【技术领域】
本发明属于生物医学活性材料技术领域，特别涉及一种注射用微球粒子水 凝胶载药体及其制备方法与应用。
【背景技术】
在药物传递结合组织工程的研究中，对于构建一个体内的用于组织修复的 给药系统，材料的选择和制备非常重要。优秀的载药系统要满足以下几点要求： 具有较高的药物负载能力；能够帮助药物到达给药创伤部位；具有较高的流体 交换能力以便药物释放；具有良好的生物相容性。
近年来，除了传统的口服给药系统以外，针对特定受伤部位的可注入给药 系统是一个研究热点。这些给药系统主要集中在对体内受伤部位或者病变组织 的修复和重建中药物的传递。比如骨质疏松造成的骨密度下降和骨组织的丢失， 该可注射的给药系统可以让病人不用经过手术，采用注射方式，直接将构建骨 组织的基质如羟基磷灰石，和刺激骨组织生长的因子，注入到骨质疏松部位， 来达到治疗的目的。当前用来制备可注射的水凝胶给药系统通常来源于两种材 料，一种是合成的聚合物，如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和聚乳酸（PLA）； 另一种是天然的聚合物，如壳聚糖（chitosan）和胶原蛋白（collagen）。前者如 PMMA尽管具有较好的目标给药性、PLA是具有可体内生物降解的聚合物，但 这类聚合物对生物体具有不利影响，如生物相容性、在体内较长的降解周期及 降解产物所制造的不利于细胞生长的酸性环境等。
细菌纤维素的合成是来自于微生物的发酵作用。研究表明很多微生物都有 合成分泌细菌纤维素的功能，但是只有木醋杆菌（Gluconacetobacter xylinum） 被发现能合成分泌进入培养液中的细胞外纤维素。这种分泌出来的细菌纤维素 是以水合胶的形态存在，其中水分含量为其干重的500-700倍，因此在医学上， 这种高水分含量的材料非常适合作为一种直接被利用的水合胶材料。细菌纤维 素与植物衍化的纤维素有相同的分子和化学组成。但是不同于植物纤维素，细 菌纤维素通常具有高纯度（95%以上纤维素含量）、高结晶度（80%以上）和纳 米结构（几十纳米的微纤维结构），在水合状态下类似皮肤的机械性能，和在生 产阶段就易通过各种器皿和模具来塑形等优点。
以天然聚合物为原料的可注射的给药系统，目前越来越被广泛的研究。以 胶原蛋白和壳聚糖为主的可注射的给药系统已经被证实具有较高的生物相容 性，但如何提高其药物负载率一直是这类药物载体研究的关键点。
【发明内容】
本发明的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一种注射用微球粒子水 凝胶载药体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的注射用微球粒子水凝胶 载药体。
本发明的再一目的在于提供所述的注射用微球粒子水凝胶载药体的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种注射用微球粒子水凝胶载药体 的制备方法，包括如下步骤：
（1）将(0.80～2.30)×105CFU/ml细菌菌液按体积比1：100～5:100接种到 培养液中，于28～32°C、旋转培养1～5天，得到细菌纤维素微球粒子；
（2）将步骤（1）的细菌纤维素微球粒子置于0.05～0.1mol/L氯化钙溶液 中室温固化6～12小时后用去离子水漂洗，然后将细菌纤维素微球粒子与10～ 30mg/ml分散剂按质量体积比1：20混合均匀，得到注射用微球粒子水凝胶载 药体；
步骤（1）中：
所述的细菌的菌种为木醋杆菌菌种，优选为ATCC700178、ATCC53582或 ATCC53524的菌种；
所述的培养液中，每100ml培养液含有10～40g葡萄糖、3～6g蛋白胨、2～ 3g无水磷酸氢二钠、1～2g柠檬酸、0.5～1.5g硫酸镁、0.5～1g硫酸铵和0.5～ 1.5mL玉米糖浆提取液；
所述的培养优选在摇瓶中进行；
所述的旋转的速度优选为150～250rpm；
所述的细菌纤维素微球粒子的粒径优选为100～500μm；
所述的细菌纤维素微球粒子优选采用以下方法进行纯化处理：将细菌纤维 素微球粒子从培养液中取出，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在80°C水浴中振荡 破碎细胞5分钟后用去离子水洗至细菌纤维素微球粒子表面pH为中性，蒸汽灭 菌后，置于去离子水中，于4°C储存备用；
步骤（2）中：
所述的分散剂优选为羧甲基纤维素、淀粉、β-环状糊精、改性壳聚糖或明胶；
所述的混合优选在pH6.5～7.5的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中进行。
一种注射用微球粒子水凝胶载药体，由上述制备方法得到。
所述的注射用微球粒子水凝胶载药体可应用于治疗糖尿病和肥胖症。
采用青霉素（Benzyl penicillin）药物模型来检测该微球粒子水凝胶的药物负 载能力。药物负载率的测定为计算微球粒子在药物负载前后的重量百分比，具 体方法为：将微球粒子冷冻干燥后置于10mg/ml青霉素溶液中浸渍吸附0.5～1 小时后，将微球粒子再次冷冻干燥，通过两次冷冻干燥的微球粒子的重量比来 检测微球粒子药物负载率。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明使用细菌纤维素在旋转发酵条件下自然生成的微球粒子作为水 凝胶载药体的主体材料。由于细菌纤维素具有优秀的流体吸附和交换能力，对 药物的负载和释放与现有材料相比具有相对优势。如实验发现微球粒子载药率 最大为205%，远远高于以PMMA为材料的水凝胶25-30%的载药率。
（2）本发明中使用的细菌纤维素微球粒子具有100-500μm左右的粒径，便 于其与其他的材料制备成可注射的水凝胶载药体，且同等重量和体积的细菌纤 维素，微球粒子粒径越小，相对而言所获得的微球粒子数目会加大，应该材料 总表面积增加，导致载药率上升。
（3）本发明中使用的细菌纤维素微球粒子是一种不会被人体消化吸收且在 人体内残留不产生危害的纤维素材料，通常细菌纤维素可以被食用。因此这一 纤维素微球粒子开发的水凝胶对于特殊病人而言，特别对血糖浓度要求严格， 常规的淀粉或者壳聚糖或者明胶类的凝胶材料则不能大规模使用，这一不可消 化吸收的细菌纤维素微球粒子成为了一种良好的替代物。
【附图说明】
图1为实施例1的细菌纤维素微球粒子的显微镜图。
图2为实施例1的注射用微球粒子水凝胶载药体的显微镜图。
图3是实施例1的细菌纤维素微球粒子的扫描电子显微镜图，其中：A为 8mm细菌纤维素微球粒子（125rpm）的扫描电子显微镜图，B为0.5mm细菌纤 维素微球粒子（150rpm）的扫描电子显微镜图。
图4是在不同旋转速度和不同pH值环境中获得的不同粒径的注射用微球粒 子水凝胶载药体的载药率测试结果。
【具体实施方式】
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
（1）将0.80×105CFU/ml细菌菌液1ml(木醋杆菌菌种,ATCC700178)按体 积比1：100接种到100ml培养液(每100ml培养液含有20g葡萄糖、5g蛋白胨、 2.7g无水磷酸氢二钠、1.2g柠檬酸、1g硫酸镁、1g硫酸铵和1mL玉米糖浆 提取液(Sigma公司，C4648；下同。))中，于30°C、175rpm旋转培养3天后， 将细菌纤维素微球粒子从培养液中取出，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在80°C 水浴中振荡破碎细胞5分钟后用去离子水洗至细菌纤维素微球粒子表面pH为中 性，蒸汽灭菌后，得到100～500μm细菌纤维素微球粒子；置于去离子水中，于 4°C储存备用；
（2）将步骤（1）的细菌纤维素微球粒子置于0.1mol/L氯化钙溶液中室温 固化6小时后用去离子水漂洗，然后将干重1g细菌纤维素微球粒子与20mg/ml 羧甲基纤维素20ml按质量体积比1：20混合（在pH6.5的磷酸氢二钠/磷酸二 氢钠缓冲液中进行）均匀，得到注射用微球粒子水凝胶载药体。
实施例2
（1）将1.20×105CFU/ml细菌菌液2ml(木醋杆菌菌种,ATCC53582)按体积 比2：100接种到100ml培养液(每100ml培养液含有20g葡萄糖、5g蛋白胨、 2.7g无水磷酸氢二钠、1.2g柠檬酸、1g硫酸镁、1g硫酸铵和1mL玉米糖浆 提取液)中，于28°C、250rpm旋转培养1天后，将细菌纤维素微球粒子从培养 液中取出，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在80°C水浴中振荡破碎细胞5分钟后 用去离子水洗至细菌纤维素微球粒子表面pH为中性，蒸汽灭菌后，得到100～ 500μm细菌纤维素微球粒子；置于去离子水中，于4°C储存备用；
（2）将步骤（1）的细菌纤维素微球粒子置于0.05mol/L氯化钙溶液中室 温固化10小时后用去离子水漂洗，然后将1g细菌纤维素微球粒子与15mg/ml 淀粉20ml按质量体积比1：20混合（在pH6.9的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲 液中进行）均匀，得到注射用微球粒子水凝胶载药体。
实施例3
（1）将2.30×105CFU/ml细菌菌液5ml(木醋杆菌菌种,ATCC53524)按体积 比5：100接种到100ml培养液(每100ml培养液含有20g葡萄糖、5g蛋白胨、 2.7g无水磷酸氢二钠、1.2g柠檬酸、1g硫酸镁、1g硫酸铵和1mL玉米糖浆 提取液)中，于32°C、150rpm旋转培养5天后，将细菌纤维素微球粒子从培养 液中取出，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在80°C水浴中振荡破碎细胞5分钟后 用去离子水洗至细菌纤维素微球粒子表面pH为中性，蒸汽灭菌后，得到100～ 500μm细菌纤维素微球粒子；置于去离子水中，于4°C储存备用；
（2）将步骤（1）的细菌纤维素微球粒子置于0.08mol/L氯化钙溶液中室 温固化12小时后用去离子水漂洗，然后将1g细菌纤维素微球粒子与30mg/ml β-环状糊精20ml按质量体积比1：20混合（在pH7.5的磷酸氢二钠/磷酸二氢 钠缓冲液中进行）均匀，得到注射用微球粒子水凝胶载药体。
效果实施例
对实施例1的细菌纤维素微球粒子进行电子显微镜扫描，结果如图3所示， 其中：A为8mm细菌纤维素微球粒子（125rpm）的扫描电子显微镜图，B为 0.5mm细菌纤维素微球粒子（150rpm）的扫描电子显微镜图。从图3可以看出， 在高倍的扫描电子显微镜下，可以清晰的看出较小粒径的细菌纤维素微球粒子 的内部构造是空心的，而较大粒径的微球粒子内部是实心的。可见空心的内部 构造提供足够多的内部空间便于药物溶液贮存。
采用青霉素（Benzyl penicillin）药物模型来检测该微球粒子水凝胶的药物负 载能力。药物负载率的测定为计算微球粒子在药物负载前后的重量百分比，具 体方法为：将微球粒子在-20℃冷冻后进行冷冻干燥至少48小时后，置于 10mg/ml青霉素溶液中浸渍吸附6小时后，将微球粒子再次冷冻干燥，通过两次 冷冻干燥的微球粒子的重量比来检测微球粒子药物负载率。
对在不同旋转速度和不同pH值环境中获得的不同粒径的注射用微球粒子 水凝胶载药体的进行载药率测试，结果如图4所示。从图4可以看到，该微球 粒子对于偏中性药物的负载率要高于酸性药物负载率。随着细菌纤维素微球粒 子粒径的变小，药物负载率大大提高。且微球粒子粒径越小，药物负载的特异 性越不明显，即对酸性或者中性药物负载率的差别变得越来越小。因此，我们 得出，由于同等质量和体积的细菌纤维素的微球粒子粒径越小，相对而言所获 得的微球粒子数量越多且总面积越大，从而有利于获得较高的药物负载率。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任 何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本 发明权利要求的保护范围内。