技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种浮萍草总黄酮提取物及其制 备方法。
背景技术
浮萍草为浮萍科植物紫萍[spirodela polyrhiza(L.)Schleid.]或浮萍(Lemna minor L.)，也叫浮萍、萍子草、水藓、水帘、九子萍、田萍等(《圣济总录》)。 广布于我国南北各省区大小湖泊，尤其在南方四季皆产，农业上用其净水、 饲养鱼和家禽，因而它具有来源广泛，产量大的特点。浮萍草具有很高的 药用价值，从古到今有大量的研究与应用，它味辛，性寒，能发汗解表， 透疹止痒，利水消肿，清热解毒，可用于风热表证、麻疹不透、隐疹瘙痒、 水肿癃闭、疮癣丹毒和烫伤等病症。
发明内容
本发明的目的是提供一种浮萍草总黄酮提取物及其制备方法。
浮萍草总黄酮提取物，它是按照下述步骤制备而成的：
1）取浮萍草全草粉末，按重量加入8～15倍浓度为20～90%的乙醇溶液， 加热回流提取1～3次，每次0.5～2小时，合并提取液；
2）将提取液减压浓缩至无醇味，通过大孔吸附树脂，先用水或浓度不 超过20%的乙醇溶液洗脱至流出液透明，然后用浓度为40～90%的乙醇溶液 洗脱4～8倍柱体积，收集40～90%的乙醇洗脱液，浓缩，干燥，
所述浮萍草总黄酮提取物中含有重量百分比为50～99%的总黄酮。
浮萍草总黄酮提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取浮萍草全草粉末，按重量加入8～15倍浓度为20～90%的乙醇溶液， 加热回流提取1～3次，每次0.5～2小时，合并提取液；
2）将提取液减压浓缩至无醇味，通过大孔吸附树脂，先用水或浓度不 超过20%的乙醇溶液洗脱至流出液透明，然后用浓度为40～90%的乙醇溶液 洗脱4～8倍柱体积，收集40～90%的乙醇洗脱液，浓缩，干燥。
优选的，所述的浮萍草总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：
1）取浮萍草全草粉末，按重量加入12倍浓度为70%的乙醇溶液，加热 回流提取2次，每次1小时，合并提取液；
2）将提取液减压浓缩至无醇味，通过大孔吸附树脂，先用水洗脱至流 出液透明，然后用浓度为70%的乙醇溶液洗脱5倍柱体积，收集70%的乙醇 洗脱液，浓缩，干燥。
进一步优选的，所述大孔吸附树脂是D101型大孔吸附树脂。
本发明中所说的“浓度”均是指的重量浓度，如“70%浓度的乙醇溶液” 指的是每100g溶液中含有乙醇70g。
本发明提取物具有抗变态反应、消肿、止痒的功效。对于二甲苯致小 鼠耳部肿胀的急性炎症有明显的抑制作用，对盐酸组胺致豚鼠瘙痒有较好 的抑制作用，能抑制2，4-二硝基氯苯致小鼠亚急性接触性湿疹的耳肿胀， 还能显著下调IL-4水平，从而抑制Th2的功能，说明本发明能抑制迟发型变 态反应。
附图说明
图1是不同浓度乙醇对提取效果的影响曲线图；
图2是不同浓度乙醇对黄酮类化合物洗脱效果曲线图；
图3是洗脱剂用量对总黄酮含量的影响。
具体实施方式
实施例1
浮萍草总黄酮提取物的制备方法，按照以下步骤制备而成：
1）取浮萍草全草粉末，按重量加入12倍浓度为70%的乙醇溶液，加热 回流提取2次，每次1小时，合并提取液；
2）将提取液减压浓缩至无醇味，通过大孔吸附树脂，先用水洗脱至流 出液透明，然后用浓度为70%的乙醇溶液洗脱5倍柱体积，收集70%的乙醇 洗脱液，浓缩，干燥。
总黄酮的含量测定方法：采用紫外分光光度法，以芦丁为标准品，在 505nm波长处测定吸光度，以芦丁浓度和吸光度绘制标准工作曲线，将待测 样品用80％甲醇提取，然后测定吸光度，由回归方程计算待测样品中总黄 酮的含量。
经检测，上述提取物中含有71.2%的总黄酮。
实施例2工艺研究
1）乙醇浓度对总黄酮提取的影响：称取浮萍草全草粉末6份，每份20g， 分别以10％，30％，50％，70％，80％，95％的乙醇回流提取，用12倍量 的液料比，提取两次，每次1小时，合并两次提取液，浓缩得浸膏，配制样 品溶液并测定其吸光度，由回归方程计算出供试样品中总黄酮的含量。
结果显示，不同浓度乙醇对提取效果的影响如图1所示。实验结果表明， 20～90%乙醇的提取效果较好，70%乙醇的提取效果最好，往后随着乙醇浓 度的加大，提取出的黄酮含量快速降低，有可能是随着乙醇浓度的增加， 某些脂溶性杂质的溶出的量增加，干扰因素增多。
2）树脂种类的选择
树脂的预处理：分别取新购的大孔吸附树脂D101、D4020和AB-8适量， 于烧杯中加适量纯化水浸泡24h，2mol/L盐酸浸泡12h，再用纯化水洗至中性。 2mol/L氢氧化钠溶液浸泡12h，纯化水洗至中性。最后用无水乙醇浸泡24h， 上柱，纯化水清洗，直至流出液和水混合无白色浑浊，再洗至无醇味，备用。
静态吸附实验：准确称取处理好的湿树脂D101、D4020和AB-8各1g， 置于3只100mL锥形瓶，精确加入样品液50mL，于水浴振荡器充分振荡20h， 滤过，测滤液中黄酮含量，计算吸附量。树脂吸附量=吸附前样品液的总黄 酮含量-吸附后滤液的总黄酮含量。由表1可知，3种型号树脂中D101大孔吸 附树脂的吸附量最大。
表13种树脂对贯叶连翘中黄酮类化合物静态吸附量
树脂型号 滤液浓度（Mg/ml） 静态吸附量（Mg/g） D101 3.682 85.165
D4020 4.251 72.514 AB-8 3.985 76.533
静态解吸实验：取充分吸附浮萍草总黄酮后的不同型号树脂各1g，分 别置12只100mL锥形瓶，编号，各加入20％、40％、60％、80％乙醇50mL， 于水浴振荡器充分振荡，测解吸液总黄酮含量，计算解吸率。树脂解吸率 (％)=解吸后滤液中总黄酮的含量/树脂的吸附量×100％。见表2。由表2可 知，20％、40％、60％、80％乙醇溶液的解吸率均是D101大孔吸附树脂较 高，且在D101大孔吸附树脂中以40％乙醇洗脱解吸率最大。
表23种树脂对贯叶连翘黄酮类化合物解吸率
3）不同浓度乙醇对黄酮类化合物洗脱效果的考察：将样品液通过装有 D101大孔吸附树脂的层析柱，吸附完毕后，分别用20％、40％、60％、70％、 80％、90％乙醇洗脱，洗脱液每100mL收集一次，对收集的洗脱液编号(1～3 为20％乙醇洗脱液，4～6为40％乙醇洗脱液，7～9为60％乙醇洗脱液，10～12 为70％乙醇洗脱液，13～15为80％乙醇洗脱液，16～18为90％乙醇洗脱液)，分 别计算洗脱液中总黄酮含量，绘制洗脱曲线。结果见图2。不同浓度乙醇对吸 附黄酮类化合物后的树脂洗脱时，黄酮类化合物主要集中在70％乙醇洗脱液， 占全部树脂吸附黄酮类化合物的76.6％，故洗脱液最佳乙醇浓度为70％。
4）洗脱剂用量考察：将样品液通过装有D101大孔吸附树脂的层析柱， 吸附完毕后，用70％乙醇洗脱，洗脱液每50mL收集一次，对收集的洗脱液 编号，分别计算洗脱液中黄酮类化合物含量，绘制洗脱曲线。结果见图3。 采用浓度为70％乙醇洗脱，当洗脱剂为5倍柱体积时，洗脱黄酮含量最大， 之后洗脱剂中黄酮含量急剧减少。因此确定洗脱剂剂量为5倍柱体积。
实施例3药效研究
湿疹是临床常见的过敏性炎症性皮肤病，以皮疹多样、剧烈瘙痒、反 复发作、易演变成慢性为特征，是临床常见的、多发的皮肤病之一，占皮 肤科门诊量的15％～30％。从发病机制上来看，湿疹主要是由复杂的内外激 发因子引起的一种迟发型变态反应。本发明进行了抗炎、止痒、抗变态反 应等方面的药效学研究，探讨其防治湿疹的药理作用。
1、止痒作用
取豚鼠50只，动物右后足脱毛后24小时，用砂纸后足背擦伤，以少量 渗血为度，然后将动物随机分为5组，分别在其擦伤处均匀涂布提取物 0.5g/kg、1g/kg、2g/kg，皮炎平2g/kg或基质2g/kg。30min后在其擦伤处依次 滴0.01％、0.02％、0.03%……1％盐酸组织胺0.05ml/只，每次间隔时间为 3min，记录各动物出现舔足反应时的组胺浓度，该浓度即为致痒阈，结果 用t检验(见表3)。
表3对盐酸组织胺致豚鼠足瘙痒痒阈的影响(X±s)
与对照组比较*P<0.05。
从表3可见，本发明提取物可显著提高盐酸组织胺对豚鼠的致痒阈，且 呈一定量效关系。
2、对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
取小鼠30只，随机分为5组：空白对照组，阳性对照组及高、中、低剂 量药物组，每组6只。对各组小鼠右耳涂予二甲苯致炎，每只0.05mL。30min 后，低、中、高剂量药物组分别在右耳均匀涂布提取物0.5、1.0、2.0g/kg， 阳性对照组给予曲咪新乳膏2.0g/kg，空白对照组给予空白基质2.0g/kg。涂 药30min后，各给药组以纯化水洗去药液，用于棉球擦净，处死小鼠，分别 剪下左右耳，左耳作对照，8mm打孔器将双耳同部位等面积切下，然后在 BS2202S型电子天平上分别称定质量，以左右耳片质量之差为肿胀程度，计 算各组肿胀度。
结果见表4。与空白对照组比较，低剂量药物组差异无统计学意义，而 高、中剂量药物组差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。提示本发明对二甲 苯致小鼠耳廓肿胀急性炎症有明显的抑制作用。
表45组小鼠二甲苯所致耳廓肿胀情况
3、对2，4-二硝基氯苯诱导的小鼠迟发型超敏反应的影响
取小鼠30只，分组后将各组小鼠腹部脱毛，面积3cm×3cm，脱毛区给 药1次，24h后于每鼠背部皮下注射7％2，4-二硝基氯苯丙酮溶液0.02mL，3 天后重复致敏1次。随后各组每天早晚各涂药1次，连续8天。第9天，以1％ 2，4-二硝基氯苯丙酮溶液0.03mL均匀涂于小鼠右耳，24h后将各组6只小鼠 采用眼球摘除法取血，全血离心后取血清，采用酶联免疫法(ELISA)测定血 清中IL-4的含量。处死小鼠，用打孔器(直径8mm)取下左右耳片，电子天平 称质量，以两耳质量之差为肿胀度，计算各组肿胀度。
结果见表5。与空白对照组比较，高、中、低剂量药物组能改善小鼠右 耳肿胀情况，差异有统计学意义(P<0.05)，本发明提取物对2，4-二硝基氯苯 诱发小鼠过敏性接触性皮炎有一定的治疗和抑制作用；IL-4含量测定结果表 明，本发明高、中剂量能降低血清中IL4水平，且与阳性对照组比较差异无 显著性。
表55组小鼠迟发型变态反应发生情况
本研究证实浮萍草总黄酮提取物具有抗变态反应、消肿、止痒的功效。 对于二甲苯致小鼠耳部肿胀的急性炎症有明显的抑制作用，因而适用于湿 疹皮炎。对盐酸组胺致豚鼠瘙痒有较好的抑制作用，推测其止痒功效可能 与减少过敏性递质的释放有关。
湿疹的发病机制复杂，目前多认为是由于内外激发因子引起的T细胞介 导的一种迟发型超敏反应。本研究结果显示，浮萍草总黄酮提取物在2，4- 二硝基氯苯致小鼠亚急性接触性湿疹模型上，与曲咪新乳膏有类似的抑制 作用，不仅能抑制耳肿胀，还能显著下调IL-4水平，从而抑制Th2的功能， 说明本发明能抑制迟发型变态反应。