TSUB1/SUBTSUB1/SUB协同作用钆螯合四氧化三锰纳米粒子的制备方法及其生物应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102923782 B (45)授权公告日 2014.10.29 CN 102923782 B (21)申请号 201210452070.1 (22)申请日 2012.11.12 A61K 49/06(2006.01) (73)专利权人 上海师范大学 地址 200234 上海市徐汇区桂林路 100 号 (72)发明人 杨仕平 汪娟娟 周治国 陈冬梅 杨昕仪 孔斌 (74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 31227 代理人 吴瑾瑜 CN 102320664 A,2012.01.18, 说明书第 0030-0040 段 . 庄业明 . 纳米多功能磁共振造影。

2、剂的设计、 合成及其生物应用 .中国优秀硕士学位论文全 文数据库 工程科技辑 .2011,( 第 11 期 ), 第 5-6 页及第 51-53 页 . (54) 发明名称 T1-T1协同作用钆螯合四氧化三锰纳米粒子 的制备方法及其生物应用 (57) 摘要 本发明公开了一种 T1-T1 协同作用钆螯合四 氧化三锰纳米粒子的制备方法及其生物应用， 该 方法首先合成乙酰丙酮锰， 然后以油胺为溶剂， 利 用高温热解方法合成油溶性四氧化三锰纳米粒 子， 然后利用配体交换的方法用阿伦磷酸钠交换 到四氧化三锰纳米粒子表面形成表面带有大量氨 基的纳米粒子。然后在氨基表面接上二乙基三胺 五乙酸， 使纳米粒子表。

3、面带有大量羧基， 最后利用 螯合作用使大量的羧基和钆螯合， 从而得到钆螯 合的四氧化三锰纳米粒子。这种制备方法对设备 的要求很低， 操作过程方便， 所需原料价格低廉， 副产物无公害。最后经过体外和体内磁共振成像 实验测试， 说明其 T1 磁共振成像造影效果比单独 的锰和单独的钆都有增强作用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 胡静 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 (10)授权公告号 CN 102923782 B CN 102923782 B 1/1 页 2 1. 一种。

4、 T1-T1协同作用钆螯合四氧化三锰纳米粒子的制备方法， 其特征在于， 包括如下 步骤 ： （1） 制备乙酰丙酮合锰前驱体 ： 取 2.5 克 MnCl24H2O 溶解在 15mL 水中 ； 向上述溶液中加 5.0mL 乙酰丙酮 ； 室温下搅 拌 30min ； 加入 5.0mL 三乙胺 ； 抽取反应液中的黄色沉淀物并过滤 ； 配制体积比为 4:1 的乙醇与水混合溶液， 将抽取过滤得到的黄色固体加到乙醇、 水混 合溶液中， 加热至 75-80， 搅拌至完全溶解使溶液呈棕色透明液体 ； 室温冷却， 过滤溶液 中黄色针状结晶， 得乙酰丙酮合锰前驱体 ； （2） 制备表面油胺配位油溶性四氧化三锰纳米。

5、粒子种子 ： 取上述步骤制得到的 0.4 克乙酰丙酮合锰前驱体溶解于 9.5 克油胺中， 抽真空， 在 氮气氛围中磁力搅拌， 缓慢加热到 140， 恒温反应 5h ； 冷却至室温后离心分离 ； 分离后 的物质用无水乙醇连续洗 3 次 ； 制得表面油胺配位的褐色物质油溶性四氧化三锰纳米粒 子 ； （3） 种子法制备粒径较大的四氧化三锰纳米粒子 ： 将步骤 （2） 中制得的纳米粒子溶于 16 g 的油胺中， 超声 ； 加入 0.6 g乙酰丙酮合锰前 驱体， 抽真空， 在氮气氛围中磁力搅拌， 缓慢加热到 220， 恒温反应 10 h ； 冷却至室温后 离心分离 ； 分离后的物质用无水乙醇连续洗3次 。

6、； 真空干燥 ； 制得表面油胺配位的褐色物质 油溶性四氧化三锰纳米粒子 ； （4） 制备水溶性的四氧化三锰纳米粒子 ： 将步骤 （3） 中四氧化三锰纳米粒子取 30 mg溶于 2 mL 的无水乙醇中 ； 取 1.2 g 阿伦 磷酸钠 ； 加入 20 mL 蒸馏水 ； 再加入四丁基氢氧化铵使阿伦磷酸钠全部溶解 ； 然后缓慢加 入四氧化三锰纳米粒子 ； 搅拌反应 9 h ； 离心分离 ； 分离后用无水乙醇洗涤3次 ； 真空干燥 ； 制得表面带有大量氨基的水溶性四氧化三锰纳米粒子 ； （5） 取步骤 （4） 制得水溶性纳米粒子 20 mg 溶解于无水 N,N- 二甲基甲酰胺 （DMF） ， 称 取二。

7、乙基三胺五乙酸 （DTPA） 7.9 mg 溶于 8 mLDMF 中， 将两者溶液超声溶解均匀， 置入容器 中， 抽真空， 在氮气氛围中搅拌 10 h ； 离心分离， 分别用乙醇和水各洗涤 2 次， 制得表面有 大量羧基的水溶性四氧化三锰纳米粒子 ； （6） 制备钆螯合的四氧化三锰纳米粒子 ： 取步骤 （5） 制备水溶性四氧化三锰纳米粒子 20 mg ； 取 10 mL Tris溶液溶解 8 mg 硝 酸钆置入容器中， 密封抽真空， 氮气保护 ； 室温搅拌 9 h ； 离心分离， 用无水乙醇洗涤 5 次， 制得钆螯合的四氧化三锰纳米粒子。 权 利 要 求 书 CN 102923782 B 2 。

8、1/4 页 3 T1-T1协同作用钆螯合四氧化三锰纳米粒子的制备方法及 其生物应用 技术领域 0001 本发明属于造影剂技术领域， 涉及一种增强型影像造影剂的制备方法及其生物应 用， 具体地说是一种 T1-T1协同作用钆螯合四氧化三锰纳米粒子的制备方法及其生物应用。 背景技术 0002 从 CT 诞生起， 影像医学走过了 40 年的高速发展期。今天， 我们拥有了性能极为强 大的影像设备 ： 320 层 CT， 7T 磁共振， PET-CT， 一种影像设备的显示能力极限是由其原理决 定的。CT， 是用 X 线加上旋转采集来成像。成像的时间在亚秒水平。旋转过程中滑环必然 产生抖动， X 线强度在不。

9、停波动， 人体血液和器官在运动， 这些都决定了其空间分辨率只能 局限在亚毫米水平， 永远不可能显示腺体级及细胞级解剖结构。CT 的最后一个临床应用 ： 冠脉显示已经实现， 未来不会再有什么大突破了。 磁共振的原理是分子特异性对比度， 但是 由于信噪比限制， 只有同样的分子达到一定数量才可显影。磁共振的另一显示能力是微观 的运动， 包括血液的运动和水的弥散运动， 但同样需要基于足够多的分子。 因而磁共振也不 能显示腺 体级和细胞级的结构。说到 PET， 本文的主角开始登场了 - 造影剂。如果没有 造影剂， PET 将不能形成任何影像。 0003 造影剂是一种外加给人体的物质， 通过某种机理改变图。

10、像信息， 增加图像诊断信 息。 当造影剂不发达时， 我们只能通过不断提高影像设备的性能来显示更多解剖细节， 进而 提高病变的发现能力。这不仅大幅提高了检查成本， 也大幅提高了医生的阅片工作量。而 当有了造影剂之后， 我们只需最基本的影像设备成像性能， 只要能够显示造影剂即可， 因为 造影剂在哪里， 病变就在哪里。 当我们可以开发出多种病变特异性造影剂时， 可以轻松获得 诊断。 0004 所以要想推动未来医学的发展， 必须要研究出更发达的造影剂， 这事迫在眉睫。 0005 人们对纳米材料的研究已深入到越来越小的尺度范围， 以及越来越多的功能特 征。纳米造影剂超高密度信息存储、 生物分子识别、 药。

11、物传输等方面具有极其重要的应用， 成为国际科技界的重大研究课题。生化及医学等领域对纳米造影剂的物理、 化学及药理性 质如化学组成、 粒度大小、 磁功能、 晶体结构、 表面形貌、 溶解性及毒性等都有严格的要求。 实现更好效果的纳米造影剂在生化及医学等领域的应用， 必须满足以下条件 ： 1. 低毒性 ； 3. 具有水溶性 ； 4. 具有较好的单分散性 ； 5 具有良好的或体内成像效果。 0006 本发明通过配体交换成水溶性的纳米粒子， 然后在粒子表面接上大量羧基， 然后 通过羧基的螯合作用螯合上钆。使得纳米粒子具有锰钆结合的更强成像效果， 同时具有良 好的分散性和水溶性。本发明合成方法简单， 反应。

12、条件温和、 所需原材料易得、 价格低廉、 操作过程方便、 无环境污染等优点。使用简单的反应装置即可制备粒径均一、 分散性好、 水 溶性好的具有与钆有协同作用的四氧化三锰纳米粒子。 0007 经广泛检索国内外专利文件和公开出版物， 均未见有与本发明相同的具有协同效 应的纳米粒子研究方法。本发明具有新颖性、 创造性、 实用性。 说 明 书 CN 102923782 B 3 2/4 页 4 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种成像效果好， 具有良好分散性和水溶性， 同时合成方法 简单的造影剂， 即 T1-T1协同作用钆螯合四氧化三锰纳米粒子的制备及其生物应用。 0009 本发明的目的是这样实现。

13、的 ： 0010 一种 T1-T1 协同作用钆螯合四氧化三锰纳米粒子的制备方法， 包括如下步骤 ： 0011 （1） 将 MnCl24H2O 溶于水中， 加入乙酰丙酮， 室温下搅拌 30-40min ； 再加入三乙 胺， 过滤得沉淀物 ； 将沉淀物加入到乙醇与水的混合溶液中， 加热至 75-80， 搅拌至完全 溶解 ； 室温冷却， 过滤， 得乙酰丙酮合锰前驱体 ； 0012 （2） 将制得的乙酰丙酮合锰前驱体溶解于油胺中， 在氮气氛围中磁力搅拌， 缓慢加 热到 140-145， 恒温反应 5-6h， 冷却至室温后离心分离 ； 分离后的物质用无水乙醇连续洗 3-5 次， 制得表面油胺配位的褐色物。

14、质油溶性四氧化三锰纳米粒子 ； 0013 （3） 将步骤 （2） 中制得的纳米粒子溶于油胺中， 超声 ； 加入乙酰丙酮合锰前驱体， 在氮气氛围中磁力搅拌， 缓慢加热到 220-230， 恒温反应 10-12h ； 冷却至室温后离心分 离 ； 分离后的物质用无水乙醇连续洗3-5次 ； 真空干燥 ； 制得表面油胺配位的褐色物质油溶 性四氧化三锰纳米粒子 ； 0014 （4） 向阿伦磷酸钠中加入蒸馏水， 再加入四丁基氢氧化铵使阿伦磷酸钠全部溶解 ； 将步骤 （3） 中四氧化三锰纳米粒子溶于无水乙醇中， 加入上述阿伦磷酸钠的溶液中， 搅拌反 应 9-10h， 离心分离 ； 分离后用无水乙醇洗涤 3-5。

15、 次， 真空干燥， 制得表面带有大量氨基的水 溶性四氧化三锰纳米粒子 ； 0015 （5） 取步骤 （4） 制得水溶性四氧化三锰纳米粒子和二乙基三胺五乙酸 （DTPA） 分别 溶解于无水， 二甲基酰胺 （DMF） ， 混合后在氮气氛围中搅拌 10-12h ； 离心分离， 分别用 乙醇和水各洗涤 2-3 次， 制得表面有大量羧基的水溶性四氧化三锰纳米粒子 ； 0016 （6） 将硝酸钆溶于 Tris 溶液中， 加入步骤 （5） 制备水溶性四氧化三锰纳米粒子， 密 封抽真空， 氮气保护下室温搅拌 9-10h ； 离心分离， 用无水乙醇洗涤 5-7 次， 制得钆螯合的四 氧化三锰纳米粒子。 0017。

16、 步骤 （1） 中乙醇与水的混合溶液中乙醇与水的体积比为 3-5:1， 优选 4:1。 0018 步骤 （4） 中的四氧化三锰纳米粒子与阿伦磷酸钠的质量比为 1:35-45， 优选 1:40。 0019 步骤 （5）中的水溶性四氧化三锰纳米粒子与二乙基三胺五乙酸的质量比为 4-6:2， 优选 5:2。 0020 步骤 （6） 中的水溶性四氧化三锰纳米粒子与硝酸钆的质量比为 4-6:2， 优选 5:2。 0021 本发明首先通过热分解的方法进行制备油溶性的磁性纳米粒子， 然后通过配体 交换使纳米粒子转变为水溶性， 而且表面带有大量的氨基， 然后接上二乙基三胺五乙酸 （DTPA） 使得纳米粒子表面。

17、有大量的羧基， 最后通过螯合作用接上钆。从而实现合成锰和钆 的螯合， 形成锰钆共同作用的纳米粒子造影剂。 0022 本发明的优点是 ： 0023 1. 制得的锰钆螯合的纳米粒子稳定性好 ； 0024 2. 制备的粒子粒径均匀、 分散性好、 水溶性好 ； 0025 3. 原材料易得、 价格低廉 ； 说 明 书 CN 102923782 B 4 3/4 页 5 0026 4. 对 T1成像有增强的作用 ； 0027 5. 对 T1造影剂的研究有探究性的贡献。 附图说明 0028 图 1 是合成的油溶性的四氧化三锰纳米粒子的 X 衍射图谱。 0029 图 2 是合成的表面有机配体是油胺的四氧化三锰纳。

18、米粒子的透射电子显微镜图 谱 （TEM 图） ， 图 2 表明四氧化三锰纳米粒子在环己烷中具有较好的单分散性， 粒径为 11 纳 米左右。 0030 图 3 是与阿伦磷酸钠配体交换后表面有大量氨基的四氧化三锰纳米粒子在水溶 液中的 T1核磁共振成像图， 表明该纳米粒子具有良好的 T1成像效果。 0031 图 4 是本发明合成表面带有大量羧基的四氧化三锰纳米粒子的水溶液中 T1核磁 共振成像图， 与上面对比成像效果更好， r1值更大。 0032 图 5 是商用二乙基三胺五乙酸螯合钆的化合物 T1核磁共振成像图。 0033 图 6 是螯合接上钆后的四氧化三锰纳米粒子在水溶液中的 T1核磁共振成像图。

19、， 从 该图可以看出螯合钆后的四氧化三锰纳米粒子在 T1成像效果中比单独的锰和单独的钆有 明显的优势。 0034 图 7 是合成阿伦磷酸钠配体交换后的四氧化三锰纳米粒子在 HeLa 细胞中的 T1核 磁共振成像图， 纳米粒子浓度分别为 1、 10、 20、 50、 100 微克每毫升。 0035 图 8 是上述纳米粒子表面接上二乙基三胺五乙酸后的四氧化三锰纳米粒子在 HeLa 细胞中的 T1核磁共振成像图， 纳米粒子浓度分别为 1、 10、 20、 50、 100 微克每毫升。 0036 图 9 是螯合钆后的四氧化三锰纳米粒子在 HeLa 细胞中 T1核磁共振成像图， 纳米 粒子浓度分别为 1。

20、、 10、 20、 50、 100 微克每毫升。 具体实施方式 0037 以锰钆螯合的四氧化三锰纳米粒子的制备方法， 包括如下步骤 ： 0038 （1） 制备乙酰丙酮合锰前驱体 ： 0039 取 2.5 克 MnCl24H2O 溶解在 15mL 水中 ； 向上述溶液中加 5.0mL 乙酰丙酮 ； 室温 下搅拌 30min ； 加入 5.0mL 三乙胺 ； 抽取反应液中的黄色沉淀物并过滤 ； 0040 配制体积比为 4:1 的乙醇与水混合溶液， 将抽取过滤得到的黄色固体加到乙醇、 水混合溶液中， 加热至 75-80， 搅拌至完全溶解使溶液呈棕色透明液体 ； 室温冷却， 过滤 溶液中黄色针状结晶，。

21、 得乙酰丙酮合锰前驱体 ； 0041 （2） 制备表面油胺配位油溶性四氧化三锰纳米粒子种子 ： 0042 取上述步骤制得到的0.4克乙酰丙酮合锰前驱体溶解于9.5克油胺中， 抽真空， 在 氮气氛围中磁力搅拌， 缓慢加热到 140， 恒温反应 5h ； 冷却至室温后离心分离 ； 分离后的 物质用无水乙醇连续洗 3 次 ； 制得表面油胺配位的褐色物质油溶性四氧化三锰纳米粒子 ； 0043 （3） 种子法制备粒径较大的四氧化三锰纳米粒子 ： 0044 将步骤 （2） 中制得的纳米粒子溶于 16g 的油胺中， 超声 ； 加入 0.6g 乙酰丙酮合锰 前驱体， 抽真空， 在氮气氛围中磁力搅拌， 缓慢加热。

22、到 220， 恒温反应 10h ； 冷却至室温后 离心分离 ； 分离后的物质用无水乙醇连续洗3次 ； 真空干燥 ； 制得表面油胺配位的褐色物质 说 明 书 CN 102923782 B 5 4/4 页 6 油溶性四氧化三锰纳米粒子 ； 0045 （4） 制备水溶性的四氧化三锰纳米粒子 ： 0046 将步骤 （3） 中四氧化三锰纳米粒子取 30mg 溶于 2mL 的无水乙醇中 ； 取 1.2g 阿伦 磷酸钠 ； 加入 20mL 蒸馏水 ； 再加入四丁基氢氧化铵使阿伦磷酸钠全部溶解 ； 然后缓慢加入 四氧化三锰纳米粒子 ； 搅拌反应 9h ； 离心分离 ； 分离后用无水乙醇洗涤 3 次 ； 真空干。

23、燥 ； 制 得表面带有大量氨基的水溶性四氧化三锰纳米粒子 ； 0047 （5） 取步骤 （4） 制得水溶性纳米粒子 20mg 溶解于无水， 二甲基酰胺 （DMF） ， 称 取二乙基三胺五乙酸 （DTPA） 7.9mg 溶于 8mLDMF 中， 将两者溶液超声溶解均匀， 置入容器中， 抽真空， 在氮气氛围中搅拌 10h ； 离心分离， 分别用乙醇和水各洗涤 2 次， 制得表面有大量羧 基的水溶性四氧化三锰纳米粒子 ； 0048 （6） 制备钆螯合的四氧化三锰纳米粒子 ： 0049 取步骤 （5） 制备水溶性四氧化三锰纳米粒子 20mg ； 取 10mL Tris 溶液溶解 8mg 硝 酸钆置入容。

24、器中， 密封抽真空， 氮气保护 ； 室温搅拌 9h ； 离心分离， 用无水乙醇洗涤 5 次， 制 得钆螯合的四氧化三锰纳米粒子。 0050 以上所述为本发明的较佳实施例而已， 但本发明不应该局限于该实施例所公开的 内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改， 都落入本发明保护的范 围。 说 明 书 CN 102923782 B 6 1/4 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102923782 B 7 2/4 页 8 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102923782 B 8 3/4 页 9 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102923782 B 9 4/4 页 10 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 102923782 B 10 。