一种利用白腐真菌粗酶液降解双酚A的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510669380.2 (22)申请日 2015.10.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105233458 A (43)申请公布日 2016.01.13 (73)专利权人 桂林理工大学 地址 541004 广西壮族自治区桂林市建干 路12号 (72)发明人 刘红艳 张飞 王秀丽 马钰 李柏林 (51)Int.Cl. A62D 3/02(2007.01) C02F 3/34(2006.01) (56)对比文件 CN 101906451 A,2010.06。

2、.28, CN 103964567 A,2014.08.06, CN 101260389 A,2008.09.10, CN 1390161 A,2003.01.08, 审查员 刘田元 (54)发明名称 一种利用白腐真菌粗酶液降解双酚A的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用白腐真菌粗酶液降 解双酚A的方法。 制备白腐真菌粗酶液， 加入酒石 酸缓冲液， 双酚A溶液， 双氧水溶液和藜芦醇， 控 制反应体系的pH值为2 .53， 藜芦醇浓度为 10mmol/L， 温度保持在2050条件下， 反应30 50分钟， 加入1.03.0mL甲醇终止反应， 即实现利 用白腐真菌粗酶液降解双酚A。 本发明方法。

3、采用 的是生物酶催化工艺， 具有去除效率高， 方便， 安 全无污染等突出特点； 通过添加介体物质， 能提 高生物酶催化的反应效率， 减少反应时间， 从而 降低酶的使用量， 降低了运行成本。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 105233458 B 2018.11.06 CN 105233458 B 1.一种利用白腐真菌粗酶液降解双酚A的方法， 其特征在于具体步骤为： (1)制备培养基 向三角瓶内加入10.020.0克的葡萄糖、 1.02.0克吐温80、 2.03.0克磷酸二氢钾、 0.51.0克硫酸镁、 1.02.0克氯化钙、 0.001克维生素B1、 0.52.0克氯化钠、 0.2。

4、1.0克 硫酸锰和1.03.0mL微量元素混合溶液， 定容至0.051.5升， 在1.103MPa、 121条件下灭 菌20分钟， 制得限氮液体培养基备用； (2)白腐真菌粗酶液的制备 按照体积比为1:9量取孢子悬液和步骤(1)制得的限氮液体培养基， 将孢子悬液接种于 限氮液体培养基中， 在2540、 100200转/分钟的条件下置于振荡培养箱中悬浮培养5 7天， 所得培养液在烧杯中缓缓研磨， 破碎后得到的细胞匀浆培养液经冷冻离心机在4、 8000转/分钟的条件下离心515分钟， 取上清液， 然后用无菌的0.45 m滤膜过滤， 过滤后的 滤液置于半透膜中， 室温取流动水透析12小时， 然后分子。

5、量10-kDa超滤浓缩， 得到的透析液 即为白腐真菌粗酶液， 置于4的冰箱中保存， 备用； (3)双酚A的降解 称取1.03.0mL浓度为250mmol/L的酒石酸缓冲液加入准备好的已灭菌的三角烧瓶 中， 然后置于30恒温水浴中， 再加入1.03.0mL步骤(2)制得的白腐真菌粗酶液、 5mL浓度 为0.20mmol/L的双酚A溶液、 0.52.0mL浓度为0.4mmol/L的双氧水和藜芦醇， 控制反应体 系的pH值为4， 反应体系中藜芦醇浓度为10mmol/L， 反应3050分钟， 加入1.03.0mL甲醇 终止反应， 即实现利用白腐真菌粗酶液降解双酚A。 权 利 要 求 书 1/1 页 2。

6、 CN 105233458 B 2 一种利用白腐真菌粗酶液降解双酚A的方法 技术领域 0001 本发明属于环境修复技术领域， 特别涉及一种利用微生物白腐真菌粗酶液降 解双酚A的方法。 背景技术 0002 双酚A(bisphenol A, BPA)， 化学式为C15H16O2， 持久性有机污染物之一， 具有 “三 致” 效应。 联合国环境署将其作为继臭氧层空洞和全球性变暖之后需要亟待治理的第三代 环境问题提上日程。 如何降低这种危害， 通过什么样的方法来降解这类污染物， 或者将其转 化为其它无污染、 危害小的化合物是一个急待解决的科学难题之一。 近年来不断发现的物 理吸附和化学降解法对环境中BP。

7、A 的去除效果良好， 但其弊端也显而易见。 物理吸附方法 不涉及BPA的降解， 作用简单且吸附时间短， 但是由于物理吸附具有可逆性， 去除的BPA 在 某些条件下可能反吸附， BPA又重新回到反应物体系之中， 所以物理吸附方法在一定程度上 是不可靠的， 它并没有达到真正去除的目的。 化学方法降解BPA 表现出相当高的效率， 在催 化条件下甚至可能完全矿化BPA。 但是考虑到BPA 浓度低于其他常见干扰物浓度， 去除至安 全范围成本高， 操作复杂， 另外在处理过程中可能产生二次污染等环境问题。 因此寻求一种 去除效率高、 方便、 安全且无污染的去除方法势在必行。 0003 白腐真菌是一类可以引起。

8、木头腐烂分解的真菌， 也是一种重要的环境污染物降解 真菌。 与其它真菌不同， 白腐真菌对BPA的代谢主要依赖于一系列胞外分泌的木质素降解酶 (木质素过氧化物酶、 锰过氧化物酶和漆酶)的作用(Asgher M， Bhatti HN， Ashraf M and Legge RL. Recent developments in biodegradation of industrial pollutants by white rot fungi and their enzyme system Biodegradation. 2008， 19： 771-783)， 因此 其分泌的粗酶液对双酚A降解可以表。

9、观白腐真菌本身对双酚A的降解。 0004 在传统的分解双酚A的方法中， 高浓度的双酚A运用比较多的是物理吸附方法， 但 吸附存在可逆性， 而双酚A具有低浓度效益， 在远低于其他常见干扰物浓度仍然有危害作 用， 故不能完全吸收较低浓度双酚A， 它并不能达到真正去除危害的目的； 对于去除浓度低 的双酚A常常运用化学方法， 化学方法中， 去除双酚A至安全范围不仅仅需求的化学试剂量 大、 操作步骤比较繁琐， 而且容易在处理过程中可能产生二次污染等环境问题。 0005 基于白腐真菌主要依赖于胞外酶来降解污染物的原理， 提出了一种运用微生 物白腐真菌分解双酚A的新方法。 白腐真菌生长繁殖快、 培养操作较为。

10、简便。 人们在生 活中比较容易获得白腐真菌， 成本比较低廉且绿色安全。 白腐真菌分泌的胞外酶相对含量 较丰富。 酶促反应具有很高催化特效， 绿色安全性而且对底物浓度要求范围广， 可以去除低 浓度物质， 运用白腐真菌分解双酚A可以大大提高分解处理双酚A类物质的效果， 其在催化 去除含双酚A类物质的废水处理技术上具有突出优势， 能达到有效地去除环境污染物修复 环境的目的。 发明内容 说 明 书 1/4 页 3 CN 105233458 B 3 0006 本发明的目的是针对在现有技术对BPA降解过程中存在的可逆性， 工作量大、 成本 高、 步骤繁琐、 准确度低等问题， 提供一种利用白腐真菌粗酶液降解。

11、双酚A的方法。 0007 具体步骤为： 0008 (1)制备培养基 0009 向三角瓶内加入10.020.0克的葡萄糖、 1.02.0克吐温80、 2.03.0克磷酸二氢 钾、 0.51.0克硫酸镁、 1.02.0克氯化钙、 0.001克维生素B1、 0.52.0克氯化钠、 0.21.0克 硫酸锰和1.03.0 mL微量元素混合溶液， 定容至0.051.5升， 在1.103MPa、 121条件下灭 菌20分钟， 制得限氮液体培养基备用。 0010 (2)白腐真菌粗酶液的制备 0011 按照体积比为1:9量取孢子悬液和步骤(1)制得的限氮液体培养基， 将孢子悬液接 种于限氮液体培养基中， 在25。

12、40、 100200 转/分钟的条件下置于振荡培养箱中悬浮培 养57天， 所得培养液在烧杯中缓缓研磨， 破碎后得到的细胞匀浆培养液经冷冻离心机在4 、 8000转/分钟的条件下离心515分钟， 取上清液， 然后用无菌的0.45 m滤膜过滤， 过滤后 的滤液置于半透膜中， 室温取流动水透析12小时， 然后分子量10-kDa超滤浓缩， 得到的透析 液即为白腐真菌粗酶液， 置于4的冰箱中保存， 备用。 0012 (3)双酚A的降解 0013 称取1.03.0 mL浓度为250 mmol/L的酒石酸缓冲液加入准备好的已灭菌的三角 烧瓶中， 然后置于2050恒温水浴中， 再加入1.03.0mL步骤(2)。

13、制得的白腐真菌粗酶液、 5mL浓度为0.20mmol/L的双酚A 溶液、 0.52.0mL浓度为0.30.5mmol/L的双氧水和藜芦醇， 控制反应体系的pH 值为2.53， 反应体系中藜芦醇浓度为10mmol/L， 反应3050分钟， 加入 1.03.0mL甲醇终止反应， 即实现利用白腐真菌粗酶液降解双酚A。 0014 本发明根据现有技术处理双酚A的手段和效果， 白腐真菌依靠胞外酶降解环境污 染物的特点， 设计了一种运用白腐真菌分泌酶对双酚A降解的方法。 在本方法中， 所选取的 处理材料仅为微生物， 生长繁殖快、 方便取用、 成本低廉， 生物酶具有高效催化能力。 此外， 操作较为简便， 而且。

14、成本比较低， 不易造成二次的污染。 附图说明 0015 图1为本发明实施例中白腐真菌粗酶液催化降解双酚A的降解率随温度的变化情 况。 0016 图2为本发明实施例中白腐真菌粗酶液催化降解双酚A的降解率随pH值的变化情 况。 0017 图3为本发明实施例中白腐真菌粗酶液催化降解双酚A的降解率随启动剂双氧水 浓度的变化情况。 0018 图4为本发明实施例中藜芦醇的添加对白腐真菌粗酶液降解双酚A的影响情况。 0019 图5为本发明实施例中白腐真菌粗酶液催化降解双酚A中加藜芦醇和不加藜芦醇 时降解率的对比图。 具体实施方式 0020 为了使本专利实现的技术手段、 创作特征、 达成目的与作用更加清楚及易。

15、于了解， 说 明 书 2/4 页 4 CN 105233458 B 4 下面结合附图和具体实施方式对本专利作进一步阐述， 所列实施例仅在于说明本发明而 不限制本发明。 0021 本实施例中使用的微量元素混合溶液含： 3.0g MgSO47H20， 1.0g NaCl， 0.1g CaCI22H2O， 0.1g FeSO47H2O， 0.1g CoSO4， 0.01g AlK(S04)212H2O， 0.1g ZnSO47H2O， 0.01g CuSO45H2O， 0.01g H3BO3和0.01g Na2MoO42H2O。 0022 (1)制备培养基 0023 向三角瓶内加入10克的葡萄糖、 。

16、1.0克吐温80、 2.56克磷酸二氢钾、 0.71克硫酸镁、 1.56克氯化钙、 0.001克维生素B1、 1.0克氯化钠、 0.5克硫酸锰和2.0 mL微量元素混合溶液， 定容至1.0升， 在1.103MPa、 121条件下灭菌20分钟， 制得限氮液体培养基备用。 0024 (2)白腐真菌粗酶液的制备 0025 按照体积比为1:9量取孢子悬液和步骤(1)制得的限氮液体培养基， 将孢子悬液接 种于限氮液体培养基中， 在37、 150 转/分钟的条件下置于振荡培养箱中悬浮培养6天， 所 得培养液在烧杯中缓缓研磨， 破碎后得到的细胞匀浆培养液经冷冻离心机在4、 8000转/ 分钟的条件下离心10。

17、分钟， 取上清液， 然后用无菌的0.45 m滤膜过滤， 过滤后的滤液置于半 透膜中， 室温取流动水透析12小时， 然后分子量10-kDa超滤浓缩， 得到的透析液即为白腐真 菌粗酶液， 置于4的冰箱中保存， 备用。 0026 采用以下方法测定酶活： 取玻璃试管1 支， 加入藜芦醇溶液、 酒石酸缓冲液、 粗酶 液， 混匀， 加入0.1 mL H2O2反应， 反应开始后每隔15 秒记录一次在310 nm 处的吸光度值， 直至吸光度值维持恒定状态。 每个反应体系做三个平行试验。 1 个酶活单位(U)的定义为每 分钟氧化1 mol 黎芦醇所需的酶量。 采用公式计算酶活： 0027 0028 其中： 93。

18、00 mol-1Lcm-1 为木素过氧化物酶催化藜芦醇形成的产物藜芦醛在 310 nm下的摩尔吸光系数； V为反应液总体积； X为加入的酶液的体积。 0029 (3)双酚A的降解 0030 分别称取2mL浓度为250 mmol/L的酒石酸缓冲液加入准备好的已灭菌的7只编号 的三角烧瓶中， 然后分别置于20， 25， 30， 35， 40， 45和50恒温水浴中， 再分别加入2mL步骤 (2)制得的白腐真菌粗酶液、 5mL浓度为0.20mmol/L的双酚A 溶液、 1.0mL浓度为0.4mmol/L 的双氧水， 控制反应体系的pH 值为3， 反应50分钟， 加入2.0mL甲醇终止反应， 即实现利。

19、用白 腐真菌粗酶液降解双酚A。 0031 再以去离子水代替双氧水， 重复上述步骤， 作为本实施例的对照组。 0032 将本实施例双酚A降解后制得的反应液分别在4500转/分钟的速度下离心15min， 取上清液进行双酚A含量的测定并计算降解率 （计算公式为： 降解率(C-B)100/A； 其 中A为反应体系双酚A初始浓度； B为处理双酚A最终浓度； C为对照中的双酚A最终浓度； 采用 4-安替比林法测定双酚A含量） ， 结果如图1所示， 随着温度的升高降解率先逐渐增加后逐渐 减小。 当反应温度为30时， 降解率达到最大为74.70%。 说 明 书 3/4 页 5 CN 105233458 B 5。

20、 0033 重复本实施例的步骤(1)(3)， 仅仅改变反应体系的pH值=2， 3， 4， 5， 6， 7和8， 将反 应液在4500转/分钟的速度下离心15min， 取上清液进行双酚A含量的测定并计算降解率。 结 果如图2所示， 当pH值为4.0时， 降解率为75.09%。 0034 重复本实施例的步骤(1)(3)， 仅仅改变加入的双氧水溶液的浓度， 分别为0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6和0.7mmol/L， 将反应液在4500转/分钟的速度下离心15min， 取上清 液进行双酚A含量的测定并计算降解率。 得到的具体结果如图3所示， 随着双氧水浓度的增 加降解率先逐渐。

21、增加后减小。 当双氧水浓度为0.4 mmol/L时， 降解率达到最大， 其值为 75.14%。 0035 白腐真菌在分泌过氧化酶的同时， 也分泌另一种化合物藜芦醇(VA)。 该化合物既 是酶的一种天然底物， 同时也是酶的催化剂， 为了进一步提高双酚A的降解率， 实验还考证 了藜芦醇的添加对白腐真菌粗酶液降解双酚A的影响。 0036 实验取2 mL粗酶液， 2 mL酒石酸缓冲液， 1 mL 藜芦醇溶液， 0 .1 mL 双酚A (0.24mmol/L)溶液， 在振荡条件下， 以双氧水启动反应。 本反应体系设计为6组， 分别对应1， 2， 4， 6， 8 和10 mmol/L 的VA溶液， 每个反。

22、应组设立7支试管， 分别对应反应时间0.5， 3， 5， 10， 20， 30和60min。 在特定时间取反应液测定双酚A浓度， 得到的具体结果如图4所示， 从图 中可以看出各组反应30分钟内基本都达到平衡， 随着藜芦醇浓度的增大， 测得的双酚A浓度 越低， 即降解率越高。 当藜芦醇的加入量为10 mmol/L时其降解效果最好， 通过计算得双酚A 的降解率为97.09%， 比不加藜芦醇时的最高降解率75.14%高出21.95%， 即在有藜芦醇存在 的条件下且藜芦醇浓度为10 mmol/L时， 白腐真菌粗酶液基本上可以完全降解双酚A。 0037 该方法操作简单、 成本低廉， 绿色安全， 无污染， 且降解率高， 双酚A的降解率可达 97.09%。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105233458 B 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 1/3 页 7 CN 105233458 B 7 图 3 图 4 说 明 书 附 图 2/3 页 8 CN 105233458 B 8 图 5 说 明 书 附 图 3/3 页 9 CN 105233458 B 9 。