技术领域
本发明涉及一种丝素微球的制备方法，丝素微球可以做为药物缓释的载体。
背景技术
蚕丝丝素由18种氨基酸组成，由丝素制备的材料生物相容性优良，在体内可以缓慢降解，因此丝素微球在药物缓释载体方面的应用受到广泛的关注。在微球形态的丝素材料制备方面，目前已经有乳化（Yaowalak Srisuwanl）、凝固沉淀（Joydip Kundu）、喷雾干燥（Joo-Hong Yeo）、喷雾冷冻-冷冻干燥-交联（Esther wenk）等方法。如公开日为2008年08月20日，公开号为CN101244277的中国专利中，公开了一种丝素载药微球的制备方法，它采用水/油/水型的复乳技术和蛋白质的自组装技术，将水溶性药物与再生丝素溶液充分混合后，加入到搅拌中含有一定量乳化剂的油相中乳化，再加入有机溶剂搅拌，使丝素变性和结构Β化而形成乳白色结晶性丝素微粒的同时，药物被包埋，经离心除去上层液再加入有机溶剂，让丝素蛋白进一步结晶，药物继续被包埋，再离心除去溶剂和残留油相并收集微球；该丝素载药微球的制备方法属于乳化方法。
不同的制备方法的微球在包埋不同药物时的效果不同，释放机理和时间也不同，微球制备方法的设计需要针对药物的特性，目前还没有包埋效率高，药物随丝素微球降解而缓慢均匀的释放，生物相容性优良，适合于包埋和缓释纳米颗粒药物、多肽药物和酶类药物的丝素微球的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种包埋效率高，药物随丝素微球降解而缓慢均匀的释放，生物相容性优良的丝素微球的制备方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该丝素微球的制备方法的特点在于：所述制备方法的步骤如下：在3-10 wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，然后滴加入2-10 wt%的凝固剂，在80-120转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液；将混合溶液喷雾入-20℃～-80℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-20℃～-80℃的空间保存2小时以上；然后将冰微粒在0℃～室温下解冻，在0℃～室温下洗除凝固剂，离心或滤网收集得到丝素微球。本发明中的丝素微球具有包埋效率高，生物相容性优良的优点，药物随丝素微球降解而缓慢均匀的释放，药物缓释丝素微球可以直接使用外，还可以复合入生物材料中使用。
作为优选，本发明所述所需包埋和缓释的药物为纳米颗粒药物、多肽药物或酶类药物。
作为优选，本发明所述再生丝素溶液为家蚕、柞蚕和其他野蚕丝中的一种或者两种以上混合后的再生丝素溶液。
作为优选，本发明所述凝固剂为二甲亚砜、水溶性环氧化合物、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇和叔丁醇中的一种。
作为优选，本发明在0℃～室温下洗除凝固剂时，采用蒸馏水多次换水浸泡的方式洗除凝固剂。
作为优选，本发明所述丝素微球的粒径与喷雾细度有关，丝素微球的粒径呈离散分布，平均粒径在10～1000微米。
作为优选，本发明所述丝素微球在0℃～4℃保存待用，或经过低温真空干燥后保存待用，或经过冷冻干燥后保存待用。
作为优选，本发明当所用的凝固剂为水溶性环氧化合物时，将混合溶液喷雾入-20℃～-80℃的空间凝结，收集冰微粒后，冰微粒继续在-20℃～-80℃的空间保存2小时以上；当所用的凝固剂为二甲亚砜时，将混合溶液喷雾入-20℃～-80℃的空间凝结，收集冰微粒后，冰微粒继续在-20℃～-80℃的空间保存12小时以上；当所用的凝固剂为丙醇、异丙醇、正丁醇或叔丁醇时，将混合溶液喷雾入-20℃～-80℃的空间凝结，收集冰微粒后，冰微粒继续在-20℃～-80℃的空间保存24小时以上；当所用的凝固剂为甲醇或乙醇时，将混合溶液喷雾入-20℃～-80℃的空间凝结，收集冰微粒后，冰微粒继续在-20℃～-80℃的空间保存48小时以上。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：包埋效率高，药物随丝素微球降解而缓慢释放，生物相容性优良；药物缓释丝素微球可以直接使用外，还可以复合入其他材料和饲料等中使用；本发明在喷雾—冷冻过程中已经形成了不溶于水的丝素微粒，无需再经冷冻干燥-交联；丝素微球内外固化结构均匀，降解缓慢均匀；因在低温下固化丝素微球，固化剂不与丝素和药物反应，这些水溶性的固化剂可以浸泡除去，而纳米颗粒药物、多肽、酶类药物与丝素蛋白有弱结合，被固定住在丝素微球内将随丝素微球降解而释放。本发明尤其适用于包埋和缓释纳米颗粒药物、多肽和酶类药物。
本发明与喷雾冷冻-冷冻干燥-交联方法的不同之处在于以下几个方面，（1）本发明在喷雾冷冻过程中已经形成了不溶于水的丝素微粒，无需再经冷冻干燥-交联，本发明中用冷冻干燥只是为了干燥，因此也可以用低温真空干燥，也可以直接使用；而喷雾冷冻-冷冻干燥-交联方法必须要经过冷冻干燥-交联。（2）本发明的丝素微球内外固化结构均匀，因此降解缓慢均匀；喷雾冷冻-冷冻干燥-交联方法在形成了微球后再交联固化，容易内外交联固化结构不均匀，快速降解。（3）本发明在低温下固化丝素微球，固化剂不与丝素和药物反应，这些水溶性的固化剂可以浸泡除去，而纳米颗粒药物、多肽、酶类药物与丝素蛋白有弱结合，被固定住在丝素微球内将随丝素微球降解而释放；喷雾冷冻-冷冻干燥-交联方法在形成了微球后再交联固化，需要高浓度的交联剂和温度等交联反应条件，这些有可能会使交联剂与包埋的药物发生反应。
附图说明
图1是通过透射电镜观察到的本发明实施例13中纳米银在丝素微球中的复合状态示意图。
图2是本发明实施例13中的丝素微球在37℃下蛋白酶溶液中的降解速度示意图。
具体实施方式
下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1。
本实施例中制备的是缓释纳米银的丝素微球，该丝素微球的制备方法的步骤如下：将1000克家蚕茧壳用0.5wt % 的Na2CO3水溶液脱胶2次，每次30min，脱胶温度100℃，浴比1:100。脱胶后用水充分洗净，60℃干燥，得到丝素纤维。用CaCl2水溶液溶解丝素纤维，丝素纤维: CaCl2·2H2O:水=1g:25g:25ml，溶解温度为100℃，溶解时间为5min。将溶解后得到的溶液过滤后注入纤维素透析膜中透析3d，所用的纤维素透析膜的截留分子量为8000-14000。丝素溶液浓缩至4wt%，加入0.3wt%纳米银，滴加入5%的二缩水甘油基乙醚，100转/分缓慢均匀混合。-20℃下喷雾，收集冰微粒。继续在-20℃下保存冰微粒24小时。将冰微粒室温下解冻，室温下洗除凝固剂，2小时左右换水一次，总共换水3次。用滤网收集丝素微球，低温真空干燥后保存待用。
在丝素敷料制备过程中，将2～10wt %的丝素微球均匀混合入丝素溶液，可制成缓释纳米银的丝素敷料。丝素敷料的制备方法可以参见专利号为ZL 200510060655.9的中国发明专利。
在胶原生物敷料制备过程中，复合入5wt %的纳米银丝素微球，随着丝素微球的降解可以缓慢释放出纳米银和丝素蛋白，起到长效抑菌，促进创面愈合的作用。
实施例2。
本实施例中制备的是缓释生长因子的丝素微球，该丝素微球的制备方法的步骤如下：将1000克家蚕茧壳用0.5wt %的Na2CO3水溶液脱胶2次，每次30min，脱胶温度100℃，浴比1:100。脱胶后用水充分洗净，60℃干燥，得到丝素纤维。用CaCl2水溶液溶解丝素纤维，丝素纤维: CaCl2·2H2O:水=1g:25g:25ml，溶解温度100℃，溶解时间5min。将溶解后得到的溶液过滤，注入纤维素透析膜中透析3d，所用的纤维素透析膜截留分子量为8000-14000。丝素溶液浓缩至4wt%。灭菌后的丝素溶液冷却到0℃左右，在0℃左右的低温条件下，加入0.5wt %的人表皮生长因子（hEGF），滴加入3wt %二甲亚砜，在100转/分钟左右缓慢均匀混合。在-40℃下喷雾，收集冰微粒。继续在-40℃下保存冰微粒48小时。将冰微粒在0～4℃下解冻。0～4℃下洗除凝固剂，0.5小时左右换水一次，总共换水5次。用离心收集丝素微球，冷冻干燥后保存待用。
在磺胺嘧啶银药膏中，加入10-20wt % hEGF丝素微球，混合均匀后直接涂在清创后的烧烫伤创面上。随着丝素微球的降解可以缓慢释放出hEGF和丝素蛋白，促进创面的愈合。
实施例3。
本实施例中制备的是缓释抗菌肽的丝素微球，该丝素微球的制备方法的步骤如下：将500克家蚕茧壳用0.5wt % Na2CO3水溶液脱胶2次，每次30min，脱胶温度100℃，浴比1:100。脱胶后用水充分洗净，60℃干燥，得到丝素纤维。用摩尔比为1：8：2的氯化钙、水、乙醇溶液溶解丝素纤维，溶解温度70℃，浴比1:25，时间10分钟。将溶解后得到的溶液过滤后注入纤维素透析膜中透析3d，所用的纤维素透析膜截留分子量为8000-14000。丝素溶液浓缩至5wt %，加入抗菌肽1wt %，滴加入5wt %乙醇，100转/分钟左右缓慢均匀混合。在-20℃下喷雾，收集冰微粒。继续在-20℃下保存冰微粒96小时。将冰微粒4℃下解冻。4℃下洗除凝固剂，2小时左右换水一次，总共换水5次。滤网收集丝素微球，冷冻干燥后保存待用。
可以将缓释丝素微球复合入各种膏状涂敷药物中，随着丝素微球的降解可以缓慢释放出抗菌肽，起到抑菌、促进皮肤病的愈合的作用。
实施例4。
本实施例中制备的是包埋饲料添加酶的丝素微球，该丝素微球的制备方法的步骤如下：用CaCl2水溶液溶解丝素纤维，丝素纤维: CaCl2·2H2O:水=1g:25g:25ml，溶解温度100℃，时间5min。将溶解后得到的溶液过滤后注入纤维素透析膜中透析3d，所用的纤维素透析膜截留分子量为8000-14000。丝素溶液浓缩至6wt %，加入酶，滴加入5wt %乙醇，100转/分钟缓慢均匀混合。在-40℃下喷雾，收集冰微粒。继续在-40℃下保存冰微粒96小时。将冰微粒在4℃下解冻。在4℃下洗除凝固剂，2小时左右换水一次，总共换水3次。滤网收集丝素微球，冷冻干燥后保存待用。
将包埋了酶的丝素微球混入动物饲料中，可以延长酶的活性，提高酶的活性温度，加宽酶活性pH范围。
实施例5。
本实施例中的丝素微球的制备方法的步骤如下：在3wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，该所需包埋和缓释的药物为纳米颗粒药物，所用的再生丝素溶液为家蚕的再生丝素溶液。然后滴加入2 wt%的凝固剂，在100转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液，所用的凝固剂为二甲亚砜。将混合溶液喷雾入-50℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-50℃的空间保存48小时以上。然后将冰微粒在15℃下解冻，在15℃下洗除凝固剂，滤网收集得到丝素微球。在15℃下洗除凝固剂时，可以采用每2小时换水一次，总共换水5次的方式洗除凝固剂。
本发明可以在3-10 wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，该所需包埋和缓释的药物可以为纳米颗粒药物、多肽药物或酶类药物，所用的再生丝素溶液可以为家蚕、柞蚕和/或其他野蚕丝的再生丝素溶液。然后可以滴加入2-10 wt%的凝固剂，可以在80-120转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液，所用的凝固剂可以为二甲亚砜、水溶性环氧化合物、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇和叔丁醇中的一种。
本发明可以将混合溶液喷雾入-20℃～-80℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-20℃～-80℃的空间保存24小时以上，当所用的凝固剂为水溶性环氧化合物时，将混合溶液喷雾入-20℃～-80℃的空间凝结，收集冰微粒后，冰微粒可以继续在-20℃～-80℃的空间保存2小时以上；当所用的凝固剂为二甲亚砜时，将混合溶液喷雾入-20℃～-80℃的空间凝结，收集冰微粒后，冰微粒可以继续在-20℃～-80℃的空间保存12小时以上；当所用的凝固剂为丙醇、异丙醇、正丁醇或叔丁醇时，将混合溶液喷雾入-20℃～-80℃的空间凝结，收集冰微粒后，冰微粒可以继续在-20℃～-80℃的空间保存24小时以上；当所用的凝固剂为甲醇或乙醇时，将混合溶液喷雾入-20℃～-80℃的空间凝结，收集冰微粒后，冰微粒可以继续在-20℃～-80℃的空间保存48小时以上。
本发明可以将冰微粒在0℃～室温下解冻，可以在0℃～室温下洗除凝固剂，滤网收集得到丝素微球。在0℃～室温下洗除凝固剂时，可以采用每隔几小时换水一次，换水多次的方式洗除凝固剂。本发明中所说的室温，通常情况是指25℃左右。
本发明中的丝素微球的粒径与喷雾细度有关，丝素微球的粒径呈离散分布，平均粒径在10～1000微米。本发明制备而成的丝素微球可以在0℃～4℃保存待用，也可以经过低温真空干燥后保存待用，还可以经过冷冻干燥后保存待用。
在本发明的丝素微球中可以复合多种药物，丝素微球又可以复合入各种生物敷料中，复合入各种膏状涂敷药物中，随着丝素微球的降解可以缓慢释放出药物，起到治疗作用。
实施例6。
本实施例中的丝素微球的制备方法的步骤如下：在10 wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，该所需包埋和缓释的药物为多肽药物，所用的再生丝素溶液为柞蚕的再生丝素溶液。然后滴加入10 wt%的凝固剂，在80转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液，所用的凝固剂为甲醇。将混合溶液喷雾入-20℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-20℃的空间保存96小时以上。然后将冰微粒在0℃下解冻，在0℃下洗除凝固剂，滤网收集得到丝素微球。
实施例7。
本实施例中的丝素微球的制备方法的步骤如下：在5 wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，该所需包埋和缓释的药物为酶类药物，所用的再生丝素溶液为柞蚕的再生丝素溶液。然后滴加入9 wt%的凝固剂，在120转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液，所用的凝固剂为丙醇。将混合溶液喷雾入-80℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-80℃的空间保存72小时以上。然后将冰微粒在25℃下解冻，在25℃下洗除凝固剂，滤网收集得到丝素微球。
实施例8。
本实施例中的丝素微球的制备方法的步骤如下：在8 wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，该所需包埋和缓释的药物为多肽药物，所用的再生丝素溶液为家蚕的再生丝素溶液。然后滴加入6 wt%的凝固剂，在100转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液，所用的凝固剂为正丁醇。将混合溶液喷雾入-60℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-60℃的空间保存72小时以上。然后将冰微粒在10℃下解冻，在10℃下洗除凝固剂，滤网收集得到丝素微球。
实施例9。
本实施例中的丝素微球的制备方法的步骤如下：在6 wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，该所需包埋和缓释的药物为纳米颗粒药物，所用的再生丝素溶液为柞蚕的再生丝素溶液。然后滴加入3 wt%的凝固剂，在100转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液，所用的凝固剂为异丙醇。将混合溶液喷雾入-30℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-30℃的空间保存72小时以上。然后将冰微粒在20℃下解冻，在20℃下洗除凝固剂，滤网收集得到丝素微球。在20℃下洗除凝固剂时，可以采用每2小时换水一次，总共换水5次的方式洗除凝固剂。
实施例10。
本实施例中的丝素微球的制备方法的步骤如下：在4 wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，该所需包埋和缓释的药物为酶类药物，所用的再生丝素溶液为柞蚕的再生丝素溶液。然后滴加入7 wt%的凝固剂，在100转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液，所用的凝固剂为叔丁醇。将混合溶液喷雾入-40℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-40℃的空间保存72小时以上。然后将冰微粒在5℃下解冻，在5℃下洗除凝固剂，滤网收集得到丝素微球。
实施例11。
本实施例中的丝素微球的制备方法的步骤如下：在7 wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，该所需包埋和缓释的药物为酶类药物，所用的再生丝素溶液为家蚕的再生丝素溶液。然后滴加入4 wt%的凝固剂，在105转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液，所用的凝固剂为水溶性环氧化合物。将混合溶液喷雾入-70℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-70℃的空间保存24小时以上。然后将冰微粒在18℃下解冻，在18℃下洗除凝固剂，滤网收集得到丝素微球。
实施例12。
本实施例中的丝素微球的制备方法的步骤如下：在9 wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，该所需包埋和缓释的药物为多肽药物，所用的再生丝素溶液为柞蚕。然后滴加入5 wt%的凝固剂，在95转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液，所用的凝固剂为乙醇。将混合溶液喷雾入-55℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-55℃的空间保存96小时以上。然后将冰微粒在22℃下解冻，在22℃下洗除凝固剂，滤网收集得到丝素微球。在22℃下洗除凝固剂时，可以采用每2小时换水一次，总共换水5次的方式洗除凝固剂。
实施例13。
本实施例中制备的是缓释纳米银的丝素微球，该丝素微球的制备方法的步骤如下：将1000克家蚕茧壳用0.5wt % 的Na2CO3水溶液脱胶2次，每次30min，脱胶温度100℃，浴比1:100。脱胶后用水充分洗净，60℃干燥，得到丝素纤维。用CaCl2水溶液溶解丝素纤维，丝素纤维: CaCl2·2H2O:水=1g:25g:25ml，溶解温度为100℃，溶解时间为5min。将溶解后得到的溶液过滤后注入纤维素透析膜中透析3d，所用的纤维素透析膜的截留分子量为8000-14000。丝素溶液浓缩至4wt%，加入0.05wt%纳米银，滴加入3%的二缩水甘油基乙醚，100转/分缓慢均匀混合。-20℃下喷雾，收集冰微粒。继续在-40℃下保存冰微粒24小时。将冰微粒室温下解冻，室温下洗除凝固剂，2小时左右换水一次，总共换水6次。用滤网收集丝素微球，低温真空干燥后保存待用。
如附图1所示，显示的是在透射电镜下，纳米银在丝素微球中的复合状态，附图2显示的是丝素微球在37℃下蛋白酶溶液中的降解速度。
实施例14。
本实施例中的丝素微球的制备方法的步骤如下：在5.5wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，该所需包埋和缓释的药物为多肽药物，所用的再生丝素溶液为柞蚕的再生丝素溶液。然后滴加入6.5wt%的凝固剂，在98转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液，所用的凝固剂为甲醇。将混合溶液喷雾入-20℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-20℃的空间保存96小时以上。然后将冰微粒在0℃下解冻，在0℃下洗除凝固剂，滤网收集得到丝素微球。
实施例15。
本实施例中的丝素微球的制备方法的步骤如下：在10 wt%的再生丝素溶液中加入所需包埋和缓释的药物，该所需包埋和缓释的药物为多肽药物，所用的再生丝素溶液为柞蚕的再生丝素溶液。然后滴加入10 wt%的凝固剂，在102转/分钟的转速下缓慢搅拌，得到混合溶液，所用的凝固剂为甲醇。将混合溶液喷雾入-35℃的空间凝结，收集冰微粒，将冰微粒继续在-20℃的空间保存96小时以上。然后将冰微粒在8℃下解冻，在8℃下洗除凝固剂，滤网收集得到丝素微球。
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。