一种以杂交黄姑鱼成鱼为受体的生殖细胞移植方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810437260.3 (22)申请日 2018.05.09 (71)申请人 浙江省海洋水产研究所 地址 316000 浙江省舟山市定海区临城街 道体育路28号 (72)发明人 徐冬冬 竹内裕 楼宝 (74)专利代理机构 青岛合创知识产权代理事务 所(普通合伙) 37264 代理人 王晓晓 (51)Int.Cl. A01K 61/10(2017.01) (54)发明名称 一种以杂交黄姑鱼成鱼为受体的生殖细胞 移植方法 (57)摘要 本发明公开了一种以杂交黄姑鱼成鱼为受 体的。

2、生殖细胞移植方法， 以箕作黄姑鱼Nibea mitsukurii为母本、 银姑鱼Pennahia argentata 为父本制备杂交黄姑鱼， 杂交鱼具有性腺不育的 特点； 制备外源供体的生殖细胞， 采用显微注射 从泄殖孔处将生殖细胞注射到杂交黄姑鱼性腺 内， 然后对受体进行培育； 采用组织切片和显微 观察检测外源生殖细胞在受体内的增殖。 由于杂 交黄姑鱼性腺不育， 无需任何物理或化学方法处 理致使其性腺不育； 且以成鱼为受体， 无需复杂 的仪器设备和精密的显微操作， 具有便于现场操 作、 安全可靠、 简单易行的特点。 本发明在生殖细 胞移植的理论研究和生产实践中具有重要的价 值。 权利要求书1。

3、页 说明书4页 附图2页 CN 108812447 A 2018.11.16 CN 108812447 A 1.一种杂交黄姑鱼的培育方法， 其特征在于所述培育方法包括以下步骤： （1） 将箕作黄姑鱼和银姑鱼分别养殖于水槽内， 每个水槽养殖3040尾， 培育水温为23 24； （2） 采集所述箕作黄姑鱼的未受精卵和银姑鱼的新鲜精液； 将银姑鱼新鲜精液滴入箕 作黄姑鱼卵中， 用海水激活后搅动使其充分混匀， 完成受精过程； （3） 将受精卵进行孵化， 对孵化后的杂交鱼苗进行培育， 培育过程分为仔鱼期、 稚鱼期 和幼鱼期， 培育采用的饵料依次为轮虫、 卤虫无节幼体、 饲料。 2.根据权利要求1所述的杂。

4、交黄姑鱼的培育方法， 其特征在于： 所述孵化的培育水温为 2024， 盐度2832， pH8.08.2。 3.根据权利要求1所述的杂交黄姑鱼的培育方法， 其特征在于： 所述仔鱼期采用加水培 育， 每天加水为池水的10%20%， 培育密度23万尾/m3， 水温保持在24， 盐度为2832， pH8.08.2。 4.根据权利要求1所述的杂交黄姑鱼的培育方法， 其特征在于： 所述稚鱼期每天换水两 次， 每次换水量为池水的50%100%， 培育密度0.51万尾/m3， 每两天吸污1次， 培育池水温24 ， 盐度为2832， pH8.08.2。 5.利用权利要求1-4任一项培育方法制得的杂交黄姑鱼成鱼为。

5、受体的生殖细胞移植方 法， 其特征在于所述移植方法包括以下步骤： （1） 外源生殖细胞的制备 取出外源供体的精巢， 将精巢内的性腺组织剪碎后， 采用L-15培养液清洗， 采用24倍 体积的消化液置于室温下消化35h， 消化后的组织液过滤， 加入DNase 进行消化制得外源 生殖细胞； （2） 受体的准备与生殖细胞移植 待杂交黄姑鱼培育至6月龄时， 准备进行移植， 将杂交鱼先麻醉并固定在显微操作注射 仪的平板上， 显微注射仪吸入外源生殖细胞后， 从黄姑鱼的泄殖孔注射到性腺内； （3） 移植后的杂交黄姑鱼 对移植后的杂交黄姑鱼进行培育， 培育条件为水温为2324 ， 每天光照时间为12 h， 光照。

6、强度为50100 Lx； 移植2周后， 若性腺内能够观察到外源生殖细胞， 表明外源生殖 细胞能够在性腺内增殖。 6.根据权利要求5所述的生殖细胞移植方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 中外源供体为3 月龄的雄性黄姑鱼。 7.根据权利要求5所述的生殖细胞移植方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 中消化液的组 分为： 0.25% 胰蛋白酶、 4 mg/mL 胶原蛋白酶 H、 5% FBS、 0.05% DNase 溶于L-15培养基。 8.根据权利要求5所述的生殖细胞移植方法， 其特征在于： 所述步骤 （2） 中在进行生殖 细胞移植的两周前， 维持水温为2324， 每天光照时间为12 h， 。

7、光照强度为50100Lx。 9.根据权利要求5所述的生殖细胞移植方法， 其特征在于： 所述步骤 （2） 中注射时使鱼 体与显微注射针保持3045 斜角。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108812447 A 2 一种以杂交黄姑鱼成鱼为受体的生殖细胞移植方法 技术领域 0001 本发明属于海洋生物技术领域， 具体涉及一种以杂交黄姑鱼成鱼为受体的生殖细 胞移植方法。 背景技术 0002 鱼类生殖细胞是将供体 （donor） 的外源生殖细胞移植到受体中， 利用受体生产供 体的配子， 繁育供体的后代， 该技术也被形象的称为 “借腹生子” 或代孕亲鱼 （surrogate broodstoc。

8、k） 技术。 2004年日本东京海洋大学吉崎悟朗 （Yoshizaka） 课题组在世界上首次将 供体虹鳟 （Oncorhynchus mykiss） 的PGCs （Primordial germ cell， PGC） 移植到了受体大马 哈鱼 （Oncorhynchus masou） 的仔鱼体内， 宿主大马哈鱼性成熟后能够产生虹鳟 （供体） 的配 子， 这是世界上首次成功建立的鱼类生殖细胞移植技术系统。 该技术在缩短鱼类性成熟周 期， 性控育种 （全雌/雄鱼的制备） 、 濒危物种保护和基因资源保存等方面都具有巨大的应用 前景。 0003 受体的选择与制备是影响生殖细胞移植成功与否的关键因素。 为。

9、了避免免疫排斥 反应， 研究学者采用免疫系统尚未完善的胚胎或者仔稚鱼阶段进行外源生殖细胞移植。 例 如： 以斑马鱼胚胎为受体， 日本学者Saito利用单个原始生殖细胞的移植实现了种间、 属间、 甚至不同科间的异种移植； 以孵出的仔鱼为受体， 日本学者Takeuchi实现经济鱼类虹鳟和 大马哈鱼的种间移植。 然而， 以胚胎或者仔鱼作为受体进行生殖细胞移植， 需要熟练的显微 操作和精密的操作设备， 限制了该技术的广泛应用。 本技术以成鱼为受体进行生殖细胞移 植， 无需物理或化学方法处理， 操作简便易行， 在生殖细胞移植的理论研究和生产实践中具 有重要的价值。 发明内容 0004 本发明的目的是提供。

10、了一种以杂交黄姑鱼成鱼为受体的生殖细胞移植方法。 本发 明利用了杂交黄姑鱼具有性腺不育的特点， 无需任何物理或化学方法处理致使其性腺不 育； 具有操作简便、 安全可靠、 简单易行的优点。 0005 本发明实现其发明目的所采用的技术方案是： 本发明提供了一种杂交黄姑鱼的培育方法， 所述培育方法包括以下步骤： （1） 将箕作黄姑鱼和银姑鱼分别养殖于水槽内， 每个水槽养殖3040尾， 培育水温为23 24； （2） 采集所述箕作黄姑鱼的未受精卵和银姑鱼的新鲜精液； 将银姑鱼新鲜精液滴入箕 作黄姑鱼卵中， 用海水激活后搅动使其充分混匀， 完成受精过程； （3） 将受精卵进行孵化， 对孵化后的杂交鱼苗进。

11、行培育， 培育过程分为仔鱼期、 稚鱼期 和幼鱼期， 培育采用的饵料依次为轮虫、 卤虫无节幼体、 饲料。 0006 进一步的： 所述孵化的培育水温为2024， 盐度2832， pH8.08.2。 0007 进一步的： 所述仔鱼期采用加水培育， 每天加水为池水的10%20%， 培育密度23万 说 明 书 1/4 页 3 CN 108812447 A 3 尾/m3， 水温保持在24， 盐度为2832， pH8.08.2。 0008 进一步的： 所述稚鱼期每天换水两次， 每次换水量为池水的50%100%， 培育密度 0.51万尾/m3， 每两天吸污1次， 培育池水温24， 盐度为2832， pH8.0。

12、8.2。 0009 本发明还提供了利用杂交黄姑鱼成鱼为受体的生殖细胞移植方法， 所述移植方法 包括以下步骤： （1） 外源生殖细胞的制备 取出外源供体的精巢， 将精巢内的性腺组织剪碎后， 采用L-15培养液清洗， 采用24倍 体积的消化液置于室温下消化35h， 消化后的组织液过滤， 加入DNase 进行消化制得外源 生殖细胞； （2） 受体的准备与生殖细胞移植 待杂交黄姑鱼培育至6月龄时， 准备进行移植， 将杂交鱼先麻醉并固定在显微操作注射 仪的平板上， 显微注射仪吸入外源生殖细胞后， 从黄姑鱼的泄殖孔注射到性腺内； （3） 移植后的杂交黄姑鱼 对移植后的杂交黄姑鱼进行培育， 培育条件为水温为。

13、2324 ， 每天光照时间为12 h， 光照强度为50100 Lx； 移植2周后， 若性腺内能够观察到外源生殖细胞， 表明外源生殖 细胞能够在性腺内增殖。 0010 进一步的： 所述步骤 （1） 中外源供体为3月龄的雄性黄姑鱼。 0011 进一步的： 所述步骤 （1） 中消化液的组分为： 0.25% 胰蛋白酶、 4 mg/mL 胶原蛋白 酶 H、 5% FBS、 0.05% DNase 溶于L-15培养基。 0012 进一步的： 所述步骤 （2） 中在进行生殖细胞移植的两周前， 维持水温为2324， 每天光照时间为12 h， 光照强度为50100Lx。 0013 进一步的： 所述步骤 （2） 。

14、中注射时使鱼体与显微注射针保持3045 斜角。 0014 与现有技术相比， 本发明的优点和技术效果是： 本发明以箕作黄姑鱼为母本、 银姑 鱼为父本制备杂交黄姑鱼， 杂交鱼具有性腺不育的特点； 制备外源供体的生殖细胞， 采用显 微注射从泄殖孔处将生殖细胞注射到杂交黄姑鱼性腺内， 然后对受体进行培育； 采用组织 切片和显微观察检测外源生殖细胞在受体内的增殖。 由于杂交黄姑鱼性腺不育， 无需任何 物理或化学方法处理致使其性腺不育； 且以成鱼为受体， 无需复杂的仪器设备和精密的显 微操作， 具有便于现场操作、 安全可靠、 简单易行的特点。 本发明在生殖细胞移植的理论研 究和生产实践中具有重要的价值。 。

15、附图说明 0015 图1是用于生殖细胞移植的显微注射操作。 A. 生殖细胞移植设备； B和C. 生殖细 胞移植的位置， An： 肛门， UPG： 泄殖孔； D. 采用墨水进行预实验， 墨水注入性腺内。 0016 图2是移植后的生殖细胞观察图。 A和B. 移植24 h在受体性腺内观察到生殖细胞； C和E. 对照组性腺内未观察到生殖细胞； D和F. 移植两周后， 生殖细胞嵌合到受体性腺内， 箭头表示生殖细胞。 具体实施方式 0017 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。 说 明 书 2/4 页 4 CN 108812447 A 4 0018 实施例1 本发明提供了一种以杂交。

16、黄姑鱼成鱼为受体的生殖细胞移植方法， 该方法包括以下步 骤： 1. 杂交黄姑鱼的生产与培育 （1） 箕作黄姑鱼 （Nibea mitsukurii） 和银姑鱼 （Pennahia argentata） 分别养殖于1吨 水槽内， 每个水槽养殖3040尾， 采用控温控光的方式促进性腺发育， 培育水温为2324 。 0019 （2） 挑选性腺发育良好的箕作黄姑鱼和银姑鱼， 对箕作黄姑鱼采用人工挤压腹部 法采卵， 收集卵子于500mL 玻璃烧杯。 采用同样的人工挤压腹部法采集银姑鱼精液， 用经消 毒的干燥玻璃滴管吸取干净精液， 保存于1.5 mL离心管中并置于冰上， 将精液加入未受精 卵中 （精液约0。

17、.51mL） ， 干法受精， 轻轻将两者摇动混匀， 然后加入5倍于卵量体积的海水 完成受精过程。 0020 （3） 受精卵孵化和杂交苗培育 将受精卵放入500L玻璃水槽中孵化， 水温为24， 盐度2832， pH 8.08.2， 静水微 充气。 0021 杂交苗的培育过程分为仔鱼期(115日龄)、 稚鱼期(1525日龄)和幼鱼期 （25日 龄以后） 。 仔鱼期采用加水培育， 每天加水为池水的10%20%， 培育密度23万尾/m3， 微弱充 气， 水温保持在24。 稚鱼期 （1525日龄） ， 每天换水两次， 每次换水量为池水的50%100%， 培育密度0.51万尾/m3， 每两天吸污1次， 培。

18、育池水温24。 幼鱼期 （25日龄后） ， 每天换水一 次， 换水量100%， 培育密度视鱼体大小而定， 培育温度为自然海水温度。 仔鱼期和稚鱼期培 育的盐度均为2832， pH8.08.2。 苗种培育采用的饵料依次为轮虫、 卤虫无节幼体、 饲 料。 0022 2. 外源生殖细胞的制备和染色 （1） 将50条3月龄 （全长14.34 0.63 cm； 体重34.38 3.98g） 雄性黄姑鱼采用 MS222麻醉后， 解剖取出精巢。 0023 （2） 将新鲜精巢放入胚胎皿， 加入适量的L-15培养液， 用剪刀将性腺剪碎； 将剪碎 后的精巢移入离心管中， 300rpm离心， 弃上清液， 再加入L-。

19、15反复清洗3-5次。 0024 （3） 向剪碎后的性腺加入4mL 蛋白酶消化液 （0.25% 胰蛋白酶、 4mg/mL胶原蛋白酶 H、 5%胎牛血清、 0.05% DNase 溶于L-15培养基） 到6孔板中， 置于25消化3h。 0025 （4） 将消化后的组织液采用50 m滤器过滤， 过滤后的消化液中加入50 L 0.05% DNase 处理10 min， 然后对消化液在4 200g离心5 min 弃上清。 0026 （5） 细胞悬液离心后加入1 mL L-15悬浮细胞， 采用血球计数板进行计数， 计数后 的终细胞浓度为10106个细胞， 加入16L PKH26和1548L diluen。

20、t C， 室温下染色5 min。 使PKH26的终浓度为10M。 0027 （6） 然后后加入1mL L-15培养基组终止反应， 4 200g离心5min 后弃上清， 加入 2mL L-15培养基清洗2次， 加入800L L-15培养液、 100L 5%胎牛血清和0.5% DNase 重新 悬浮细胞， 置于冰上用于显微注射。 0028 3. 受体的准备与生殖细胞移植 杂交黄姑鱼具有性腺不育的特点， 杂交苗培育至6月龄时， 可以用于生殖细胞移植的受 说 明 书 3/4 页 5 CN 108812447 A 5 体。 在进行生殖细胞移植的两周前， 维持水温为2324， 每天光照时间为12 h， 光。

21、照强度 为50100Lx。 随机抽取62尾， 用于生殖细胞移植实验。 如图1所示， 首先将杂交鱼采用适量 的MS222麻醉， 将其固定在显微操作注射仪的平板上， 使鱼体与显微注射针保持3045 斜 角 （如图1. A） 。 显微注射仪吸入生殖细胞后， 从泄殖孔注射到性腺内 （如图1. B） 。 0029 4. 生殖细胞移植效果检测 对62条杂交鱼进行了生殖细胞移植， 对移植后的杂交黄姑鱼进行培育， 培育条件为水 温为2324 ， 每天光照时间为12 h， 光照强度为50100 Lx。 0030 移植24小时后， 在荧光显微镜下观察性腺中是否有外源生殖细胞； 移植2周后， 观 察性腺内是否有生殖。

22、细胞。 若性腺内能够观察到外源生殖细胞， 表明外源生殖细胞能够在 性腺内增殖。 0031 实验结果显示： 移植24小时后， 随机观察发现8条鱼性腺中均注入了生殖细胞 （图 2A， B） 。 移植两周后， 随机取10条鱼， 在荧光显微镜下观察， 可以观察到移植后的外源生殖细 胞嵌合到受体性腺内 （图2D， F） ； 而未进行生殖细胞移植的鱼， 没有观察到生殖细胞 （图2C， E） 。 0032 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其进行限制； 尽管参照前述实 施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的普通技术人员来说， 依然可以对前述实施 例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换； 而这些修改或替 换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 108812447 A 6 图1 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 108812447 A 7 图2 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 108812447 A 8 。