技术领域
本发明涉及农业生产技术领域，具体涉及一种降解植物中农药残留的生物制剂及其制备方法。
背景技术
自1938年瑞士人Muller首次发现了DDT的杀虫作用，并在杀灭马铃薯甲虫上成功运用后，有机氯类农药开始出现在农药发展的进程中。20世纪40年代起，DDT、六六六等有机氯类农药广泛应用于植物的病虫害防治，导致农产品、中草药等农药残留超标以及环境污染，对非靶标生物和人类健康造成了严重威胁。然而，农作物中有机氯农药的污染问题逐渐出现，残留超标，产品价格低，严重制约着我国农作物的出口，严重影响了经济效益。随之，很多农作物普遍有残留检出。
生物修复(Bioremediation)是指利用微生物或其他生物将存在于土壤、地下水和海洋中的有毒、有害污染物降解为二氧化碳和水或转化为无害物质的系统，与物理化学方法相比，生物修复被公认为是一种有效、安全、廉价和无二次污染的方法。我国每年施用的农药量巨大，但农药的利用效率却很低，其中高达80％的农药直接进入了土壤和水环境中。面对日益恶劣的环境，物理、化学和生物修复等农药污染的修复方法渐渐产生，但通过像焚烧、填埋等物理-化学方法处理被认为是昂贵、逻辑上不可行或是对环境不友好的方式。尽管矿化环境异生物质的微生物占总体微生物的比例并不很大，但在农药污染治理方面，微生物因其种类丰富、分布广泛、适应性强和代谢途径多样的特点逐渐显现出自身的优势。对于利用微生物分解或矿化农药残留，是目前国内外治理环境污染尤其是农药污染最有前景的方法。对于像土壤和地下水污染的原位修复，应用生物学的方法是非常具有潜力和竞争力的。土壤中微生物种类及数量极其丰富，且对土壤环境的适生性强，且能完全保持群体稳定性，充分发挥微生物的生物修复功能对污染土壤进行修复，是土壤修复学科研究的热门领域。通常被污染的土壤中存在大量降解微生物，微生物降解已成为污染土壤生物修复的重要技术手段。
目前，获得高效降解微生物的途径主要有两种：首先可以从长期被农药污染的土壤或污水环境中直接进行微生物的分离，从这种土壤环境中分离得到的降解微生物性状稳定且对土壤环境的适应性较强；长期被农药污染的土壤或污水受环境局限，为了尽量缩短微生物对环境的适应时间，提高降解菌的降解效率，也可以采用富集驯化再分离法通过对培养液中五氯硝基苯的浓度逐步增加，进行一段时间驯化后，从土壤中分离农药降解细菌，并用于污染土壤的生物修复处理。但是，上述两种方法所制备的农药降解菌都存在以下问题：降解农药效果差、降解速度慢、不具有广谱性。
发明内容
为了解决现有微生物菌剂存在的降解农药效果差、降解速度慢、不具有广谱性的问题，本发明提供一种降解植物中农药残留的生物制剂及其制备方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种降解植物中农药残留的生物制剂，包括复配比为3:2的植物源药剂混合物与混合菌液；
所述植物源药剂混合物按照重量份数计算包括以下组份：苦楝皮1～5份、苦参1～5份、藜芦草1～5份、芥菜籽1～5份；
所述混合菌液按照重量份数计算包括以下组份：苏云金芽孢杆菌发酵菌液 20～30份、侧孢短芽孢杆菌发酵菌液10～15份、冷解糖芽孢杆菌发酵菌液5～ 10份、蜡质芽孢杆菌发酵菌液5～10份、酵母菌发酵菌液5～10份、枯草芽孢杆菌发酵菌液5～10份、巨大芽孢杆菌发酵菌液5～8份、恶臭假单胞菌发酵菌液30～35份、施氏假单胞菌发酵菌液25～30份。
作为优选的实施方式，所述植物源药剂混合物按照重量份数计算包括以下组份：苦楝皮3份、苦参3份、藜芦草3份、芥菜籽3份。
作为优选的实施方式，所述混合菌液按照重量份数计算包括以下组份：苏云金芽孢杆菌发酵菌液25份、侧孢短芽孢杆菌发酵菌液12份、冷解糖芽孢杆菌发酵菌液7份、蜡质芽孢杆菌发酵菌液7份、酵母菌发酵菌液7份、枯草芽孢杆菌发酵菌液7份、巨大芽孢杆菌发酵菌液6份、恶臭假单胞菌发酵菌液32 份、施氏假单胞菌发酵菌液28份。
本发明的一种降解植物中农药残留的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、植物源药剂混合物的制备
1)对苦楝皮、苦参、藜芦草、芥菜籽分别进行挑选、清洗，然后粉碎至10～ 50目，混合均匀，得混合细粉；
2)将混合细粉加入到反应釜中，然后用pH 4.2～6.3、温度40～75℃的酸性水溶液浸泡1～3h，混合细粉与酸性水溶液的料液比为1g:(3～7)ml；
3)采用亚临界水萃取法，在1～5Mpa、100～150℃条件下对反应釜中的物质进行萃取30～60min，分离反应釜中的物质，得到液体的植物源药剂混合物；
步骤二、混合菌液的制备
1)分别制备苏云金芽孢杆菌种子液、侧孢短芽孢杆菌种子液、冷解糖芽孢杆菌种子液、蜡质芽孢杆菌种子液、酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液、巨大芽孢杆菌种子液、恶臭假单胞菌种子液和施氏假单胞菌种子液；
2)将各菌的种子液接种于培养基中，混合均匀，在200r/min、28℃条件下，振荡培养至形成芽孢和伴孢晶体，并且产生晶孢分离，得到各菌的发酵菌液；
步骤三、复配
将液体的植物源药剂混合物与混合菌液按照复配比为3:2的比例进行复配，混合均匀后得到生物制剂。
作为优选的实施方式，所述酸性水溶液选自醋酸水溶液、亚硫酸水溶液、亚硫酸钠水溶液、亚硝酸水溶液中的一种或多种。
作为优选的实施方式，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，包括以下组份：蛋白胨15g、牛肉膏3.5g、琼脂粉20g、葡萄糖20g、氯化钠5g，pH 7.0～7.2， 120℃灭菌40min。
作为优选的实施方式，所述恶臭假单胞菌种子液和施氏假单胞菌种子液的制备过程如下：
1)培养
取亲本菌株QTH3、CB44斜面分别接一环到装有液体完全培养基的试管中， 34℃振荡培养20h；
2)继续培养
分别取1mL菌液转接入装有20mL液体完全培养基的锥形瓶中，35℃振荡培养3.5h，待细胞生长进入对数前期时加入25u/mL青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2h；
3)收集细胞
分别取菌液10mL，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，洗涤两次，将菌体悬浮于10mLSMM培养基中，每1mL菌液中含有108～109活菌。
作为优选的实施方式，所述液体完全培养基，按照重量比包括以下组份：葡萄糖1％、蛋白胨1％、酵母膏0.6％、磷酸氢钾0.2％、硫酸亚铁0.002％、硫酸锌0.005％和硫酸镁0.003％。
作为优选的实施方式，步骤一的2)中，用pH 5.0、温度55℃的酸性水溶液浸泡2h。
作为优选的实施方式，步骤一的2)中，混合细粉与酸性水溶液的料液比为 1g:5ml。
作为优选的实施方式，步骤一的3)中，在3Mpa、125℃条件下对反应釜中的物质进行萃取45min。
本发明的有益效果是：
1、应用本发明的生物制剂可以从根本上解决目前农业生产中土壤中残留的六六六、DDT、菊酯类等农药，对农药实现有效降解，改良土壤，降低农作物的药物残留。
2、本发明利用苦楝皮、苦参、藜芦草、芥菜籽的天然提取物制备成植物源药剂混合物，再与微生物混合菌液进行复配，以形成用于蔬菜防病、促生功能的植物型或微生物类的生物制剂，作为冲施或者叶面肥料在蔬菜种植中使用，防效效果好、促长明显、安全环保，对降低化学肥药用量、提高农产品品质具有很好的促进作用。
3、本发明的优势在于对农药的降解率能随着时间的增加而逐渐升高，通过使用菌株QTH3恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和CB44施氏假单孢菌(Pseudomonas stutzeri)，提高了对农药的降解率，对农药的降解率可达80％以上，降解效果显著。
4、本发明制备的生物制剂具有高效、安全的特点，同时能够提高农作物抗逆性，被农作物吸收后可显著提高农作物的抗药害能力，加快生长发育。
5、本发明具有制备成本低，生产效率高的优点，有利于将来大面积推广使用。
具体实施方式
本发明的一种降解植物中农药残留的生物制剂，具体包括复配比为3:2的植物源药剂混合物与混合菌液；
所述植物源药剂混合物按照重量份数计算包括以下组份：苦楝皮1～5份、苦参1～5份、藜芦草1～5份、芥菜籽1～5份；
所述混合菌液按照重量份数计算包括以下组份：苏云金芽孢杆菌发酵菌液 20～30份、侧孢短芽孢杆菌发酵菌液10～15份、冷解糖芽孢杆菌发酵菌液5～ 10份、蜡质芽孢杆菌发酵菌液5～10份、酵母菌发酵菌液5～10份、枯草芽孢杆菌发酵菌液5～10份、巨大芽孢杆菌发酵菌液5～8份、恶臭假单胞菌发酵菌液(QTH3)30～35份、施氏假单胞菌发酵菌液(CB44)25～30份。
本发明的一种降解植物中农药残留的生物制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤一、植物源药剂混合物的制备
1)对苦楝皮、苦参、藜芦草、芥菜籽分别进行挑选、清洗，然后粉碎至10～ 50目，混合均匀，得混合细粉；
2)将混合细粉加入到反应釜中，然后用pH 4.2～6.3、温度40～75℃的酸性水溶液浸泡1～3h，混合细粉与酸性水溶液的料液比为1g:(3～7)ml；
3)采用亚临界水萃取法，在1～5Mpa、100～150℃条件下对反应釜中的物质进行萃取30～60min，分离反应釜中的物质，得到液体的植物源药剂混合物；
步骤二、混合菌液的制备
1)分别制备苏云金芽孢杆菌种子液、侧孢短芽孢杆菌种子液、冷解糖芽孢杆菌种子液、蜡质芽孢杆菌种子液、酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液、巨大芽孢杆菌种子液、恶臭假单胞菌种子液和施氏假单胞菌种子液；
2)将各菌的种子液接种于培养基中，混合均匀，在200r/min、28℃条件下，振荡培养至形成芽孢和伴孢晶体，并且产生晶孢分离，得到各菌的发酵菌液；
步骤三、复配
将液体的植物源药剂混合物与混合菌液按照复配比为3:2的比例进行复配，混合均匀后得到生物制剂。
其中的酸性水溶液选自醋酸水溶液、亚硫酸水溶液、亚硫酸钠水溶液、亚硝酸水溶液中的一种或多种。
其中的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，包括以下组份：蛋白胨15g、牛肉膏 3.5g、琼脂粉20g、葡萄糖20g、氯化钠5g，pH 7.0～7.2，120℃灭菌40min。
其中的恶臭假单胞菌种子液和施氏假单胞菌种子液的制备过程如下：
1)培养
取亲本菌株QTH3(恶臭假单胞菌)、CB44(施氏假单胞菌)斜面分别接一环到装有液体完全培养基的试管中，34℃振荡培养20h；
2)继续培养
分别取1mL菌液转接入装有20mL液体完全培养基的锥形瓶中，35℃振荡培养3.5h，待细胞生长进入对数前期时加入25u/mL青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2h；
3)收集细胞
分别取菌液10mL，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，洗涤两次，将菌体悬浮于10mLSMM培养基中，每1mL菌液中含有108～109活菌。
其中液体完全培养基，按照重量比包括以下组份：葡萄糖1％、蛋白胨1％、酵母膏0.6％、磷酸氢钾0.2％、硫酸亚铁0.002％、硫酸锌0.005％和硫酸镁0.003％。
以下结合对本发明作进一步详细说明。
实施例1降解植物中农药残留的生物制剂的制备
1)对苦楝皮3kg、苦参3kg、藜芦草3kg、芥菜籽3kg分别进行挑选、清洗，然后粉碎至30目，混合均匀，得混合细粉；
2)取100g混合细粉加入到反应釜中，然后用pH5.0、温度55℃的酸性水溶液500ml浸泡2h；
3)采用亚临界水萃取法，在3Mpa、125℃条件下对反应釜中的物质进行萃取45min，分离反应釜中的物质，得到液体的植物源药剂混合物；
4)分别制备苏云金芽孢杆菌种子液、侧孢短芽孢杆菌种子液、冷解糖芽孢杆菌种子液、蜡质芽孢杆菌种子液、酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液、巨大芽孢杆菌种子液、恶臭假单胞菌种子液和施氏假单胞菌种子液；
5)将苏云金芽孢杆菌发酵菌液25g、侧孢短芽孢杆菌发酵菌液12g、冷解糖芽孢杆菌发酵菌液7g、蜡质芽孢杆菌发酵菌液7g、酵母菌发酵菌液7g、枯草芽孢杆菌发酵菌液7g、巨大芽孢杆菌发酵菌液6g、恶臭假单胞菌发酵菌液32g、施氏假单胞菌发酵菌液28g接种于培养基中，混合均匀，在200r/min、28℃条件下，振荡培养至形成芽孢和伴孢晶体，并且产生晶孢分离，得到各菌的发酵菌液；
6)将液体的植物源药剂混合物与混合菌液按照复配比为3:2的比例进行复配，混合均匀后得到生物制剂。
实施例2降解植物中农药残留的生物制剂的制备
1)对苦楝皮1kg、苦参1kg、藜芦草5kg、芥菜籽5kg分别进行挑选、清洗，然后粉碎至50目，混合均匀，得混合细粉；
2)取100g混合细粉加入到反应釜中，然后用pH6.3、温度75℃的酸性水溶液300ml浸泡3h；
3)采用亚临界水萃取法，在1Mpa、150℃条件下对反应釜中的物质进行萃取60min，分离反应釜中的物质，得到液体的植物源药剂混合物；
4)分别制备苏云金芽孢杆菌种子液、侧孢短芽孢杆菌种子液、冷解糖芽孢杆菌种子液、蜡质芽孢杆菌种子液、酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液、巨大芽孢杆菌种子液、恶臭假单胞菌种子液和施氏假单胞菌种子液；
5)将苏云金芽孢杆菌发酵菌液30g、侧孢短芽孢杆菌发酵菌液15g、冷解糖芽孢杆菌发酵菌液5g、蜡质芽孢杆菌发酵菌液10g、酵母菌发酵菌液5g、枯草芽孢杆菌发酵菌液5g、巨大芽孢杆菌发酵菌液8g、恶臭假单胞菌发酵菌液30g、施氏假单胞菌发酵菌液30g接种于培养基中，混合均匀，在200r/min、28℃条件下，振荡培养至形成芽孢和伴孢晶体，并且产生晶孢分离，得到各菌的发酵菌液；
6)将液体的植物源药剂混合物与混合菌液按照复配比为3:2的比例进行复配，混合均匀后得到生物制剂。
实施例3降解植物中农药残留的生物制剂的制备
1)对苦楝皮5kg、苦参5kg、藜芦草1kg、芥菜籽1kg分别进行挑选、清洗，然后粉碎至10目，混合均匀，得混合细粉；
2)取100g混合细粉加入到反应釜中，然后用pH 4.2、温度40℃的酸性水溶液700ml浸泡1h；
3)采用亚临界水萃取法，在5Mpa、100℃条件下对反应釜中的物质进行萃取30min，分离反应釜中的物质，得到液体的植物源药剂混合物；
4)分别制备苏云金芽孢杆菌种子液、侧孢短芽孢杆菌种子液、冷解糖芽孢杆菌种子液、蜡质芽孢杆菌种子液、酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液、巨大芽孢杆菌种子液、恶臭假单胞菌种子液和施氏假单胞菌种子液；
5)将苏云金芽孢杆菌发酵菌液20g、侧孢短芽孢杆菌发酵菌液10g、冷解糖芽孢杆菌发酵菌液10g、蜡质芽孢杆菌发酵菌液5g、酵母菌发酵菌液10g、枯草芽孢杆菌发酵菌液10g、巨大芽孢杆菌发酵菌液5g、恶臭假单胞菌发酵菌液 35g、施氏假单胞菌发酵菌液25g接种于培养基中，混合均匀，在200r/min、28℃条件下，振荡培养至形成芽孢和伴孢晶体，并且产生晶孢分离，得到各菌的发酵菌液；
6)将液体的植物源药剂混合物与混合菌液按照复配比为3:2的比例进行复配，混合均匀后得到生物制剂。
试验例1
1、试验对象：棉花，选取120株4叶期棉花苗。
2、试验分组：将120株4叶期棉花苗平均分成3组，分别为A组、B组、 C组，每组40株。
3、试验方法：下午5点后，在A组和C组的棉花苗叶片表面喷洒本发明实施例1所制备的生物制剂，B组的棉花苗叶片表面喷洒浓度为3％的DDT溶液，喷洒量为3ml/叶。按照上述方法每隔3天分别喷洒对应的农药，A组和B组均喷洒浓度为3％的DDT溶液，C组喷洒本发明实施例1所制备的生物制剂，3 天后，A组和B组均喷洒浓度为3％的DDT溶液，C组喷洒本发明实施例1所制备的生物制剂。每组共喷洒三次，即A组第一次喷洒本发明实施例1所制备的生物制剂，第二次和第三次均喷洒浓度为3％的DDT溶液，B组三次均喷洒喷洒浓度为3％的DDT溶液，C组三次均喷洒本发明实施例1所制备的生物制剂。采用现有农药残留量测定方法检测并记录每次的农药残留量，然后计算出3 次农药残留量平均值。
4、试验结果表明：
A组的农药残留量为15.23％，B组的农药残留量为75.45％，C组的农药残留量为10％。A组的农药残留量低于B组，A组的农药残留量高于C组，由此可知，A组在喷施完本发明的生物制剂后再喷洒DDT溶液，本发明的生物制剂对DDT溶液起到了降解作用，所以A组的农药残留量才低于B组，而C组的农药残留量最低，C组全面采用本发明的生物制剂，其农药残留量较低。本发明对农药的降解率高，对农药的降解率可达80％，降解效果显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。