技术领域
本发明涉及疫苗佐剂，具体涉及来自卡介菌多糖核酸组分，可用于治疗和预防用疫苗中的佐剂。
背景技术
佐剂是一种非特异性免疫增强物质，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。目前常用疫苗佐剂有氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、明矾等。但是以上这些佐剂对细胞免疫作用不明显，尤其是对以细胞免疫为主的疫苗，如对高纯化的第二代重组疫苗和第三代DNA疫苗，效果甚微。现有以上这些佐剂在临床上的应用已经满足不了现代疫苗技术发展的需求。
已有文献报道卡介菌多糖核酸，能刺激天然免疫，促进对机体细胞特异的细胞或体液免疫作用。但采用卡介菌多糖核酸做为疫苗佐剂还没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于卡介菌提取物的多糖核酸疫苗佐剂及其应用，该佐剂本身具有免疫活性，与疫苗中的抗原在体内作用能诱导Th1型为主的免疫应答。
一种疫苗佐剂，其主要成分是从卡介菌中提取的多糖和核酸，还含有残留的卡介菌菌体蛋白和质量百分含量小于10％的水分。
所述的疫苗佐剂，其中所述的多糖的质量百分比为70％-80％。
所述的疫苗佐剂，其中所述的核酸的质量百分比为10％-20％。
本发明所述的疫苗佐剂在制备治疗和预防用疫苗佐剂中的应用。
本发明的另一目的，是提供上述疫苗佐剂和抗原所制的疫苗。
一种疫苗，其含有所述佐剂和抗原，其中抗原和佐剂比例为：1∶1-15∶1。所述的抗原为牛分枝杆菌减毒株、新城疫Lasota株、流脑病毒灭活株、伪狂犬病毒灭活株或人源VEGF因子。
本发明所述疫苗为卡介苗、口蹄疫灭活疫苗、流感疫苗、伪狂犬病毒灭活疫苗或抗肿瘤疫苗。
本发明以卡介菌多糖核酸作为疫苗佐剂，研制出了新型的疫苗佐剂。通过大量试验证实，该新型佐剂本身具有免疫活性，证实了其作为佐剂诱导的免疫反应为Th1型，机体产生抗体类 型以IgG2a为主。本发明所述佐剂结合疫苗使用后，能诱导体液免疫，也能诱导细胞免疫，从而发挥和加强疫苗的预防作用及治疗作用。
本发明所述的卡介菌多糖核酸疫苗佐剂，一个重要特点就是来源于天然产物的疫苗佐剂。该疫苗佐剂包含多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和质量百分含量小于10％的水分，其中多糖质量百分含量为70-78％，核酸质量百分含量为12-20％，残留的卡介菌菌体蛋白质量百分含量为0-0.5％，苯酚的残留量为零，杂菌数为0-20个/克。
本发明提供的卡介菌提取产物多糖核酸，一个重要特点就是来自天然产物，其多糖含量、核酸含量可以通过紫外检测而获得。在卡介菌多糖中，构成主链的为1→6键型Glc。存在的1→4，6键型Glc，分支点残基为Glc(1→4，6)，为0.21，即每十个己糖残基中有两个分支，非还原性末端残基是1→Glc。
通过体外实验和体内实验，对卡介菌多糖核酸作为疫苗佐剂的药效学、作用机制进行了研究。
本发明的意义在于将卡介菌多糖核酸作为佐剂用于疫苗中，该佐剂可以与抗原协同作用，提高疫苗的药用效能。
附图说明
图1：肌肉注射各组对哮喘小鼠Penh/NS(％)的影响：
图2：肌肉注射各组对哮喘小鼠PC100(mg/ml)的影响：
图3：TES、DNA、BCG，3组肿瘤大小情况；
图4：卡介菌多糖核酸佐剂的制备工艺流程图。
具体实施方式
通过以下具体实施例和实验结果详细介绍本发明的创新和应用意义，帮助阅读者更好的理解本发明，但不构成对本发明实施范围的限定。
实施例一：卡介菌多糖核酸疫苗佐剂的制备
1、工艺流程图
工艺流程图见附图4
2、生产工艺过程
2.1菌种部分
2.1.1、工作种子批的来源：
由中国医学细菌菌种保藏管理中心分支杆菌专业实验室制备并提供，菌种为D2PB302SII甲10，保存于-40℃以下超低温冰箱中。
2.1.2、工作种子批的接种：
用灭菌后的注射器从工作种子批试管中抽出0.2-0.3ml注入培养基上，然后置于37-39℃恒温室培养30天左右，即第一代菌种培养成功。
2.1.3、保种：
挑选3-11代经培养10-15天，颜色淡黄，生长丰满的菌种，置2-5℃冰箱保存，标明名称、代数、编号、日期，冷藏时间不超过两个月。使用前应进行检查，确认无污染后再接种培养。
2.1.4、菌种的培养：
①苏通氏马铃薯培养基配制比例：
每1000ml：
②配制方法：
准确称取或量取以上试剂于不锈钢圆桶中，加纯化水至所需要量，用氨水调pH值至8.0左右。将一块泡碱后的马铃薯片装入异型试管，然后倒入培养液，液面略高于凹处，塞好棉塞，放入不锈钢盒中高温灭菌。
其中马铃薯块制作如下：将去皮的马铃薯切成长方形片状，长约8cm，宽约2.5cm，厚约1cm，然后泡碱(3％Na2CO3)30分钟，再用饮用水冲洗40分钟即可，然后再用纯化水洗去表皮饮用水带来的杂质，将马铃薯片放入异型试管中，加入配制好的培养基至略高于异型试管凹进部分，放入不锈钢盒内连同接种铲一起在0.11MPa、121℃条件下，灭菌30分钟。在冷却室放至常温。
③选种：
选取生长成熟，菌苔丰满呈浅黄色，无斑点，无自溶现象，菌落分布均匀、浓厚的生长了13-15天的新鲜菌苔作为下一代菌种。传代次数不超过12代。
④接种：
在无菌操作条件下，从已长好菌落的培养基上挑取少许菌苔均匀涂布于另一培养基上。
⑤培养：
将已接好种的培养基置于恒温培养室中培养15-21天，温度控制在37℃-39℃。
2.1.5、菌体收集
培养物应逐支检查，若有污染、浑浊等情况应废弃。收集马铃薯培养基内培养物或液体苏通表面培养物，压干，加适量纯化水，以组织捣碎机破碎菌体后备用。
2.2提取部分：
取破碎菌悬液与等量热酚混匀，以静置法或离心沉淀菌体，吸取上清液，以层析法除酚，加入适量乙醇沉淀多糖、核酸，收集沉淀物。分别以乙醇、乙醚混匀洗涤，离心后干燥即得精制多糖、核酸。
实施例二：基于卡介菌多糖核酸的疫苗佐剂使用时的远期效力学
不同剂量的卡介菌多糖核酸、不同时间、不同给药方式对哮喘小鼠气道炎症和气道反应性的影响。
方法：
选择Balb/c小鼠，设立卡介菌多糖核酸组、生理盐水组、哮喘组。哮喘组以OVA首次致敏为0天，在0d，7d，14d OVA腹腔注射致敏，第28，29，30，42，43，44d OVA滴鼻激发，每天一次。正常组在每次给药时间点给予相应剂量的生理盐水。卡介菌多糖核酸组干预剂量均为20μg/只，给药体积为60μl，分为肌肉注射和麻醉状态下滴鼻两种给药方式：肌肉 注射方式分为-7d给药组(-7dm)、+10天给药组(+10dm)、末次激发后给药组(+30dm)以及以上各个点多次给药组(Mdm)。；麻醉状态下滴鼻组相应地分为-7dn、+10dn、+30dn以及Mdn。各组末次激发后48h(即32d和46d)采用美国Buxco公司无创肺功能机测定气道反应性，结果以增强的呼吸间歇(Enhanced Pause，Penh)表示，以PC100(气道反应性升高为NS值2倍时的Mch激发浓度)评价气道高反应性。在46d时同时收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，涂片后HE染色计数嗜酸性粒细胞比例(EOS％)，做肺组织病理检查.
结果：
表1肌肉注射各组早期激发对Penh/NS(％)的影响
注：*VS asthma P＜0.05；& VS Mdm P＜0.05
表2肌肉注射各组对晚期激发Penh/NS(％)的影响
注：*VS asthma P＜0.05；
表3肌肉注射各组对哮喘小鼠PC100(mg/ml)的影响。
注：*VS asthma P＜0.05；**VS asthma P＜0.01
由表中数据可以知道哮喘组气道反应性及气道炎症明显高于正常组。-7dm、Mdm组早期PC100与哮喘组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，Mdm组晚期PC100与哮喘组相比有统计学差异(P＜0.05)。-7dn、+10dn、+30dn、Mdn组早期PC100与哮喘组相比均有统计学差异(P＜0.05)，+10dn、+30dn、Mdn组晚期PC100与哮喘组相比有统计学差异(P＜0.05)。-7dm、Mdm组BALF中EOS％明显低于哮喘组，-7dn、+10dn、+30dn、Mdn组的EOS％均明显低于哮喘组。对于肌肉注射各组，各个给药时间点均可显著降低哮喘小鼠早期激发气道反应性。多次干预组无论是早期还是晚期降低气道反应性的效果明显优于其他单次用药组。
结论：卡介菌多糖核酸不仅对哮喘小鼠具有预防作用，而且对已造模成功的哮喘小鼠具有治疗作用，因此卡介菌多糖核酸具有免疫增强剂作用，可以作为疫苗佐剂来使用。
实施例三：卡介菌多糖核酸佐剂协同乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)对小鼠B、T淋巴细胞活化的影响
方法：
1.以卡介菌多糖核酸和(或)HBsAg体外刺激小鼠脾单个核细胞，检测B细胞膜表面分子CD80、CD86和T细胞早期活化分子CD69的表达水平。
2.小鼠免疫卡介菌多糖核酸佐剂和(或)HBsAg后24h取脾，无菌分离单个核细胞，检测CD80、 CD86和CD69的表达水平。
结果：
表4采用40μgHBsAg+5μg卡介菌多糖核酸佐剂体外刺激
40μgHBsAg+5μg佐剂 40μgHBsAg CD80 27.36％±1.77％* 10.41％±0.72％ CD86 98.92％±0.09％* 74.85％±5.13％ CD69 12.47％±3.31％* 7.15％±1.37％
*VS 40μgHBsAg P＜0.05；
表54μgHBsAg+20μg卡介菌多糖核酸佐剂协同联合免疫
4μgHBsAg+20μg佐剂 4μgHBsAg 生理盐水组 CD80 12.26％±2.33％* 9.80％±1.17％ 8.50％±1.34％ CD86 63.84％±1.48％* 60.36％±1.11％ 56.69％±1.33％ CD69 33.97％±2.17％* 31.32％±2.78％ 27.77％±2.51％
*VS 4μgHBsAg，生理盐水组P＜0.05；
由表4，表5可知采用40μgHBsAg+5μg卡介菌多糖核酸佐剂体外刺激24h时，B细胞CD80、CD86阳性率显著高于40μgHBsAg组，T细胞CD69阳性率显著高于40μgHBsAg组。4μgHBsAg+20μg卡介菌多糖核酸佐剂协同联合免疫后，小鼠脾B细胞CD80的阳性率显著高于4μgHBsAg免疫组和生理盐水免疫组；CD86阳性率显著高于生理盐水免疫组；T细胞CD69表达阳性率显著高于4μgHBsAg免疫组和生理盐水组。
结论：卡介菌多糖核酸佐剂能有效辅助HBsAg活化B和T细胞，上调B细胞表面协同刺激分子CD80、CD86及T细胞早期活化分子CD69的表达。
实施例四：卡介菌多糖核酸疫苗佐剂在细胞移植模型荷瘤小鼠中的抗肿瘤免疫效果方法：
将24只荷瘤裸鼠随机分为TES(2-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸)组、DNA疫苗组、卡介菌多糖核酸组+DNA疫苗组，每组8只。于接种A549细胞株后第15天，TES组、卡介菌多糖核酸组、DNA组分别腹腔注射TES液、DNA疫苗液、卡介菌多糖核酸液+DNA疫苗液，各0.3mL，隔2天1次，共8次。采用双抗体夹心酶联免疫检测法检测3组荷瘤裸鼠血清IFN-γ、TNF-α水平；测定体内对肿瘤抑制率。
结果：
表6组瘤重、局部实体瘤生长抑制率和病理切片中坏死面积的比较
表7对荷瘤裸鼠血清内IFN-γ、TNF-α含量的影响(x±S pg/ml)
分组 荷瘤裸鼠 IFNγ含量 TNF-α含量 TES组 8 47.38±18.38* 13.71±4.42 DNA疫苗组 8 70.13±21.59 41.25±5.57 BCG+DNA疫苗组 8 57.88±19.32 16.25±3.91
结果：BCG+DNA疫苗组与TES组相比，肿瘤明显减少。BCG+DNA疫苗组与DNA比较差异有显著性差异。BCG+DNA疫苗组与DNA组的抑瘤率分别为：43.36％，26.10％。同时病理切片可见BCG+DNA疫苗组肿瘤组织坏死面积为大于DNA疫苗组，与抑瘤率基本吻合。说明卡介菌多糖核酸作为疫苗佐剂可抑制肿瘤生长，卡介菌多糖核酸作为疫苗佐剂可调节血清IFN-γ、TNF-α水平，可以明显提高荷瘤裸鼠IFN-γ、TNF-α的含量。
结论：卡介菌多糖核酸作为疫苗佐剂协同DNA疫苗使用可以明显提高DNA疫苗抗肿瘤免疫作用。