技术领域
本发明属于中医药领域，具体涉及一种能够保肝利胆中药组合物及其制备与应用。
背景技术
胆汁淤积临床上常表现为黄疸伴有血清胆红素、胆盐、碱性磷酸酶等水平的升高，组织学上常表现为胆汁成分在肝内聚集。胆汁淤积通常引起相关肝实质细胞的变化，尤其是胆汁酸去垢作用可引起肝细胞羽毛状变性。
胆汁分泌是肝脏最重要功能之一，其中胆红素和胆汁酸是胆汁主要成分，二者代谢状态可反映肝脏对有机阴离子转运能力。T-Bil增高伴D-Bil明显升高提示存在胆汁淤积性黄疸。发生胆汁淤积时，胆汁分泌下降，并迅速改变胆汁酸储存量的分布，使得血清和尿液中的胆汁酸浓度显著升高。多种器官含有ALT和AST，肝脏ALT含量为最高，大多数存在于细胞质中；而肝脏AST含量仅次于心脏，主要存在于肝细胞线粒体。这两种酶在胆汁淤积时一般不升高，仅当淤积引起肝细胞坏死或通透性改变时，ALT和AST进入血液，使血液中酶活性增加。ALP是一组碱性环境水解磷酸单酯化合物的酶，血清ALP主要来自肝脏和骨骼。胆汁淤积、肝细胞损伤和肝脏占位等病理条件使毛细胆管压力升高时，可诱发ALP产生增多，血清ALP活性增高。血清ALP升高是胆汁淤积最具有特征性的早期表现。
研究开发对于胆汁淤积具有良好治疗效果的药物，具有非常重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够保肝利胆中药组合物及其制备与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种中药组合物，其药效成分原料包括：虎杖、青皮、山楂和大黄。
一种实施方式中，所述中药组合物的药效成分原料由虎杖、青皮、山楂和大黄组成。
一种实施方式中，虎杖、青皮、山楂和大黄之间的重量份数比例范围是：虎杖1-30份、青皮1-12份、山楂1-30份和大黄0.1-10份。
一种实施方式中，虎杖为1-15重量份。
一种实施方式中，虎杖为15-30重量份。
一种实施方式中，虎杖为15重量份。
一种实施方式中，青皮为1-6重量份。
一种实施方式中，青皮为6-12重量份。
一种实施方式中，青皮为6重量份。
一种实施方式中，山楂为1-15重量份。
一种实施方式中，山楂为15-30重量份。
一种实施方式中，山楂为15重量份。
一种实施方式中，大黄为0.1-1重量份。
一种实施方式中，大黄为1-10重量份。
一种实施方式中，大黄为1重量份。
一种实施方式中，虎杖、青皮、山楂和大黄之间的重量份数比例范围是：虎杖15份、青皮6份、山楂15份和大黄1份。
进一步地，本发明的第二方面，提供了一种中药提取物，为以上述中药组合物为原料提取有效成分制得。
本发明中，中药组合物中各原料及其配方最为关键，在获知中药配方后，本技术领域的技术人员可采用各种常规的中药有效成分提取方法来提取其有效成分，如常规的煎煮、醇提法、水提醇沉法、醇提水沉法、盐析法等，由于上述提取方法均能获得前述中药配方中的主要药效成分，因此均能对胆汁淤积具有一定的防治疗效。
其中，水提醇沉法为：先以水为溶剂提取药材有效成分，再用不同浓度的乙醇沉淀去除提取液中杂质的方法。一般含乙醇量达到50～60％(重量体积比即g/100mL)时，可去除淀粉等杂质，当含醇量达70％以上，除鞣质、水溶性色素等少数无效成分外，其余大部分杂质均可沉淀去除。
醇提水沉法为：先以适宜浓度的乙醇提取药材成分，再用水除去提取液中杂质的方法。
所述中药组合物提取有效成分后可再经常规的步骤浓缩、纯化或干燥获得中药提取物。其中浓缩的方法包括但不限于：常压蒸发、减压蒸发、薄膜蒸发、多效蒸发，纯化的方法包括但不限于：盐析纯化、大孔树脂吸附纯化、乙醇沉淀纯化、离子交换树脂纯化、絮凝沉淀纯化、膜分离纯化、聚酰胺吸附纯化、硅胶吸附层析纯化等，干燥的方法包括但不限于：烘干法、鼓式干燥法、带式干燥法、吸湿干燥法、沸腾干燥法、喷雾干燥法、减压干燥法、冷冻干燥法、红外线干燥法、微波干燥法等。
一种实施方式中，所述提取采用乙醇提取法。例如，可采用60％～80％乙醇(重量体积比即g/100mL)提取。
一种实施方式中，所述提取采用水提取法。
本发明的第三方面，提供前述中药提取物的制备方法，包括如下步骤：取前述中药组合物为原料提取有效成分。
一种实施方式中，所述制备方法包括步骤：按配比取虎杖、青皮和山楂，用乙醇提取，提取液浓缩、干燥，得干浸膏后加入大黄粉，混匀，即可。
一种实施方式中，所述乙醇选自60％～80％乙醇。优选，70％乙醇。
所述大黄粉由大黄粉碎获得。
一种实施方式中，所述制备方法包括步骤：按配比取虎杖、青皮、山楂和大黄，用乙醇提取，提取液浓缩、干燥，得干浸膏。
一种实施方式中，所述乙醇选自60％～80％乙醇。优选，70％乙醇。
一种实施方式中，所述制备方法包括步骤：按配比取虎杖、青皮、山楂和大黄，用水提取，过滤，浓缩，干燥。
本发明的第四方面，提供前述中药组合物或中药提取物用于制备肝损伤预防和/或治疗药物的用途。
本发明的第五方面，提供前述中药组合物或中药提取物用于制备胆汁淤积预防和/或治疗药物的用途。
一种实施方式中，前述中药组合物或中药提取物可预防和/或治疗肝内胆汁淤积。
一种实施方式中，前述中药组合物或中药提取物可预防和/或治疗急性肝内胆汁淤积。
本发明的第六方面，提供前述中药组合物或中药提取物用于制备ALT降低剂的用途。
一种实施方式中，前述中药组合物或中药提取物可用于降低血清中ALT水平。
本发明的第七方面，提供前述中药组合物或中药提取物用于制备AST降低剂的用途。
一种实施方式中，前述中药组合物或中药提取物可用于降低血清中AST水平。
本发明的第八方面，提供前述中药组合物或中药提取物用于制备ALP降低剂的用途。
一种实施方式中，前述中药组合物或中药提取物可用于降低血清中ALP水平。
本发明的第九方面，提供前述中药组合物或中药提取物用于制备T-Bil降低剂的用途。
一种实施方式中，前述中药组合物或中药提取物可用于降低T-Bil水平。
本发明的第十方面，提供前述中药组合物或中药提取物用于制备D-Bil降低剂的用途。
一种实施方式中，前述中药组合物或中药提取物可用于降低D-Bil水平。
本发明的第十一方面，提供前述中药组合物或中药提取物用于制备TBA降低剂的用途。
一种实施方式中，前述中药组合物或中药提取物可用于降低TBA水平。
本发明的第十二方面，提供前述中药组合物或中药提取物用于制备具有如下之任一功效的药物的用途：(1)减少肝细胞坏死；(2)改善肝细胞肿大、胞质疏松、呈气球样变及羽毛样变的情况；(3)减轻炎性细胞浸润。
本发明的第十三方面，提供一种中药制剂，包括治疗有效量的前述中药提取物。
所述中药制剂好包括一种或多种常规的药学上可接受的辅料。
药学上可接受的辅料包括(但并不限于)：药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羚基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。诸如颗粒剂和膏剂之类的中药制剂，可通过常规方法进行制备。本发明的药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。
优选地，所述的中药制剂为口服制剂，包括但不限于颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、糖浆剂、喷雾剂等。
在提取出中药组合物中的有效成分后，可采用常规的药用辅料及添加剂制备前述药物组合物。
本发明的药物组合物的有效治疗剂量为，以原料药材的总重量计，口服安全有效量通常为1.00-2.65g/kg体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所提供的中药组合物及中药提取物，能够显著降低血清ALT、AST、ALP、T-Bil、D-Bil和TBA，明显减少肝细胞坏死，改善肝细胞肿大、胞质疏松、呈气球样变及羽毛样变的情况，减轻炎性细胞浸润，进而预防或治疗胆汁淤积。
附图说明
图1：提取物A、提取物B、提取物C以及UDCA对ANIT所致胆汁淤积小鼠血清ALT、AST、ALP、T-Bil、D-Bil及TBA的影响；与Vehicle组比较，*P＜0.05；与ANIT模型组比较，#P＜0.05。
图2：各组肝脏病理切片分析(H&E，×400)，A：正常对照组；B：ANIT模型组；C：提取物A药物保护组；D：提取物B药物保护组；E：提取物C药物保护组；F：阳性药UDCA保护组。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规技术。
实施例1
一、实验材料
1.1、药品
α-萘异硫氰酸酯(α-naphthyl isothiocyanate，ANIT；Sigma,MO,USA)；熊去氧胆酸(UDCA；TCI Japan,Japan)；大黄粉(由大黄粉碎获得，其中95％药粉通过100目筛，余粉必须通过80目筛)、大黄、虎杖、青皮、山楂由上海和黄药业有限公司提供。
1.2、试剂
ALT试剂盒，AST试剂盒，ALP试剂盒，T-Bil试剂盒，D-Bil试剂盒，TBA试剂盒(南京建成，上海，中国)；橄榄油(国药集团，上海，中国)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na；国药集团，上海，中国)；生理盐水、中性组织固定液。
1.3、主要仪器
全自动生化分析仪；光学显微镜；Thermo Scientific Varioskan Flash全波长扫描多功能读数仪(ThermoFisher Scientific,Germany)；Eppendorf 5424R低温高速离心机(Eppendorf,Germany)；SANYO制冰机(SANYO Electric Co.,Ltd.,Japan)；Millipore纯水仪(Millipore,Bedford,MA,USA)。
1.4、实验动物：C57BL/6小鼠，体重(20±2)g，雄性，清洁级，60只，购于上海斯莱克动物实验有限责任公司。动物饲养于温度(22±1)℃，相对湿度(65±10)％，12h小时昼夜更替的动物室内，实验前适应性喂养3d。
二、实验方法
2.1药物配制
ANIT：取适量粉末，用橄榄油溶解配制成10mg/mL，超声至粉末完全溶解。
UDCA：用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解至9mg/mL，灌胃前充分混匀。
提取物A：取虎杖360g、青皮144g和山楂360g，使用70％乙醇提取，提取液减压回收溶剂至稠膏，置100℃、-0.1MPa下干燥5h，放凉，得干浸膏后加入大黄粉24g，混匀，作为提取物A。
提取物B：取大黄24g、虎杖360g、青皮144g和山楂360g，使用70％乙醇提取，提取液减压回收溶剂至稠膏，置100℃、-0.1MPa下干燥5h，放凉，得干浸膏，作为提取物B。
提取物C：取大黄24g、虎杖360g、青皮144g和山楂360g，使用水煎煮提取，提取液经减压回收溶剂至稠膏，置100℃、-0.1MPa下干燥5h，放凉，得干浸膏，作为提取物C。
2.2动物实验方法
C57BL/6小鼠60只，随机分为正常对照组，ANIT模型组，三种提取物药物保护组，和阳性药UDCA对照组，每组10只。所有药物均用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解至所需浓度。正常对照组与模型组给予相应的CMC-Na溶液。其余各组小鼠每日同一试剂按10mL/kg剂量灌胃(i.g.)给药，qd，连续5天。具体地，每次，提取物A药物保护组的给药剂量为2.69g/kg、提取物B药物保护组的给药剂量为2.34g/kg、提取物C药物保护组的给药剂量为2.13g/kg、阳性药UDCA对照组的给药剂量为0.09g/kg。第5次给药12h后，除正常对照组灌胃给予橄榄油10mL/kg外，其余各组小鼠按照10mL/kg剂量灌胃给予ANIT橄榄油溶液造模。造模12h，36h后继续给药两次。实验结束前12h，动物禁食不禁水。
所有动物在给予ANIT后48h(即末次给药12h后)，经乙醚麻醉后，摘眼球取血，供血清生化指标测定。切取相同部位(肝左叶)肝组织进行病理学检查，用10％中性福尔马林固定备用。
2.3血清生化指标测定
小鼠经乙醚麻醉后摘眼球取血，全血室温静置3h，3500rpm/min，离心15min，取上层血清，全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)血清碱性磷酸酶(ALP)活力，血清总胆红素(T-Bil)、直接胆红素(D-Bil)含量。按试剂盒所述方法测定并计算总胆汁酸(TBA)含量。
2.4、肝组织病理观察
组织固定后进行组织修剪，石蜡包埋，切成4μm薄片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木精-伊红染色(H&E染色)，乙醇脱水，二甲苯透化，树脂封固，在光学显微镜下观察。
2.5、统计分析
实验数据计量资料以均数±标准差()表示,两均数的比较用统计软件中one-way ANOVA分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
三、实验结果
3.1、对ANIT所致小鼠胆汁淤积保护作用的血清生化指标评价
如表1，表2以及图1所示，ANIT模型组小鼠6项血清学指标较空白组小鼠显著升高(P＜0.05)，表明造模成功。与ANIT模型组比较，提取物A连续给药后能显著降低ANIT造成的血清各项指标升高情况，差异具有统计学意义(P＜0.05)，其中小鼠血清AST和ALP与正常对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。提取物B能够显著降低小鼠血清中ALT、AST、T-Bil以及D-Bil水平(P＜0.05)，提取物C仅能显著降低ALT和AST水平(P＜0.05)。阳性对照药UDCA能够显著降低除AST以外其它5项血清学指标(P＜0.05)。以上结果表明，提取物A对ANIT所致胆汁淤积小鼠的肝损伤具有保护作用，且从降低ALT和AST指标的程度上优于UDCA。
表1提取物A、提取物B、提取物C以及UDCA对ANIT所致胆汁淤积小鼠血清ALT、AST及ALP的影响
注：与Vehicle组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05
表2提取物A、提取物B、提取物C以及UDCA对ANIT所致胆汁淤积小鼠血清T-Bil、D-Bil及TBA的影响
注：与Vehicle组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05
3.2、对ANIT所致小鼠胆汁淤积保护作用的肝脏病理分析
如图2所示，光镜下观察可见，正常对照组中肝细胞形态正常，排列紧密，未见肝实质细胞病变，肝小叶结构完整，肝细胞索由终末小静脉向四周呈放射状排列，汇管区无明显炎症细胞浸润和纤维组织增生等改变，毛细胆管无淤胆。ANIT模型组，肝细胞肿大，胞质疏松，有的呈气球样变或羽毛样变，可见灶状坏死，肝小叶轮廓不清，汇管区有大量炎性细胞浸润，毛细胆管结构破坏或丢失。提取物A保护组，与模型组相比肝细胞坏死减少，肝细胞肿大，胞质疏松，呈气球样变及羽毛样变的情况改善，炎性细胞浸润减轻，偶见结构正常的毛细胆管。提取物B保护组，肝细胞坏死减少，肝细胞肿大，胞质疏松，呈气球样变及羽毛样变的情况改善，炎性细胞浸润减轻。提取物C保护组，肝细胞肿大，胞质疏松，气球样变及羽毛样变情况没有显著改善，可见灶状坏死面积减小，炎性细胞浸润减轻。经UDCA给药保护后，肝细胞坏死减少，肝细胞肿大，胞质疏松，呈气球样变及羽毛样变的情况改善，汇管区炎性细胞浸润减轻。
四、讨论
ANIT诱发小鼠肝内胆汁淤积，也可引起肝细胞损伤，其对动物肝毒性的治病基质在病理生理学上的表现很像人类的药物性肝炎，被广泛应用于复制肝内胆汁淤积模型。ANIT的致毒与其代谢产物有关，在肝P450酶作用下，ANIT结构中的硫氧化代为为毒性产物攻击肝内胆管内皮细胞，导致高胆红素血症和胆汁分泌降低的出现。同时还引起膜脂质过氧化反应，致使肝细胞变性坏死，造成急性肝内胆汁淤积。
本发明的研究中，利用ANIT所致小鼠肝内胆汁淤积模型评价不同提取制备方式的大黄、虎杖、青皮和山楂复方保肝利胆的药效。实验结果表明，提取物A，能够显著降低ANIT所致小鼠血清ALT、AST、ALP、T-Bil、D-Bil和TBA升高。与阳性药UDCA相比，提取物A能更有效地降低ALT和AST两项血清学指标。肝脏病理切片显示，提取物A保护组，与模型组相比肝细胞坏死明显减少，肝细胞肿大，胞质疏松，呈气球样变及羽毛样变的情况改善，炎性细胞浸润减轻。
综上所述，提取物A对ANIT所致胆汁淤积模型小鼠的肝有良好保护作用。
此外，还参照提取物A的制备方法，分别制备了：
提取物M-1：取虎杖24g、青皮144g和山楂360g，使用60％乙醇提取，提取液减压回收溶剂至稠膏，置100℃、-0.1MPa下干燥5h，放凉，得干浸膏后加入大黄粉24g，混匀，作为提取物M-1。
提取物M-2：取虎杖720g、青皮144g和山楂360g，使用80％乙醇提取，提取液减压回收溶剂至稠膏，置100℃、-0.1MPa下干燥5h，放凉，得干浸膏后加入大黄粉24g，混匀，作为提取物M-2。
提取物M-3：取虎杖360g、青皮24g和山楂360g，使用60％乙醇提取，提取液减压回收溶剂至稠膏，置100℃、-0.1MPa下干燥5h，放凉，得干浸膏后加入大黄粉24g，混匀，作为提取物M-3。
提取物M-4：取虎杖360g、青皮288g和山楂360g，使用80％乙醇提取，提取液减压回收溶剂至稠膏，置100℃、-0.1MPa下干燥5h，放凉，得干浸膏后加入大黄粉24g，混匀，作为提取物M-4。
提取物M-5：取虎杖360g、青皮144g和山楂24g，使用60％乙醇提取，提取液减压回收溶剂至稠膏，置100℃、-0.1MPa下干燥5h，放凉，得干浸膏后加入大黄粉24g，混匀，作为提取物M-5。
提取物M-6：取虎杖360g、青皮144g和山楂720g，使用80％乙醇提取，提取液减压回收溶剂至稠膏，置100℃、-0.1MPa下干燥5h，放凉，得干浸膏后加入大黄粉24g，混匀，作为提取物M-6。
提取物M-7：取虎杖360g、青皮144g和山楂360g，使用60％乙醇提取，提取液减压回收溶剂至稠膏，置100℃、-0.1MPa下干燥5h，放凉，得干浸膏后加入大黄粉2.4g，混匀，作为提取物M-7。
提取物M-8：取虎杖360g、青皮144g和山楂360g，使用80％乙醇提取，提取液减压回收溶剂至稠膏，置100℃、-0.1MPa下干燥5h，放凉，得干浸膏后加入大黄粉240g，混匀，作为提取物M-8。
并参照第二部分2.2的动物实验方法，设置提取物M-1保护组，给药剂量为2.69g/kg；提取物M-2保护组，给药剂量为2.69g/kg；提取物M-3保护组，给药剂量为2.69g/kg；提取物M-4保护组，给药剂量为2.69g/kg；提取物M-5保护组，给药剂量为2.69g/kg；提取物M-6保护组，给药剂量为2.69g/kg；提取物M-7保护组，给药剂量为2.69g/kg；提取物M-8保护组，给药剂量为2.69g/kg，其他操作同第二部分2.2的动物实验方法。
结果发现：提取物M-1保护组、提取物M-2保护组、提取物M-3保护组、提取物M-4保护组、提取物M-5保护组、提取物M-6保护组、提取物M-7保护组、提取物M-8保护组均能显著降低ANIT造成的血清各项指标升高情况，差异具有统计学意义(P＜0.05)，其中小鼠血清AST和ALP与正常对照组相比无显著性差异(P＞0.05)，但是还是提取物A保护组的效果最好。肝脏病理切片显示，提取物M-1保护组、提取物M-2保护组、提取物M-3保护组、提取物M-4保护组、提取物M-5保护组、提取物M-6保护组、提取物M-7保护组、提取物M-8保护组，与模型组相比肝细胞坏死减少，肝细胞肿大，胞质疏松，呈气球样变及羽毛样变的情况改善，炎性细胞浸润减轻，偶见结构正常的毛细胆管，但是还是提取物A保护组的效果最好。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。