技术领域
本发明涉及纳米材料的肿瘤诊断与治疗领域，尤其涉及一种pH敏感性的纳米微粒材料及其制备方法。
背景技术
目前，纳米技术越来越广泛的用于生物医学领域，尤其是人类的重大疾病的诊断和治疗。现有的纳米材料如贵金属纳米微粒、无机半导体量子点等在癌症的成像诊断和药物传递、光热治疗等方面具有很大的应用前景。
然而人体是一个相当复杂的系统，纳米材料要在人体内发挥其目标功能，必须克服生物体的重重障碍。一般表面未做特别修饰的纳米材料进入人体血液系统后，将不可避免的吸附血浆蛋白，进而被巨噬细胞识别吞噬，从而被人体网状内皮系统捕获，使得纳米材料最终不能到达特定的靶向部位实现其目标功能。
pH是生物系统中的一个重要指标，一般正常组织pH在7.4左右，而癌症组织pH一般偏微酸性在6.0-7.0之间，细胞内溶酶体pH则更偏酸性在4.0-6.0之间。因此，pH敏感材料在应用于靶向特征的pH值如肿瘤组织具有广阔的应用前景。由此可见，设计具有pH敏感特性而又能逃离人体免疫系统清除的纳米微粒材料对实现纳米材料癌症诊断和治疗具有重大意义。
而现有的赋予纳米材料有效逃离免疫系统清除的表面修饰方法主要采用是聚乙二醇高分子(PEG)，而且经FDA批准为可用于人体的微粒表面修饰材料。PEG修饰时，纳米颗粒的粒径会影响PEG链的柔韧性，较小的粒径往往对应较强的链活动性和柔韧性，因而不易被吞噬细胞识别，但其对纳米材料的修饰效果受其分子量、聚合物链构象等因素的影响。 更需注意的是聚乙二醇修饰的纳米微粒只具有表面惰性的特点，虽能一定程度逃离免疫系统的清除，但其到达靶向部位后而不能有效的被靶向细胞内吞。此外，聚乙二醇不具有pH敏感特性，也不能用来靶向生物体系中广谱的pH特性。
综上所述，有必要获得通过简单的表面修饰的方法构建具有pH敏感特性的纳米微粒材料的方法，尤其是设计具有肿瘤微酸性pH敏感的纳米微粒材料。
发明内容
针对现有技术中纳米材料在人体内易被血浆蛋白吸附，进而被巨噬细胞识别吞噬，且对肿瘤部位的微酸性环境不敏感，本发明提供一种分散性及稳定性较好的具有pH敏感性的纳米微粒材料。
一种具有pH敏感性的纳米微粒材料，由正电荷基团和负电荷基团共同包覆纳米微粒组成，所述的正电荷基团与负电荷基团的摩尔比为0.05～20。
纳米颗粒(NPs)在诸如核酸、蛋白质等生物大分子存在的条件下很不稳定，容易发生团聚，使其易于被巨噬细胞识别并吞噬，进而被迅速从血液循环中清除，这就使得纳米颗粒在运载药物、诊断试验及生物成像等大多数应用过程中受到了限制。
研究表明，将不同的识别分子修饰到NPs上，获得功能化纳米微粒，有助于拓宽NPs的应用范围，而在介质中保持单分散性和稳定性是NPs在实际应用中的关键。
一般地，纳米颗粒表面亲水性越好则其对血浆蛋白的阻抗能力越强，被巨噬细胞吞噬的可能性也就越小。本发明选用正、负电荷基团共同包覆在纳米微粒表面，通过共价键牢固地结合到NPs上，在NPs表面形成混合电荷两性离子界面，两性离子表面能通过静电作用强有力地结合水分子形成稳定的水合层。该水合层可以赋予纳米微粒很好的亲水性，使其在纳米微粒的水溶液中以及复杂的生理条件(如高盐浓度)下稳定分散。与此同时，该水合层能有效地阻抗血浆蛋白的非特异性吸附，使纳米微粒有效地 逃离巨噬细胞的吞噬作用。通过选择不同的正电荷基团和负电荷基团，可以获得不同的混合正负电荷组合，得到不同的表面修饰的纳米微粒，极大地丰富了纳米微粒的表面性质。
以金为代表的贵金属纳米微粒具有独特的光学性质，表面易于修饰以及良好的生物相容性，特别是其在生物分析和生物医药等领域的应用引起了人们广泛关注。以氧化铁为代表的金属氧化物纳米微粒具有优异的超顺磁性，在磁共振成像、磁热疗等生物医药等领域具有很大的应用前景。以二氧化硅纳米微粒为代表的非金属氧化物纳米微粒，由于其易于制备、成本低以及良好的生物相容性在药物传递领域备受关注。以硒化镉/硫化锌纳米微粒为代表的无机半导体纳米微粒由于其独特的荧光特性，在生物分析和生物成像领域具有广阔的应用前景。因此，本发明所述的纳米微粒选自贵金属纳米微粒、氧化物纳米微粒或无机半导体纳米微粒。
所述的贵金属纳米微粒选自金纳米微粒、银纳米微粒或铂纳米微粒。
所述的金属或非金属氧化物纳米微粒选自氧化铁、氧化锰、氧化钴、氧化钽、氧化钛或氧化硅。
所述的无机半导体纳米微粒选自碲化镉、硫化镉、硒化镉、硫化锌、硒化锌、硫化铅、硒化铅中的一种或几种组成的复合纳米微粒。
纳米颗粒一旦进入含有蛋白的介质中，颗粒大小会明显改变，因此颗粒应足够小，至少能避免人体内毛细血管床的滤过作用，颗粒的大小不仅与靶向性密切相关，同时也会影响其表面修饰的程度。因此，作为优选，所述的纳米微粒尺寸为1nm～1000nm之间。
由于肿瘤增生很快，它的脉管系统供给的营养及氧并不能充分满足它扩张细胞数量的需要，这就导致了各种肿瘤与周围组织代谢环境的区别。研究发现，在很多肿瘤中缺氧导致能量不足，从而产生乳酸及ATP水解产物，则酸性增加，大多数肿瘤的pH值(＜6.5)都低于周围正常组织(pH7.4)。为灵敏的感应肿瘤的微酸性环境，所述的正电荷基团及负电荷基团中至少有一个为弱电解性，即所述的正电荷基团为弱碱阳离子或所述的负电荷基团为弱酸阴离子，或者同时满足正电荷基团为弱碱阳离子、负电荷基团为弱酸阴离子，这样通过弱电解性基团的水解作用即可确定某一部位 的pH。
进一步优选，所述的正电荷基团的结构如式(1)～(4)中任一所示：
其中，m＝0～19，X为与纳米微粒键合的反应性基团；
所述的负电荷基团的结构如式(5)～(8)中任一所示：
其中，n＝0～19，X为与纳米微粒键合的反应性基团；
所述的反应性基团的结构如式(9)～(24)中任一所示：
选用上述几种具有双亲性质的正、负电荷基团修饰纳米颗粒，随着m及n值的不同，正、负电荷基团的链的柔韧性使纳米颗粒的空间结构发生不同的变化，正、负电荷基团的链长度会影响纳米颗粒的稳定及空间位阻，一定范围内链越长，正、负电荷基团在纳米微粒表面形成的单分子层越致 密，有利于提高纳米微粒的稳定性。同时，链越长则柔韧性越好，但并非链越长保护作用越强，长链会相互缠结反而阻碍其活动，因此优选，所述的m＝0～19，n＝0～19，且m和n可以相同也可以不同。
选用上述几种正、负电荷基团修饰纳米颗粒，通过共价键牢固地结合到NPs上，正负电荷共同包覆在纳米微粒表面，在NPs表面形成混合电荷两性离子界面，能通过静电作用强有力地结合水分子形成稳定的水合层。该水合层可以赋予纳米微粒很好的亲水性，使其在纳米微粒中水溶液中以及复杂的生理条件(如高盐浓度)下稳定分散。与此同时，该水合层能有效地阻抗血浆蛋白的非特异性吸附，使纳米微粒有效地逃离巨噬细胞的吞噬作用。通过选择不同的正电荷分子和负电荷分子，可以获得不同的混合正负电荷组合，得到不同的表面的纳米微粒，极大地丰富了纳米微粒的表面性质。
本发明还提供了所述的具有pH敏感性的纳米微粒材料的制备方法，通过商业直接购买未经修饰的纳米微粒或以所需纳米微粒材料的前体化合物为原料，在适当反应条件的作用下得到所需颗粒尺寸的纳米微粒，在纳米微粒表面同时修饰上所述的正电荷基团和负电荷基团，最终得到所述的纳米微粒材料。
具体包括如下步骤：
按比例将正电荷基团、负电荷基团加入纳米微粒溶液中，得混合溶液，将所述混合溶液搅拌20～30小时，离心分离提纯获得所述的具有pH敏感性的纳米微粒材料；所述混合溶液中纳米微粒的原子浓度为0.1-1mM，正电荷基团与负电荷基团的总浓度为0.1-10mM。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明选用正、负电荷基团共同包覆纳米微粒，获得具有pH敏感特性的纳米微粒材料，方法独特，简便易行，适用面广，可实施性强。
(2)本发明制备得到的纳米微粒材料在正常pH条件具有很好的胶体稳定性，能在生理盐溶液PBS和高盐浓度条件下稳定分散；能有效的阻抗血浆蛋白吸附，在血浆中具有很好的分散稳定性，进而能有效阻抗巨噬细胞内吞。
(3)本发明制备得到的纳米微粒材料具有很好的生物相容性。
(4)本发明制备得到的纳米微粒材料具有快速敏感的pH响应特性，从而可使得纳米微粒在pH6～7之间快速聚集，进而快速被细胞内吞；而在其他pH范围稳定分散，且该pH响应特性具有可逆性。
(5)本发明制备得到的纳米微粒材料能在小鼠体内具有与PEG2000修饰的纳米微粒相当的长效血液循环时间。
(6)本发明制备得到的纳米微粒材料能在小鼠体内具有比PEG2000修饰的纳米微粒更低的肝脏和脾脏的滞留量。
(7)本发明制备得到的纳米微粒材料能在肿瘤模型小鼠体内具有比PEG2000修饰的纳米微粒更高的肿瘤富集量。
(8)本发明制备得到的纳米微粒材料能在肿瘤模型小鼠体内具有比PEG2000修饰的纳米微粒显著更高的肿瘤细胞内吞量。
(9)本发明制备得到的金纳米微粒材料能在pH＝6-7发生快速聚集，使得金纳米微粒聚集体在近红外650nm-900nm之间具有显著增强的表面等离子体共振吸收。
(10)本发明制备得到的金纳米微粒材料能在可用于近红外热疗，通过近红外光的照射可以有效产生热疗杀死癌细胞。
附图说明
图1为实施例1中具有pH敏感性的金纳米微粒材料的结构示意图；
图2为实施例1中金纳米微粒材料在pH为6.5时的紫外-可见光谱图；
图3为实施例1中金纳米微粒材料在pH由6.5到7.4的紫外-可见光谱变化图；
图4为实施例1中金纳米微粒材料在pH为7.4和6.5时的透射电镜图谱；
图5为实施例1中金纳米微粒材料与巨噬细胞在pH7.4下的作用结果图；
图6为应用例1中金纳米微粒材料与肝癌细胞HepG2在pH6.5下的作用结果图；
图7为应用例1中金纳米微粒材料作用的癌细胞经近红外激光器照射后的结果图；
图8为应用例1中PEG2000修饰的金纳米微粒作用的癌细胞经近红外激光器照射后的结果图。
具体实施方式
实施例1
制备尺寸为16纳米的金纳米微粒：在50mL沸腾的三蒸水中加入氯金酸，使氯金酸浓度达到1mM，剧烈搅拌下，迅速5.8mL加入38.8mM的柠檬酸三钠水溶液，搅拌下煮沸10分钟，可获得尺寸16nm左右的金纳米微粒水溶液。
将结构如下式所示的含巯基结构的负电荷基团与含巯基结构的正电荷基团按照1:1的摩尔比的混合水溶液加入上述制备的金纳米微粒溶液中，得到混合溶液，使得混合溶液中金原子浓度达到0.5mM,含巯基结构的正、负电荷基团总浓度达到0.5mM，搅拌24小时，离心分离获得具有pH敏感性的金纳米微粒材料，其结构如图1所示。
如图2所示，当pH变为6.5时，光谱吸收峰发生红移，说明金纳米微粒聚集。图中结果表明数秒钟内光谱即发生明显红移，说明该正、负电荷基团修饰的金纳米微粒具有快速pH响应的能力。
且当pH由6.5变为7.4后紫外-可见光谱恢复初始形状，如图3所示，表明微粒重新分散。结果表明，本发明的金纳米微粒材料的pH响应具有很好的可逆性。
如图4所示，从图中(a)和(c)部分可看出，16nm金纳米微粒在pH7.4条件下的磷酸缓冲液(PB)和含10％胎牛血清(FBS)的细胞培养基(DMEM)中是单个分散的，而从(b)和(d)部分可看出，16nm金纳米微粒在pH6.5条件下则发生明显聚集。且该金纳米微粒材料在生理PBS，2M氯化钠(pH7.4)溶液，含10％胎牛血清的细胞培养基中，人 血去血小板血浆中24h内未见任何沉淀，金纳米微粒特征吸收峰未见明显变化，说明该纳米微粒在以上生理条件下具有优异的稳定性。
如图5所示，在pH7.4条件下培养巨噬细胞RAW264.7，分别与金浓度为0.05mM的该混合电荷修饰金纳米微粒培养12小时，用诱导耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，未见明显纳米微粒，结果表明该金纳米微粒材料的内吞量均很低，说明该正、负电荷基团修饰的金纳米微粒具有很好的阻抗巨噬细胞内吞的能力。
实施例2
制备尺寸为15纳米的银纳米微粒：在60mL的三蒸水中加入硝酸银，使硝酸银浓度达到0.25mM，再加入柠檬酸三钠使其浓度达到0.25mM，剧烈搅拌下，加入1.8mL10mM的硼氢化钠冰水溶液，搅拌1小时，可获得尺寸15nm左右的银纳米微粒水溶液。
将结构如下式所示的含巯基结构的负电荷基团与含巯基结构的正电荷基团按照1:0.8的摩尔比的混合水溶液加入上述制备的银纳米微粒溶液中，得到混合溶液，使得混合溶液中银原子浓度达到0.5mM,含巯基结构的正、负电荷基团总浓度达到0.5mM，搅拌24小时，离心分离获得具有pH敏感性的银纳米微粒材料。
当pH变为6.5时，银纳米微粒光谱吸收峰迅速发生红移，说明银纳米微粒聚集。表明该正、负电荷基团修饰的银纳米微粒具有快速pH响应的能力。
且当pH由6.5变为7.4后紫外-可见光谱恢复初始形状，表明微粒重新分散。结果表明，本发明的银纳米微粒材料的pH响应具有很好的可逆性。
该银纳米微粒分别在不同pH7.4条件下的磷酸缓冲液(PB)和含10％胎牛血清的细胞培养基(DMEM)中是单个分散的，而在pH6.5条件下 则发生明显聚集。且该银纳米微粒材料在生理PBS，2M氯化钠(pH7.4)溶液，含10％胎牛血清的细胞培养基中，人血去血小板血浆中24h内未见任何沉淀，银纳米微粒特征吸收峰未见明显变化，说明该纳米微粒在以上生理条件下具有优异的稳定性。
在pH7.4条件下培养巨噬细胞RAW264.7，分别与银浓度为0.05mM的该混合电荷修饰银纳米微粒培养12小时，用诱导耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，未见明显纳米微粒，结果表明该银纳米微粒材料的内吞量均很低，说明该正、负电荷基团修饰的银纳米微粒具有很好的阻抗巨噬细胞内吞的能力。
实施例3
制备尺寸为4纳米的铂纳米微粒：在60mL的三蒸水中加入氯铂酸，使氯铂酸浓度达到0.25mM，再加入柠檬酸三钠使其浓度达到0.25mM，剧烈搅拌下，加入1.5mL100mM的硼氢化钠冰水溶液，搅拌2小时，可获得尺寸4nm左右的铂纳米微粒水溶液。
将结构如下式所示的含巯基结构的负电荷基团与含巯基结构的正电荷基团按照1:1.2的摩尔比的混合水溶液加入上述制备的铂纳米微粒溶液中，得到混合溶液，使得混合溶液中铂原子浓度达到0.5mM,含巯基结构的正、负电荷基团总浓度达到0.5mM，搅拌24小时，离心分离获得具有pH敏感性的铂纳米微粒材料。
当pH变为6.5时，铂纳米微粒流体力学直径迅速增大，说明铂纳米微粒聚集。表明该正、负电荷基团修饰的铂纳米微粒具有快速pH响应的能力。
且当pH由6.5变为7.4后铂纳米微粒流体力学直径重新变小，表明微粒重新分散。结果表明，本发明的铂纳米微粒材料的pH响应具有很好的可逆性。
该铂纳米微粒分别在不同pH7.4条件下的磷酸缓冲液(PB)和含10％胎牛血清的细胞培养基(DMEM)中是单个分散的，而在pH6.5条件下则发生明显聚集。且该铂纳米微粒材料在生理PBS，2M氯化钠(pH7.4)溶液，含10％胎牛血清的细胞培养基中，人血去血小板血浆中24h内未见任何沉淀，说明该铂纳米微粒在以上生理条件下具有优异的稳定性。
在pH7.4条件下培养巨噬细胞RAW264.7，分别与铂浓度为0.05mM的该混合电荷修饰铂纳米微粒培养12小时，用诱导耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，未见明显纳米微粒，结果表明该铂纳米微粒材料的内吞量均很低，说明该正、负电荷基团修饰的铂纳米微粒具有很好的阻抗巨噬细胞内吞的能力。
实施例4
制备尺寸约为10纳米的四氧化三铁纳米微粒：在60mL的三蒸水中加入氯化铁和硫酸亚铁，两者摩尔比为2∶1，使铁浓度达到1mM，剧烈搅拌下，加入氨水使其浓度达到5mM，搅拌2小时，可获得尺寸10nm左右的四氧化三铁纳米微粒水溶液。
将结构如下式所示的含邻苯二酚结构的负电荷基团与含邻苯二酚结构的正电荷基团按照1:1的摩尔比的混合水溶液加入上述制备的四氧化三铁纳米微粒溶液中，得到混合溶液，使得混合溶液中铁原子浓度达到0.5mM,含邻苯二酚结构的正、负电荷基团总浓度达到0.5mM，搅拌24小时，离心分离获得具有pH敏感性的四氧化三铁纳米微粒材料。
当pH变为6.5时，四氧化三铁纳米微粒流体力学直径迅速增大，说明四氧化三铁纳米微粒聚集。表明该正、负电荷基团修饰的四氧化三铁纳米微粒具有快速pH响应的能力。
且当pH由6.5变为7.4后四氧化三铁纳米微粒流体力学直径重新变小，表明微粒重新分散。结果表明，本发明的四氧化三铁纳米微粒材料的pH响应具有很好的可逆性。
该四氧化三铁纳米微粒分别在不同pH7.4条件下的磷酸缓冲液(PB)和含10％胎牛血清的细胞培养基(DMEM)中是单个分散的，而在pH6.5条件下则发生明显聚集。且该四氧化三铁纳米微粒材料在生理PBS，2M氯化钠(pH7.4)溶液，含10％胎牛血清的细胞培养基中，人血去血小板血浆中24h内未见任何沉淀，说明该四氧化三铁纳米微粒在以上生理条件下具有优异的稳定性。
在pH7.4条件下培养巨噬细胞RAW264.7，分别与铁浓度为0.05mM的该混合电荷修饰四氧化三铁纳米微粒培养12小时，用诱导耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，未见明显纳米微粒，结果表明该四氧化三铁纳米微粒材料的内吞量均很低，说明该正、负电荷基团修饰的四氧化三铁纳米微粒具有很好的阻抗巨噬细胞内吞的能力。
实施例5
制备尺寸约为25纳米的二氧化硅纳米微粒：在6mL的三蒸水中加入9.1mg精氨酸，加入0.45mL环己烷，再加入0.55mL正硅酸乙酯，搅拌下60℃反应24小时，可获得尺寸为25nm左右的二氧化硅纳米微粒水溶液。
将结构如下式所示的含硅氧烷结构的负电荷基团与含硅氧烷结构的正电荷基团按照1:1的摩尔比的混合水溶液加入上述制备的二氧化硅纳米微粒溶液中，得到混合溶液，使得混合溶液中硅原子浓度达到1mM,含硅氧烷结构的正、负电荷基团总浓度达到1mM，搅拌24小时，离心分离获得具有pH敏感性的二氧化硅纳米微粒材料。
当pH变为6.5时，二氧化硅纳米微粒流体力学直径迅速增大，说明二氧化硅纳米微粒聚集。表明该正、负电荷基团修饰的二氧化硅纳米微粒具有快速pH响应的能力。
且当pH由6.5变为7.4后二氧化硅纳米微粒流体力学直径重新变小，表明微粒重新分散。结果表明，本发明的二氧化硅纳米微粒材料的pH响应具有很好的可逆性。
该二氧化硅纳米微粒分别在不同pH7.4条件下的磷酸缓冲液(PB)和含10％胎牛血清的细胞培养基(DMEM)中是单个分散的，而在pH6.5条件下则发生明显聚集。且该二氧化硅纳米微粒材料在生理PBS，2M氯化钠(pH7.4)溶液，含10％胎牛血清的细胞培养基中，人血去血小板血浆中24h内未见任何沉淀，说明该二氧化硅纳米微粒在以上生理条件下具有优异的稳定性。
在pH7.4条件下培养巨噬细胞RAW264.7，分别与硅浓度为0.05mM的该混合电荷修饰二氧化硅纳米微粒培养12小时，用诱导耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，未见明显纳米微粒，结果表明该二氧化硅纳米微粒材料的内吞量均很低，说明该正、负电荷基团修饰的二氧化硅纳米微粒具有很好的阻抗巨噬细胞内吞的能力。
实施例6
制备具有pH敏感性的无机半导体纳米微粒材料。以硒化镉/硫化锌(CdSe/ZnS)的核/壳复合的无机半导体纳米微粒为例，直接从Sigma或百灵威购买尺寸约为5nm的CdSe/ZnS纳米微粒。
将结构如下式所示的含巯基结构的负电荷基团与含巯基结构的正电荷基团按照1:1的摩尔比的混合水溶液加入上述购买获得的CdSe/ZnS纳米微粒的氯仿溶液中，得到混合溶液，使得混合溶液中锌原子浓度达到0.5mM,含巯基结构的正、负电荷基团总浓度达到5mM，搅拌24小时，离心分离获得具有pH敏感性的CdSe/ZnS纳米微粒材料。
当pH变为6.5时，CdSe/ZnS纳米微粒流体力学直径迅速增大，说明纳米微粒聚集。表明该正、负电荷基团修饰的CdSe/ZnS纳米微粒具有快速pH响应的能力。
且当pH由6.5变为7.4后CdSe/ZnS纳米微粒流体力学直径重新变小，表明微粒重新分散。结果表明，本发明的CdSe/ZnS纳米微粒材料的pH响应具有很好的可逆性。
该CdSe/ZnS纳米微粒分别在不同pH7.4条件下的磷酸缓冲液(PB)和含10％胎牛血清的细胞培养基(DMEM)中是单个分散的，而在pH6.5条件下则发生明显聚集。且该CdSe/ZnS纳米微粒材料在生理PBS，2M氯化钠(pH7.4)溶液，含10％胎牛血清的细胞培养基中，人血去血小板血浆中24h内未见任何沉淀，说明该CdSe/ZnS纳米微粒在以上生理条件下具有优异的稳定性。
在pH7.4条件下培养巨噬细胞RAW264.7，分别与镉浓度为0.05mM的该混合电荷修饰CdSe/ZnS纳米微粒培养12小时，用诱导耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，未见明显纳米微粒，结果表明该CdSe/ZnS纳米微粒材料的内吞量均很低，说明该正、负电荷基团修饰的CdSe/ZnS纳米微粒具有很好的阻抗巨噬细胞内吞的能力。
应用例1
在pH6.5条件下培养肝癌细胞HepG2，分别与金浓度为0.05mM的该混合电荷修饰金纳米微粒和PEG2000修饰的金纳米微粒培养12小时， 用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，如图6所示，图中可见大量金纳米微粒，说明该正、负电荷基团修饰的金纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能有效促进癌细胞对纳米微粒的内吞。
在pH6.5条件下培养肝癌细胞HepG2，分别与金浓度为0.05mM的该混合电荷修饰金纳米微粒和PEG2000修饰的金纳米微粒培养1小时，用波长为808nm，功率400mW的近红外激光器照射与纳米微粒作用的细胞1分钟，如图7所示，本发明金纳米微粒材料作用的癌细胞在激光作用下大量死亡，图中虚线内为死亡的癌细胞，而从图8可以看出，PEG2000修饰的金纳米微粒作用的癌细胞在相同激光作用下不受影响，仍然存活，说明该正、负电荷基团修饰的金纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能用于肿瘤的近红外热疗。
在雄性BALB/c裸鼠背部种植人口腔样表皮癌细胞KB细胞的模型肿瘤，待肿瘤长至约100mm-3时，分别尾静脉注射金含量为100ug该混合电荷修饰金纳米微粒和PEG2000修饰的金纳米微粒。24小时后，牺牲小鼠，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定各脏器和肿瘤组织的金含量。ICP-MS结果表明混合电荷基团修饰的金纳米微粒在网状内皮系统的主要脏器肝和脾中的滞留量明显低于PEG2000修饰的金纳米微粒，具有显著差异。说明该正、负电荷基团修饰的金纳米微粒能更有效逃离网状内皮系统对外界纳米微粒的清除。同时结果表明混合电荷修饰的金纳米微粒在肿瘤组织的富集量明显高于PEG2000修饰的金纳米微粒，说明该正、负电荷基团修饰的金纳米微粒能更有效靶向肿瘤组织。透射电镜结果表明该混合电荷修饰的金纳米微粒在肿瘤组织的细胞内吞量明显高于PEG2000修饰的金纳米微粒，说明该正、负电荷基团修饰的金纳米微粒在肿瘤组织的微酸性环境下更加有利于癌细胞内吞。
应用例2
在pH6.5条件下培养人口腔样表皮癌细胞KB细胞，分别与金浓度为0.05mM的该混合电荷修饰金纳米微粒和PEG2000修饰的金纳米微粒培 养12小时，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，结果表明混合电荷基团修饰的金纳米微粒的癌细胞内吞量明显高于PEG2000修饰的金纳米微粒，具有显著差异，说明该正、负电荷基团修饰的金纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能有效促进癌细胞对纳米微粒的内吞。
在pH6.5条件下培养人口腔样表皮癌细胞KB细胞，分别与金浓度为0.05mM的该混合电荷修饰金纳米微粒和PEG2000修饰的金纳米微粒培养1小时，用波长为808nm，功率400mW的近红外激光器照射与纳米微粒作用的细胞1分钟，如图7和8所示，本发明金纳米微粒材料作用的癌细胞在激光作用下大量死亡，而PEG2000修饰的金纳米微粒作用的癌细胞在相同激光作用下不受影响，说明该正、负电荷基团修饰的金纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能用于肿瘤的近红外热疗。
应用例3
在pH6.5条件下培养人宫颈癌细胞Hela细胞，分别与金浓度为0.05mM的该混合电荷修饰金纳米微粒和PEG2000修饰的金纳米微粒培养12小时，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，结果表明混合电荷基团修饰的金纳米微粒的癌细胞内吞量明显高于PEG2000修饰的金纳米微粒，具有显著差异，说明该正、负电荷基团修饰的金纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能有效促进癌细胞对纳米微粒的内吞。
在pH6.5条件下培养人宫颈癌细胞Hela细胞，分别与金浓度为0.05mM的该混合电荷修饰金纳米微粒和PEG2000修饰的金纳米微粒培养1小时，用波长为808nm，功率400mW的近红外激光器照射与纳米微粒作用的细胞1分钟，如图7和8所示，本发明金纳米微粒材料作用的癌细胞在激光作用下大量死亡，而PEG2000修饰的金纳米微粒作用的癌细胞在相同激光作用下不受影响，说明该正、负电荷基团修饰的金纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能用于肿瘤的近红外热疗。
应用例4
在pH6.5条件下培养肝癌细胞HepG2，分别与银浓度为0.05mM的该混合电荷修饰银纳米微粒和PEG2000修饰的银纳米微粒培养12小时，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，结果表明混合电荷基团修饰的银纳米微粒的癌细胞内吞量明显高于PEG2000修饰的银纳米微粒，具有显著差异，说明该正、负电荷基团修饰的银纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能有效促进癌细胞对纳米微粒的内吞。
在pH6.5条件下培养肝癌细胞HepG2，分别与银浓度为0.05mM的该混合电荷修饰银纳米微粒和PEG2000修饰的银纳米微粒培养1小时，表面拉曼共聚焦显微镜进行成像。结果表明本发明银纳米微粒材料作用的癌细胞由于表面和细胞内聚集大量银纳米微粒，大大增强了表面增强拉曼光谱的信号，而PEG2000修饰的银纳米微粒作用的癌细胞在相同条件下信号较弱。说明该正、负电荷基团修饰的银纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能用于肿瘤的表面增强拉曼光谱成像，可用于肿瘤的诊断分析。
在雄性BALB/c裸鼠背部种植人口腔样表皮癌细胞KB细胞的模型肿瘤，待肿瘤长至约100mm-3时，分别尾静脉注射银含量为100ug该混合电荷修饰银纳米微粒和PEG2000修饰的银纳米微粒。24小时后，牺牲小鼠，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定各脏器和肿瘤组织的银含量。ICP-MS结果表明混合电荷修饰的银纳米微粒在网状内皮系统的主要脏器肝和脾中的滞留量明显低于PEG2000修饰的银纳米微粒，具有显著差异。说明该正、负电荷基团修饰的银纳米微粒能更有效逃离网状内皮系统对外界纳米微粒的清除。同时结果表明混合电荷修饰的银纳米微粒在肿瘤组织的富集量明显高于PEG2000修饰的银纳米微粒，说明该正、负电荷基团修饰的银纳米微粒能更有效靶向肿瘤组织。透射电镜结果表明该混合电荷修饰的银纳米微粒在肿瘤组织的细胞内吞量明显高于PEG2000修饰的银纳米微粒，说明该正、负电荷基团修饰的 银纳米微粒在肿瘤组织的微酸性环境下更加有利于癌细胞内吞，具有很好的用于肿瘤拉曼光谱成像的应用前景。
应用例5
在pH6.5条件下培养肝癌细胞HepG2，分别与铂浓度为0.05mM的该混合电荷修饰铂纳米微粒和PEG2000修饰的铂纳米微粒培养12小时，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，结果表明混合电荷基团修饰的铂纳米微粒的癌细胞内吞量明显高于PEG2000修饰的铂纳米微粒，具有显著差异，说明该正、负电荷基团修饰的铂纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能有效促进癌细胞对纳米微粒的内吞。
在雄性BALB/c裸鼠背部种植人口腔样表皮癌细胞KB细胞的模型肿瘤，待肿瘤长至约100mm-3时，分别尾静脉注射银含量为100ug该混合电荷修饰铂纳米微粒和PEG2000修饰的铂纳米微粒。24小时后，牺牲小鼠，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定各脏器和肿瘤组织的铂含量。ICP-MS结果表明混合电荷修饰的铂纳米微粒在网状内皮系统的主要脏器肝和脾中的滞留量明显低于PEG2000修饰的银纳米微粒，具有显著差异。说明该正、负电荷基团修饰的铂纳米微粒能更有效逃离网状内皮系统对外界纳米微粒的清除。同时结果表明混合电荷修饰的铂纳米微粒在肿瘤组织的富集量明显高于PEG2000修饰的铂纳米微粒，说明该正、负电荷基团修饰的铂纳米微粒能更有效靶向肿瘤组织。透射电镜结果表明该混合电荷修饰的铂纳米微粒在肿瘤组织的细胞内吞量明显高于PEG2000修饰的铂纳米微粒，说明该正、负电荷基团修饰的铂纳米微粒在肿瘤组织的微酸性环境下更加有利于癌细胞内吞。
应用例6
在pH6.5条件下培养肝癌细胞HepG2，分别与铁浓度为0.05mM的该混合电荷修饰四氧化三铁纳米微粒和PEG2000修饰的四氧化三铁纳米微粒培养12小时，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射 电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，结果表明混合电荷基团修饰的四氧化三铁纳米微粒的癌细胞内吞量明显高于PEG2000修饰的四氧化三铁纳米微粒，具有显著差异，说明该正、负电荷基团修饰的四氧化三铁纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能有效促进癌细胞对纳米微粒的内吞。
在雄性BALB/c裸鼠背部种植人口腔样表皮癌细胞KB细胞的模型肿瘤，待肿瘤长至约100mm-3时，分别尾静脉注射四氧化三铁含量为100ug该混合电荷修饰四氧化三铁纳米微粒和PEG2000修饰的四氧化三铁纳米微粒。24小时后，直接对小鼠进行磁共振成像，结果表明本发明四氧化三铁纳米微粒材料作用的小鼠肿瘤组织的磁共振信号大大强于PEG2000修饰的四氧化三铁纳米微粒作用小鼠。
每天对将小鼠肿瘤在交变磁场下作用一定时间，一周后发现本发明四氧化三铁纳米微粒材料作用的小鼠肿瘤受到明显抑制，肿瘤体积大大小于于PEG2000修饰的四氧化三铁纳米微粒作用小鼠。说明本发明四氧化三铁纳米微粒材料能有效用于肿瘤磁热治疗。
牺牲小鼠，用电感耦合等离子体质(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定各脏器和肿瘤组织的铁含量。ICP-MS结果表明混合电荷修饰的四氧化三铁纳米微粒在网状内皮系统的主要脏器肝和脾中的滞留量明显低PEG2000修饰的四氧化三铁纳米微粒，具有显著差异。说明该正、负电荷基团修饰的四氧化三铁纳米微粒能更有效逃离网状内皮系统对外界纳米微粒的清除。同时结果表明混合电荷修饰的四氧化三铁纳米微粒在肿瘤组织的富集量明显高于PEG2000修饰的四氧化三铁纳米微粒，说明该正、负电荷基团修饰的四氧化三铁纳米微粒能更有效靶向肿瘤组织。透射电镜和共聚焦显微镜结果表明该混合电荷修饰的四氧化三铁纳米微粒在肿瘤组织的细胞内吞量明显高于PEG2000修饰的四氧化三铁纳米微粒，说明该正、负电荷基团修饰的四氧化三铁纳米微粒在肿瘤组织的微酸性环境下更加有利于癌细胞内吞，具有很好的用于肿瘤磁共振成像和癌症磁热疗的应用前景。
应用例7
在pH6.5条件下培养肝癌细胞HepG2，分别与镉浓度为0.05mM的该混合电荷修饰CdSe/ZnS纳米微粒和PEG2000修饰的CdSe/ZnS纳米微粒培养12小时，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定细胞内吞的含量，结果表明混合电荷基团修饰的CdSe/ZnS纳米微粒的癌细胞内吞量明显高于PEG2000修饰的CdSe/ZnS纳米微粒，具有显著差异，说明该正、负电荷基团修饰的CdSe/ZnS纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能有效促进癌细胞对纳米微粒的内吞。
在pH6.5条件下培养肝癌细胞HepG2，分别与镉浓度为0.05mM的该混合电荷修饰CdSe/ZnS纳米微粒和PEG2000修饰的CdSe/ZnS纳米微粒培养1小时，共聚焦显微镜进行成像。结果表明本发明CdSe/ZnS纳米微粒材料作用的癌细胞由于表面和细胞内聚集大量CdSe/ZnS纳米微粒，大大增强了荧光信号，能有效地进行癌细胞成像。而PEG2000修饰的CdSe/ZnS纳米微粒作用的癌细胞在相同条件下荧光信号很弱。说明该正、负电荷基团修饰的CdSe/ZnS纳米微粒在类似肿瘤组织的微酸性环境下能用于肿瘤的荧光成像，可用于肿瘤的诊断分析。
在雄性BALB/c裸鼠背部种植人口腔样表皮癌细胞KB细胞的模型肿瘤，待肿瘤长至约100mm-3时，分别尾静脉注射CdSe/ZnS含量为100ug该混合电荷修饰CdSe/ZnS纳米微粒和PEG2000修饰的CdSe/ZnS纳米微粒。24小时后，直接对小鼠进行活体荧光成像，结果表明本发明CdSe/ZnS纳米微粒材料作用的小鼠肿瘤组织的荧光信号大大强于PEG2000修饰的CdSe/ZnS纳米微粒作用小鼠。牺牲小鼠，用电感耦合等离子体质(ICP-MS)和细胞切片透射电镜(TEM)测定各脏器和肿瘤组织的镉含量。ICP-MS结果表明混合电荷修饰的CdSe/ZnS纳米微粒在网状内皮系统的主要脏器肝和脾中的滞留量明显低PEG2000修饰的CdSe/ZnS纳米微粒，具有显著差异。说明该正、负电荷基团修饰的CdSe/ZnS纳米微粒能更有效逃离网状内皮系统对外界纳米微粒的清除。同时结果表明混合电荷修饰的CdSe/ZnS纳米微粒在肿瘤组织的富集量明显高于PEG2000修饰的CdSe/ZnS纳米微粒，说明该正、负电荷基团修饰的CdSe/ZnS纳米微粒能更有效靶向肿瘤组织。透射电镜和共聚焦显微镜结果表明该混合电荷修饰 的CdSe/ZnS纳米微粒在肿瘤组织的细胞内吞量明显高于PEG2000修饰的CdSe/ZnS纳米微粒，说明该正、负电荷基团修饰的CdSe/ZnS纳米微粒在肿瘤组织的微酸性环境下更加有利于癌细胞内吞，具有很好的用于肿瘤荧光成像的应用前景。