复壮处理获得复壮香蕉植株。将复壮植株移栽到土壤中可以重新恢复香蕉原有的优良性状，避免了退化。该方法获得的香蕉试管苗高度整齐一致，分化率高，且生长健壮，产量高；可以解决香蕉试管苗在大规模工厂化生产中的试管苗质量问题，满足日益增长的试管苗需求。
为此，本发明提供了一种香蕉组织培养过程中试管苗的提纯复壮方法，包括将香蕉原试管苗茎尖生长点经过三段培养脱毒复壮处理获得复壮香蕉植株。
根据本发明，所述三段培养脱毒复壮处理包括：
第一阶段，培养脱毒处理：将香蕉原试管苗茎尖生长点放置在第一阶段培养基上进行培养，获得香蕉苗芽点；
第二阶段，培养复壮处理：将香蕉苗芽点移至第二阶段培养基上进行培养，获得复壮香蕉试管苗；
第三阶段，培养复壮处理：将复壮香蕉试管苗转移至第三阶段培养基中进行培养，植株生根后获得复壮香蕉植株；
所述香蕉原试管苗茎尖生长点是位于香蕉原试管苗顶部的圆锥形生长点，所述圆锥形生长点的尖部向上。
本发明中，优选所述圆锥形生长点的底面积为2-3mm2。
在本发明的一个或多个实施方式中，第一阶段培养基由MS基本培养基加以第一阶段培养基体积计的以下成分构成：
6-苄基嘌呤(6BA) 1-3mg/L；
维生素C(Vc) 1-2mg/L；以及
α-萘乙酸(NAA) 0.1-0.5mg/L。
在本发明的一个或多个实施方式中，第二阶段培养基由MS基本培养基加以第二阶段培养基体积计的以下成分构成：
6-苄基嘌呤(6BA) 1-3mg/L；
维生素C(Vc) 0.01-0.1mg/L；以及
α-萘乙酸(NAA) 0.1-0.3mg/L。
在本发明的一个或多个实施方式中，第三阶段培养基由1/2MS基本培养基加以第三阶段培养基体积计的以下成分构成：
吲哚丁酸(IBA) 0.1-0.3mg/L；以及
α-萘乙酸(NAA) 0.1-0.6mg/L。
本发明中，优选在第一阶段培养脱毒处理中，一个光照周期为24小时，其中12小时光照/12小时无光照，光照强度为2500-3000Lux。
本发明中，优选在第二阶段培养复壮处理中，复壮香蕉试管苗长度为2-3cm。
本发明中，优选在第三阶段培养复壮处理中，复壮香蕉植株含有2-3条根。
本发明中，所述香蕉原试管苗为继代8-10次以上的香蕉试管苗。
在本发明的一些优选实施方式中，所述方法还包括在在第一阶段培养脱毒处理之前获取香蕉原试管苗茎尖生长点的步骤，包括将原试管苗取出，剥去茎尖的叶片，露出位于顶部的圆锥形生长点，从基部将所述圆锥形生长点剪下，即获得香蕉原试管苗茎尖生长点。
在本发明的另一些优选实施方式中，所述方法还包括在在第三阶段培养复壮处理之后，将复壮香蕉植株移栽到土壤中的步骤。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
本发明的发明人研究发现，试管苗的生长点病毒很少，如果只取生长点进行接种培养，再分化出的小苗就不会感染病毒了，这样组培获得的苗高度整齐一致，分化率高。本发明正是基于上述发现作出的，具体方法是，通过将组培苗剥取茎尖进行茎尖培养脱毒处理来对香蕉组织培养过程中试管苗进行提纯复壮，从而获得复壮香蕉植株。
因此，本发明所涉及的一种香蕉组织培养过程中试管苗的提纯复壮方法，包括将香蕉原试管苗茎尖生长点经过三段培养脱毒复壮处理获得复壮香蕉植株。
具体而言，本发明中，所述三段培养脱毒处理包括：
第一阶段培养脱毒处理，将香蕉原试管苗茎尖生长点放置在第一阶段培养基上进行培养，获得香蕉苗芽点，所述香蕉原试管苗茎尖生长点是位于香蕉原试管苗顶部的圆锥形生长点，所述圆锥形生长点的尖部向上；
第二阶段培养复壮处理，将香蕉苗芽点移至第二阶段培养基上进行培养，获得复壮香蕉试管苗；
第三阶段培养复壮处理，将复壮香蕉试管苗转移至第三阶段培养基中进行培养，植株生根后获得复壮香蕉植株(亦称为移栽香蕉苗)。
在一些具体的实施方式中，本发明方法包括以下步骤：
(1)获取香蕉原试管苗茎尖生长点：包括将原试管苗取出，剥去茎尖的叶片，露出位于顶部的圆锥形生长点，所述圆锥形生长点的底面积为2-3mm2，从基部将所述圆锥形生长点剪下，即获得香蕉原试管苗茎尖生长点；
(2)第一阶段培养脱毒处理：将香蕉原试管苗茎尖生长点放置在第一阶段培养基上进行培养，获得香蕉苗芽点；
(3)第二阶段培养复壮处理：将香蕉苗芽点移至第二阶段培养基上进行培养，获得复壮香蕉试管苗；
(4)第三阶段培养复壮处理：将复壮香蕉试管苗转移至第三阶段培养基中进行培养，植株生根后获得复壮香蕉植株；
(5)将复壮香蕉植株移栽到土壤中。
上述步骤(2)-(4)为本发明中对香蕉原试管苗茎尖生长点进行培养脱毒复壮处理以获得复壮香蕉植株的三个阶段。
本发明中各阶段培养基是实现本发明的重要基础。
在本发明的一些具体实施方式中，第一阶段培养基由MS基本培养基加以第一阶段培养基体积计的以下成分构成：
6BA 1-3mg/L；
Vc 1-2mg/L；以及
NAA 0.1-0.5mg/L。
在本发明的另一些具体实施方式中，第二阶段培养基由MS基本培养基加以第二阶段培养基体积计的以下成分构成：
6BA 1-3mg/L；
Vc 0.01-0.1mg/L；以及
NAA 0.1-0.3mg/L。
在本发明的有一些具体实施方式中，第三阶段培养基由1/2MS基本培养基加以第三阶段培养基体积计的以下成分构成：
IBA 0.1-0.3mg/L；以及
NAA 0.1-0.6mg/L。
本发明的发明人经过大量试验研究发现，采用上述三个阶段的培养基有助于更好的实现本发明。
本发明中，优选在第一阶段培养脱毒处理中，光照为人工光照(日光灯或LED灯)，一个光照周期为21小时，其中12小时光照/12小时无光照，光照强度为2500-3000Lux。
本发明中所述用语“移栽香蕉苗”是指将根据本发明方法获得的复壮香蕉植株移栽到土壤中长成的香蕉苗。
本发明中，优选在第二阶段培养复壮处理中，复壮香蕉试管苗的长度为2-3cm。
本发明的发明人研究发现，在第三阶段培养复壮处理中，将复壮香蕉试管苗转移至第三阶段培养基中进行培养，植株生根，并且当生出2-3条根时，所获得复壮香蕉植株移栽后存活率更高。
因此，本发明中，优选在第三阶段培养复壮处理中，所述复壮香蕉植株含有2-3条根。
本发明中，所述香蕉原试管苗为继代8-10次以上的香蕉试管苗。
本发明方法可以通过以下具体实施方式实现：
(1)获取香蕉原试管苗茎尖生长点：将继代8-10次以上的香蕉试管苗(具备了茎、叶即可)在超净工作台上用无菌操作方法将试管苗从培养基中取出，用消毒镊子轻轻剥去茎尖的叶片，直到露出顶部的生长锥(一个只有2-3mm2的圆锥形生长点)，将此生长点从基部剪下，获得香蕉原试管苗茎尖生长点。
(2)第一阶段培养脱毒处理：将香蕉原试管苗茎尖生长点放置在第一阶段培养基上进行培养，获得香蕉苗芽点；该阶段的培养基的配方是：MS+6BA1(3mg/L)+Vc1(2mg/L)+NAA(0.1-0.5mg/L)；培养室温度为20-26℃，一个光照周期为24小时，其中12小时光照/12小时无光照，光照强度为2500-3000Lux；生长锥在培养室培养25-30天后就会出现分化现象，生长锥顶部开始出现小芽点，获得香蕉苗芽点。
(3)第二阶段培养复壮处理：将香蕉苗芽点移至第二阶段培养脱毒处理培养基上进行培养，获得复壮香蕉试管苗。将分化的小芽点(即香蕉苗芽点)转至第二阶段培养脱毒处理培养基上，该培养基配方为：MS+6BA(1-3mg/L)+Vc(0.01-0.1mg/L)+NAA(0.1-0.3mg/L)；培养室温度为20-26℃，一个光照周期为24小时，其中12小时光照/12小时无光照，光照强度为2500-3000Lux；经过25-30天的培养后，小芽点逐渐长出一株株香蕉试管苗，当试管苗株高达到2-3cm时，即获得复壮香蕉试管苗。
(4)第三阶段培养复壮处理：在超净工作台上将复壮香蕉试管苗转移至生根培养基(即第三阶段培养脱毒处理培养基)中，该培养基配方为：1/2MS+IBA(0.1-0.3mg/L)+NAA(0.1-0.6mg/L)。培养室温度为20-26℃，一个光照周期为24小时，其中12小时光照/12小时无光照，光照强度为2500-3000Lux；经过20天左右的培养，香蕉植株就长出2-3条白色的根，获得复壮香蕉植株，就可以进行移栽了。
(5)将复壮香蕉植株移栽到土壤中。
这种方法生产的复壮香蕉植株种植到土壤中，就可以重新恢复香蕉原有的优良性状，避免了退化。这种方法获得的复壮香蕉植株种植到土壤中长成的移栽香蕉苗的高度一致，生长健壮，产量高。
实施例
实施例1：
(1)获取香蕉原试管苗茎尖生长点：将实验室中已经继代10次的香蕉试管苗(航蕉1号)在超静工作台上采用无菌操作的方法取出，用消毒镊子轻轻剥去茎尖的叶片，直到露出顶部的生长锥(一个只有2-3mm2的圆锥形生长点)，大约要至少拨去3-5片叶片，将此生长点从基部剪下，获得香蕉原试管苗茎尖生长点。该香蕉原试管苗茎尖生长点很细小，组织幼嫩，要小心操作。
(2)第一阶段培养脱毒处理：将香蕉原试管苗茎尖生长点放置在第一阶段培养基上进行培养，获得香蕉苗芽点；该阶段的培养基的配方为：MS+6BA(2.5mg/L)+Vc(2mg/L)+NAA(0.3mg/L)；培养温度为25℃，光照周期为12小时明/12小时无光照，光照强度为2500Lux；生长锥在培养室培养25-30天后就会出现分化现象，生长锥顶部开始出现小芽点，获得香蕉苗芽点。
(3)第二阶段培养复壮处理：将香蕉苗芽点移至第二阶段培养脱毒处理培养基上进行培养，获得复壮香蕉试管苗。再将分化的小芽点(即香蕉苗芽点)转至第二阶段培养脱毒处理培养基上，该培养基配方为：MS+6BA(3mg/L)+Vc(0.01mg/L)+NAA(0.1mg/L)；等分化出的小苗长至3厘米时，即获得复壮香蕉试管苗。
(4)第三阶段培养复壮处理：在超净工作台上将复壮香蕉试管苗齐根剪下转移至生根培养基(即第三阶段培养脱毒处理培养基)中；该培养基配方为：1/2MS+IBA(0.1mg/L)+NAA(0.6mg/L)；经过20天左右的培养，香蕉植株就长出2-3条白色的根，获得复壮香蕉植株，就可以进行移栽了。
(5)将经这种方法生产的复壮香蕉植株移栽到大田中，就可以重新恢复香蕉原有的优良性状，避免了退化。
这种方法获得的复壮香蕉植株移栽到大田中，在大田中长成的移栽香蕉苗的高度一致，生长健壮，产量高。
将采用本发明方法进行提纯复壮获得的复壮香蕉植株于2011年2月种植于大田，当年12月就结果了，而且产量高，结果早。一共种植了140棵复壮香蕉植株，共获得2万斤香蕉，平均单株产量140斤，相对于未采用本发明方法生产的植株产量提高1倍，且口感好。
未采用本发明方法生产的香蕉试管苗作为本发明的比对例于2011年2月种植于大田，第2年3月结果，而且产量低，果穗短，单果重小，单株产量70斤。
实施例2：
(1)获取香蕉原试管苗茎尖生长点：将实验室中已经继代10次的香蕉试管苗航蕉2号在超静工作台上采用无菌操作的方法取出，用消毒镊子轻轻剥去茎尖的叶片，直到露出顶部的生长锥(一个只有2-3mm2的圆锥形生长点)，大约要至少拨去3-5片叶片，将此生长点从基部剪下，获得香蕉原试管苗茎尖生长点。该香蕉原试管苗茎尖生长点很细小，组织幼嫩，要小心操作。
(2)第一阶段培养脱毒处理：将香蕉原试管苗茎尖生长点放置在第一阶段培养基上进行培养，获得香蕉苗芽点；该阶段的培养基为的配方：MS+6BA(1mg/L)+Vc(1mg/L)+NAA(0.03mg/L)；培养温度为25℃，光照周期为12小时光照/12小时无光照，光照强度为3000Lux；生长锥在培养室培养25-30天后就会出现分化现象，生长锥顶部开始出现小芽点，获得香蕉苗芽点。
(3)第二阶段培养复壮处理：将香蕉苗芽点移至第二阶段培养脱毒处理培养基上进行培养，获得复壮香蕉试管苗。再将分化的小芽点(即香蕉苗芽点)转至第二阶段培养脱毒处理培养基上，该培养基配方为：MS+6BA(1.5mg/L)+Vc(0.01mg/L)+NAA(0.1mg/L)；等分化出的小苗长至3厘米时，即获得复壮香蕉试管苗。
(4)第三阶段培养复壮处理：在超净工作台上将复壮香蕉试管苗齐根剪下转移至生根培养基(即第三阶段培养脱毒处理培养基)中，该培养基配方为：1/2MS+IBA(0.2mg/L)+NAA(0.2mg/L)；经过20天左右的培养，香蕉植株就长出2-3条白色的根，获得复壮香蕉植株，就可以进行移栽了。
(5)2010年2月经这种方法提纯复壮获得的复壮香蕉植株种植在深圳的一片坡地上，当年11月，这批移栽香蕉苗成功结果，果穗整齐一致，产量高，平均单株产量达110斤，相对于未采用本发明方法生产的植株产量提高60％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。