一种杀虫剂组合物及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711441093.1 (22)申请日 2017.12.27 (71)申请人 杭州更蓝生物科技有限公司 地址 310052 浙江省杭州市滨江区江陵路 567号2幢5楼FN41 (72)发明人 董秋月 (51)Int.Cl. A01N 43/08(2006.01) A01P 7/04(2006.01) (54)发明名称 一种杀虫剂组合物及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及杀虫剂领域， 具体的， 本发明涉 及一种杀虫剂组合物及其制备方法， 所述杀虫剂 组合物包括SEQ ID 。

2、NO:2、 4、 5所示的多核苷酸序 列； 或在严格条件下与限定的多核苷酸序列杂交 的多核苷酸序列； 或与限定的多核苷酸序列具有 80以上同一性的多核苷酸序列； 或限定的多核 苷酸序列的至少19个连续核苷酸的多核苷酸序 列， 其中缨翅目昆虫害虫摄取包含与所述多核苷 酸序列互补的至少一条链的双链RNA， 抑制所述 缨翅目昆虫害虫的生长。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图1页 CN 108029689 A 2018.05.15 CN 108029689 A 1.一种杀虫剂组合物， 其特征在于， 包括至少一种分离的多核苷酸序列， 所述多核苷酸 序列包括： (a)SEQ ID NO:2、 。

3、4、 5所示的多核苷酸序列； 或 (b)在严格条件下与(a)限定的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列； 或 (c)与(a)限定的多核苷酸序列具有80以上同一性的多核苷酸序列； 或 (d)(a)限定的多核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的多核苷酸序列， 其中缨翅目昆虫 害虫摄取包含与所述多核苷酸序列互补的至少一条链的双链RNA， 抑制所述缨翅目昆虫害 虫的生长； 或 (e)上述(a)、 (b)、 (c)或(d)限定的多核苷酸序列的互补序列。 2.根据权利要求1所述的杀虫剂组合物， 其特征在于， 所述多核苷酸序列还包括权利要 求1所述多核苷酸序列的互补序列， 所述多核苷酸序列还包括间隔序列， 优选地， 。

4、所述多核 苷酸序列为SEQ ID NO:8、 10或11， 所述多核苷酸序列在有效连接的调控序列调控下构成表 达盒， 所述多核苷酸序列为干扰核糖核酸序列。 3.根据权利要求1或2所述的杀虫剂组合物， 其特征在于， 所述干扰核糖核酸序列在被 缨翅目昆虫害虫摄入后起到下调所述缨翅目昆虫害虫中至少一种靶标序列表达的作用， 其 中所述干扰核糖核酸序列包含至少一个沉默元件， 其中所述沉默元件是包含退火的互补链 的一个双链RNA区域， 其中一条链包含与所述靶标序列内的一个靶标片段至少部分地互补 的一个核苷酸序列或由其组成， 所述靶标序列包含权利要求1所述多核苷酸序列。 4.根据权利要求3所述的杀虫剂组合物。

5、， 其特征在于， 所述杀虫剂组合物包含至少一种 权利要求1-3任一项所述多核苷酸序列和至少一种合适的载体、 赋形剂或稀释剂， 或包含一 种表达或能够表达所述干扰核糖核酸序列的宿主细胞， 优选地， 所述宿主细胞为微生物细 胞。 5.根据权利要求4所述杀虫剂组合物， 其特征在于， 所述组合物是杀虫喷雾剂。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108029689 A 2 一种杀虫剂组合物及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种杀虫剂组合物及其制备方法， 特别是涉及一种利用RNAi 技术下 调或阻碍西花蓟马体内靶标序列的表达来抑制西花蓟马虫害的方法。 背景技术 0002 针对农业生产中的。

6、病虫灾害， 科研人员已经成功开发出了一些方法和组合物。 其 中， 化学杀虫剂是预防和治理病虫害的有效手段之一， 但化学杀虫剂的使用是一把双刃剑， 获得良好效果的同时会伴有以下问题： 1)化学杀虫剂不具有靶标选择性， 应用化学杀虫剂 来控制有害昆虫时对于非靶标生物也会造成伤害， 其中不乏有益生物。 2)在施用化学杀虫 剂的土壤上， 通常会表现出相应时间的贫瘠状态。 3)化学杀虫剂持续留存于环境中， 降解速 度慢， 使得作物及环境中存在化学杀虫剂的残留， 它们会积累于食物链中， 人类作为食物链 的顶端首当其冲， 这些化学杀虫剂的积累导致多种疾病被诱导发生， 例如癌症。 因此人们强 烈需要对环境友善。

7、的杀虫剂用于控制或根除作物生产中的昆虫侵害。 0003 微生物杀虫剂， 特别是从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis， 简称Bt)， 可 以作为化学杀虫剂的替代品， 在农业生产中发挥了重要作用， 其对鳞翅目、 鞘翅目和半翅目 等昆虫具有一定的杀虫活性， 但是微生物杀虫剂对于施药环境的要求比较高， 如果种植环 境不适合这些微生物的生长， 则需重复施药， 某些情况下甚至重复施用也不能达到控制害 虫的目的， 大大增加了生产成本及抗虫难度。 0004 本领域中已报道了RNAi反义技术下调或阻碍靶标昆虫相关基因以杀害难于在很 多系统中使用， 这有三个主要原因。 首先， 转化细胞中。

8、表达的反义序列不稳定。 第二， 转化细 胞中表达的反义序列的不稳定性。 第三， 随着不稳定性和反义序列的运送遇到的困难对于 如下企图来说也制造困难， 所述企图是： 在编码该反义序列的重组细胞内部提供能有效调 节目标正义核苷酸序列表达水平的剂量。 0005 RNA干扰或RNAi是用以在细胞或整个生物体环境下以序列特异性方式下调基因表 达的一种方法， 其通过特异性靶向选择和高效mRNA遏制， 可以达到定向干涉靶基因表达的 目的。 虽然利用RNAi技术来进行害虫防治是本领域的已知的， 但是将这种技术用作控制昆 虫侵袭措施的关键因素是选择最适当的靶基因， 即功能缺失导致必需生物过程严重破坏 和/或生物。

9、体死亡的那些基因。 因此， 本发明将下调害虫中的特定靶基因作为一种手段来实 现控制昆虫侵袭， 特别是控制植物的昆虫侵袭。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种杀虫剂组合物及其制备方法， 即利用RNAi技术按下述方 式来下调靶标序列的表达： 削弱昆虫存活、 生长、 繁殖、 定殖特定环境和/或侵袭寄主的能 力， 以实现控制昆虫侵袭及由其造成的损害。 0007 为实现上述目的， 本发明提供一种杀虫剂组合物， 包括至少一种分离的多核苷酸 序列， 所述多核苷酸序列包括： 说 明 书 1/5 页 3 CN 108029689 A 3 0008 (a)SEQ ID NO:2、 4、 5所示的多核苷酸序。

10、列； 或 0009 (b)在严格条件下与(a)限定的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列； 或 0010 (c)与(a)限定的多核苷酸序列具有80以上同一性的多核苷酸序列； 或 0011 (d)(a)限定的多核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的多核苷酸序列， 其中缨翅目 昆虫害虫摄取包含与所述多核苷酸序列互补的至少一条链的双链 RNA， 抑制所述缨翅目昆 虫害虫的生长； 或 0012 (e)上述(a)、 (b)、 (c)或(d)限定的多核苷酸序列的互补序列。 0013 进一步地， 所述多核苷酸序列还包括上述多核苷酸序列的互补序列， 所述多核苷 酸序列还包括间隔序列， 优选地， 所述多核苷酸序列为SEQ。

11、 ID NO:8、 10或11， 所述多核苷 酸序列在有效连接的调控序列调控下构成表达盒， 所述多核苷酸序列为干扰核糖核酸序 列。 0014 进一步地， 所述干扰核糖核酸序列在被缨翅目昆虫害虫摄入后起到下调所述缨翅 目昆虫害虫中至少一种靶标序列表达的作用， 其中所述干扰核糖核酸序列包含至少一个沉 默元件， 其中所述沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域， 其中一条链包含与所 述靶标序列内的一个靶标片段至少部分地互补的一个核苷酸序列或由其组成， 所述靶标序 列包含上述多核苷酸序列。 0015 进一步地， 所述杀虫剂组合物包含上述任一项所述多核苷酸序列和至少一种合适 的载体、 赋形剂或稀释。

12、剂， 或包含一种表达或能够表达所述干扰核糖核酸序列的宿主细胞， 优选地， 所述宿主细胞为微生物细胞。 0016 进一步地， 所述组合物是杀虫喷雾剂。 0017 本发明包含对缨翅目昆虫害虫中一种或多种靶标序列的表达加以调节或抑制的 方法， 所述方法包括： 将经稳定的双链RNA(如dsRNA)或其修饰形式(例如， 小干扰RNA序列) 的部分或全部引入到无脊椎有害昆虫体内细胞或细胞外环境中。 在昆虫体内， dsRNA或 siRNA进入到细胞中， 对至少一种或多种靶标序列的表达加以抑制， 并且这种抑制产生了减 弱昆虫存活、 生长、 繁殖以及侵袭寄主的能力。 0018 西花蓟马(Frankliniell。

13、a occidentalis)又称苜蓿蓟马， 属缨翅目 Thysanoptera， 蓟马科Thripidae。 该虫原产于北美洲， 1955年首先在夏威夷考艾岛发现， 曾 是美国加州最常见的一种蓟马。 自20世纪80年代后， 成为强势种类， 对不同环境和杀虫剂抗 性增强， 因此逐渐向外扩展。 西花蓟马食性杂， 目前已知寄主植物多达500余种， 主要有李、 桃、 苹果、 葡萄、 草莓、 茄、 辣椒、 生菜、 番茄、 豆、 兰花、 菊花等， 随着西花蓟马的不断扩散蔓 延， 其寄主种类一直在持续增加。 据称， 依据西花蓟马的习性分析， 在其分布区内， 几乎所有 观赏类花卉均有夹带西花蓟马的可能。 对。

14、于不同种类的寄主植物， 西花蓟马虽有喜好程度 的差别， 但均能生存且具有相当的繁殖能力。 0019 本发明 “RNA干扰(RNAi)” 是指一些RNA可以高效、 特异地阻断体内特定基因的表 达， 促使mRNA降解， 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型， 其也称为RNA干预或干涉。 RNA干 扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。 0020 本发明提供了一种杀虫剂组合物及其制备方法， 具有以下优点： 0021 1、 本发明首次公开了一种杀虫剂组合物， 其包含多个用于控制缨翅目昆虫害虫西 花蓟马的核酸抑制物， 可直接用于控制缨翅目害虫侵害植物。 说 明 书 2/5 页 4 CN 108029。

15、689 A 4 0022 2、 本发明用于控制缨翅目昆虫害虫西花蓟马的靶片段不影响宿主内的非靶标序 列的表达。 0023 3、 本发明提供了杀虫剂组合物包括多个核酸抑制物， 不定期的替换靶标序列或者 混用靶标序列可避免西花蓟马产生抗性。 0024 4、 本发明利用的RNAi技术可将获得的dsRNA直接应用于田间控制害虫侵袭， 操作 简便、 成本低、 环境兼容性好。 0025 下面通过附图和实施例， 对本发明的技术方案做进一步的详细描述。 附图说明 0026 图1为本发明用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法的重组表达载体 XHJM-01 载体示意图。 具体实施方式 0027 下面通过具体实施例进。

16、一步说明本发明一种杀虫剂组合物及其制备方法的技术 方案。 0028 实施例1、 靶标序列的确定 0029 步骤一、 提取西花蓟马总RNA： 用常规Trizol法提取西花蓟马幼虫的 RNA， 常规方 法纯化， DNA酶处理， 获得浓度280ng/ l、 总量10 g、 OD260/280为1.9-2.1的总RNA样品。 0030 步骤二、 分离mRNA及合成cDNA： 用带有oligo-dT的磁珠分离出带有 polyA的mRNA， 然后用随机六聚物和Invitrogen试剂盒合成cDNA第一链。 0031 步骤三、 筛选出靶标序列， 通过与NCBI比对， 经研究分析从各个代谢途径中筛选出 6个西。

17、花蓟马的靶标序列， 对应的GENBANK登录号为： GT301184， GenBank:GT308845.1具体 信息如下所示： 0032 靶标序列1： GTTACGCTAACGGTCAAATG(SEQ ID NO:1) 0033 靶标序列2： AATGCCTCCTGATTTTGCCAAT(SEQ ID NO:2) 0034 靶标序列3： CACTTGAATCTGTCTGCTACT(SEQ ID NO:3) 0035 靶标序列4： GTGCTTTGTTGTACAATAACG(SEQ ID NO:4) 0036 靶标序列5： TGCTGACTGCCATTAAAGCCG(SEQ ID NO:5) 。

18、0037 靶标序列6： CTCTCTCGGGTGCATTTTACCT(SEQ ID NO:6)。 0038 实施例2、 植物表达载体的构建 0039 按照番茄Ubi启动子-靶标序列正义链-间隔序列-靶标序列反义链联接在一起， 并 和标记基因Hpt形成表达载体。 正义引物两端分别带有EcoR I和Hind 酶切位点， 反义引 物两端分别带有Xho I和Sac I酶切位点， 间隔序列引物两端分别带有Hind和Sac I酶切 位点。 将含有正义链的重组克隆载体双酶切， 并回收正义链片段。 将重组表达载体XHJM做同 样的双酶切回收线性化的质粒， 与目的片段连接， 得到重组表达载体XHJM-X1。 将。

19、重组表达 载体 XHJM-X1双酶切， 并回收线性化质粒。 将含有反义链的重组克隆载体双酶切， 并回收反 义链片段。 将双酶切后的重组表达载体XHJM-X1与反义链片段进行连接， 得到重组表达载体 XHJM-Y1。 将重组表达载体XHJM-Y1和带有间隔序列的puc-Spacer分别用Hind和Sac I双 酶切， 回收间隔序列和线性化的 XHJM-Y1， 并将两者连接， 构建成含有番茄Ubi启动子-靶标 说 明 书 3/5 页 5 CN 108029689 A 5 序列正义链-间隔序列-靶标序列反义链的重组表达载体XHJM-01。 利用常规的酶切方法构 建载体是本领域技术人员所熟知的， 重组。

20、表达载体XHJM-01的载体示意图如图 1所示(Kan： 卡那霉素基因； RB： 右边界； prCaMV35S： Ubi启动子； X1 (SEQ ID NO:7)： 靶标序列1的核苷酸 序列(SEQ ID NO:1)+间隔序列+靶标序列1的反向互补核苷酸序列； tNos： 胭脂碱合成酶基 因的终止子； Hpt： 潮霉素磷酸转移酶基因； LB： 左边界)， 测序鉴定重组表达载体构建正确。 0040 按照上述方法构建重组表达载体XHJM-02、 XHJM-03、 XHJM-04、 XHJM-05、 XHJM-06， 确定重组表达载体XHJM-02、 XHJM-03、 XHJM-04、 XHJM-0。

21、5、 XHJM-06分别正确连接有靶标序 列2(SEQ ID NO:2)， 靶标序列 3(SEQ ID NO:3)， 靶标序列4(SEQ ID NO:4)， 靶标序列5(SEQ ID NO:5)， 靶标序列6(SEQ ID NO:6)的发卡形式， 发卡形式的核苷酸序列分别为X2 (SEQ ID NO:8)、 X3(SEQ ID NO:9)、 X4(SEQ ID NO:10)、 X5(SEQ ID NO:11)、 X6(SEQ ID NO:12)。 0041 实施例3、 获得转基因番茄 0042 对己经构建正确的重组表达载体XHJM-01、 XHJM-02、 XHJM-03、 XHJM-04、 。

22、XHJM-05 和XHJM-06用液氮法转化到农杆菌EHA105(Invitrgen， Chicago， USA， CAT： 18313-015)中， 按照常规采用的农杆菌侵染法， 将无菌培养的番茄幼苗与第三实施例所述的农杆菌共培 养， 以将第二实施例中构建的重组表达载体XHJM-01、 XHJM-02、 XHJM-03、 XHJM-04、 XHJM-05 和 XHJM-06中的T-DNA(包括X1核苷酸序列、 X2核苷酸序列、 X3核苷酸序列、 X4核苷酸序列、 X5核苷酸序列、 X6核苷酸序列， 玉米Ubi启动子序列、 Hpt基因和Nos终止子序列)转入到番 茄染色体组中， 获得了转入X1。

23、核苷酸序列的番茄植株、 转入X2核苷酸序列的番茄植株和转 入X3核苷酸序列的番茄植株、 转入X4核苷酸序列的番茄植株、 转入X5核苷酸序列的番茄植 株和转入X6核苷酸序列的番茄植株； 同时以野生型番茄植株作为对照。 0043 对于农杆菌介导的番茄植株预培养， 具体方法如下： 番茄种子用无菌水浸泡洗涤 两遍， 用75的乙醇浸泡番茄种子5min， 弃去乙醇， 加无菌水洗涤两次， 弃去无菌水， 用15 的次氯酸钠消毒1min。 轻摇容器， 加大种子与溶液的接触， 弃去次氯酸钠， 用无菌水漂洗6-7 次后吸干多余水分， 将种子移入装有MS培养基的三角瓶中， 每瓶1020粒， 均匀摆放， 种子 之间留出。

24、适量空隙， 28避光培养出芽后光照培养7天至子叶张开角度120度， 用镊子夹住 幼苗胚轴部分， 使两片子叶重叠、 平铺于培养皿底部， 将子叶顶端切去， 然后在靠近叶柄部 位约1cm处切一刀， 切下方形子叶块； 胚轴截为小段放置在MS+50 g/ l AS培养基上， 预培养 3天。 将预培养3天的子叶和胚轴从培养皿中移出， 放入盛有农杆菌菌液的锥形瓶中， 轻轻摇 荡， 侵染13min， 控制侵染时间， 时间长外植体容易褐化， 时间短则侵染效率低。 取出后用液 体MS 冲洗后置无菌滤纸上吸干， 转入添加有80 g/ lAS MS的共培养基平皿， 避光共培养2 天。 将共培养结束的外植体转到筛选培养。

25、基上(MS+3mg/L 6BA+0.25mg/L IAA+20 g/ml潮霉 素+15 g/ml玉米素)， 加入玉米素促进外植体分化。 26-28， 16h光照培养， 分化绿色愈伤组 织。 每10天继代一次， 弃去愈伤生长不良者， 将幼苗移入新的培养基中。 待小苗长到2-3cm， 再转到生根培养基上(MS+0.25mg/L IAA+20 g/ml卡那霉素+150 g/ml头孢霉素)， 待幼苗长 出4-5条根， 并有大量侧根生出时进行炼苗， 待根系发达后移栽到灭菌的土中， 待苗长到四 片叶时， 取根和叶片进行鉴定。 0044 实施例4、 鉴定转基因番茄对西花蓟马的杀虫效果 0045 将转入X1核。

26、苷酸序列的番茄植株、 转入X2核苷酸序列的番茄植株、 转入X1核苷酸 序列的番茄植株、 转入X4核苷酸序列的番茄植株、 转入X5核苷酸序列的番茄植株和转入X6 说 明 书 4/5 页 6 CN 108029689 A 6 核苷酸序列的番茄植株对西花蓟马进行抗虫效果检测。 0046 选用经鉴定为阳性单拷贝的XHJM-01番茄转化事件(X1)5个， 阳性单拷贝的XHJM- 02番茄转化事件(X2)5个， 阳性单拷贝的XHJM-03番茄转化事件(X3)5个， 经鉴定为阳性单拷 贝的XHJM-04番茄转化事件(X4)5 个， 阳性单拷贝的XHJM-05番茄转化事件(X5)5个， 阳性单 拷贝的XHJM。

27、-06 番茄转化事件(X6)5个， 经taqman鉴定为阴性的番茄转化事件(NGM1)3 个， 每个转化事件选取3个株系， 每一株系选取3棵苗； 同时以野生型番茄植株作为对照(CK1)； 在温室中种植至出苗； 每棵苗上取面积约1X2cm的叶片， 平铺放入铺有保湿滤纸的培养皿 中， 使得植物部分尽量不会相互重叠便于后期观察死亡率； 每皿中放入20头孵化时间不超 过24小时的初孵西花蓟马， 并盖紧培养皿盖子， 将培养皿放入底下垫有保湿纱布的生测盒 中， 并将生测盒放入温度242， D/L为24/0， 湿度为70-80的生测箱中； 为防治损伤幼 虫， 接虫当天和接虫后第1天尽量保持培养皿不动； 从接。

28、虫第2天开始， 每天从培养皿外统计 存活的西花蓟马数量， 每个转化事件以3个株系为平均水平， 每个载体以5个转化事件为平 均存活数水平； 每3天将培养皿中存活的西花蓟马转移至装有新鲜叶片的培养皿中， 实验结 果如表1所示。 0047 表1、 番茄转化事件花丝饲喂西花蓟马的实验结果 0048 0049 0050 表1的实验结果表明： X1核苷酸序列、 X2核苷酸序列、 X3核苷酸序列、 X4核苷酸序 列、 X5核苷酸序列、 X6核苷酸序列的番茄植株对西花蓟马均具有较好的抑制效果， 幼虫死亡 率高达90左右。 说 明 书 5/5 页 7 CN 108029689 A 7 序列表 杭州更蓝生物科技有。

29、限公司 一种杀虫剂组合物及其制备方法 12 SIPOSequenceListing 1.0 2 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) gene 靶标序列1 2 gttacgctaa cggtcaaatg 20 2 22 DNA 人工序列(Artificial Sequence) gene 靶标序列2 2 aatgcctcct gattttgcca at 22 3 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) gene 靶标序列3 3 cacttgaatc tgtctgctac t 21 4 21 DNA 人工序列(Artificial Seque。

30、nce) gene 序 列 表 1/3 页 8 CN 108029689 A 8 靶标序列4 4 gtgctttgtt gtacaataac g 21 5 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) gene 靶标序列5 5 tgctgactgc cattaaagcc g 21 6 22 DNA 人工序列(Artificial Sequence) gene 靶标序列6 6 ctctctcggg tgcattttac ct 22 7 51 DNA 人工序列(Artificial Sequence) gene X1 7 gttacgctaa cggtcaaatg tttaat。

31、atta ccatttgacc gttagcgtaa c 51 8 55 DNA 人工序列(Artificial Sequence) gene X2 8 aatgcctcct gattttgcca attttaatat tacattggca aaatcaggag gcatt 55 序 列 表 2/3 页 9 CN 108029689 A 9 9 53 DNA 人工序列(Artificial Sequence) gene X3 9 cacttgaatc tgtctgctac ttttaatatt acagtagcag acagattcaa gtg 53 10 53 DNA 人工序列(Artifi。

32、cial Sequence) gene X4 10 gtgctttgtt gtacaataac gtttaatatt accgttattg tacaacaaag cac 53 11 53 DNA 人工序列(Artificial Sequence) gene X5 11 tgctgactgc cattaaagcc gtttaatatt accggcttta atggcagtca gca 53 12 55 DNA 人工序列(Artificial Sequence) gene X6 12 ctctctcggg tgcattttac cttttaatat tacaggtaaa atgcacccga gagag 55 序 列 表 3/3 页 10 CN 108029689 A 10 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 11 CN 108029689 A 11 。