技术领域
本发明属于植物诱变育种领域，具体为一种诱导大豆产生变异的诱变方法及其应用。
背景技术
间套作大豆种植模式对于提高我国大豆产量，促进农业可持续发展具有重要的意义。。然而，由于是与高秆作物间套作种植，高秆作物形成的荫蔽环境使大豆的光合产物积累不足，易倒伏。因此，避荫倒伏成为制约间、套作大豆产量的重要因子之一。目前，适合间、套作种植的大豆品种十分缺乏，这在一定程度上阻碍南方大豆的发展。另一方面，野生大豆原产于中国，相比栽培大豆，其基因资源更丰富，具有高蛋白、多花荚、多节、多分枝、抗逆性强等优异性状,而栽培大豆在人工驯化过程中有很多基因已经丢失，栽培大豆的蛋白质含量普遍低于野生大豆。目前，以栽培大豆为材料构建的突变体库较多，但以野生大豆为材料进行突变体库构建还未见报道。在当前种质资源极为匮乏，基因资源日益枯竭的状况下，通过采用EMS诱变处理诱使野生型大豆作物产生更多的性状变异，以构建突变体库，筛选大豆耐荫突变体，是当前间套作大豆研究中亟需解决的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种诱导植物产生变异的诱变方法及其应用，通过诱导大豆发生基因变异，使其性状发生改变，构建大豆突变体库，并从中筛选耐荫突变体，最终使该类突变体应用于植物避荫反应中，可以降低间套作中低杆作物荫蔽反应的敏感性，从而提高间套作低杆作物的产量。
解决以上技术问题的本发明中的一种诱导植物产生变异的诱变方法及其应用，其特征在于：通过化学诱变剂诱导植物遗传基因发生变异，所述化学诱变剂为甲基磺酸乙酯 (EMS)，其分子式CH3SO2OC2H5，其结构式为
化学诱变剂为EMS，即一种烷化剂，其分子式CH3SO2OC2H5，无色液体，分子量为124，能与乙醇混溶，水中溶解度为8％。
所述植物为大豆。
所述植物为野生型大豆。
所述甲基磺酸乙酯诱导时所用剂量和浓度为使诱变大豆种子萌发达到或接近半致死率时的浓度和剂量；优化方案中为由萌发的大豆种子的半致死率确定。
所述化学诱变剂诱变处理，包括以下步骤：
(1)配制磷酸盐缓冲液：按Na2HPO4·12H2O：NaH2PO4为3.5-4.2：1的用量比例取原料，用水稀释，pH6.8-7.2，优化方案pH7.0；
(2)浸种：用磷酸盐缓冲液浸种5-7h，冲洗干净后将种子放入瓶中；磷酸盐缓冲液主要是起维持pH稳定的作用。
(3)配制化学诱变剂溶液：化学诱变剂溶于酒精，加入磷酸盐缓冲液，搅拌混匀，即得，化学诱变剂溶液浓度为0.8％-1.2％，优化方案中为0.8％；
(4)将配制好的化学诱变剂溶液倒入瓶、封口，浸种22-26h，期间进行缓慢摇动；优化方案中浸种时间为24h；不同浓度的EMS处理时间不同，其萌发率也会不一样；另一方面，EMS具挥发性、剧毒的特性，又要避免EMS在试验过程中扩散或对人体造成伤害，避免 EMS造成污染事故等。
(5)流水冲洗0.8-1.2h，去除残留化学诱变剂溶液；
(6)进行种子吸胀、萌发、移栽后续步骤。
所述步骤(1)中的磷酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1mol/L。
所述酒精为70％酒精。
所述诱变处理之前，用浓硫酸浸种；所述浓硫酸为70％-98％的浓硫酸，优化方案中为 98％的浓硫酸。野生型大豆种皮较硬，萌发太慢，浓硫酸的浓度会影响其萌发效果和出芽天数。
所述浓硫酸浸种处理，包括以下步骤：
(1)取植物种子放入杯中；
(2)缓慢倒入浓硫酸，以没过种子为宜，对杯进行缓慢摇动，摇动时间2-70min；
(3)将种子倒入滤网，用清水冲洗种子，去除酸的残留。
或将种子和浓硫酸都倒入滤网，滤网上的种子先静置2-4min，待大部分浓硫酸自然过滤，然后再用清水冲洗3-5min。浓硫酸遇水会放热，需要合适的冲洗时间。
本发明中一种诱导植物产生变异的诱变方法的应用，其所述应用为构建野生型大豆突变体库及筛选野生型大豆突变体；最适EMS剂量可由萌发的大豆种子的半致死率确定。
应用具体包括以下步骤内容：
(1)将诱变后的种子置于人工气候室中培养，进行全生育期突变体的观察；
(2)根据实际情况筛选有利性状突变体，并进行收种。
所述观察为关注与株型及产量相关的性状等；即生长期间主要观察大豆生长速度、叶柄夹角、分枝夹角和叶丛生等性状；成熟期观察统计株高、有效分枝数、单株荚数、结荚高度、单株有效荚数、每荚粒数、单株粒数、单株粒重、百粒重、叶面积和叶面积指数等性状指标；再根据以上性状指标寻找与正常大豆差异大的植株，以确认突变体。
本发明通过诱导植物产生突变，使植物性状发生改变，以从中筛选出耐荫突变体，待突变体种植几代，性状稳定后，可收取种子，并研究其相关突变基因，帮助研发适合间套作种植模式的作物新品种，以提高作物产量。
附图说明
下面结合附图及具体实施方式对本发明做更进一步详细说明：
图1和图2为本发明中表现矮化的突变体个体
图3为本发明中呈“鸡爪形”的突变体子叶
图4为本发明中呈现凹沟状突变体子叶
图5为本发明中EMS诱变后的野生大豆萌发率(左侧为对照，右侧为处理)
图6和图7为本发明中突变体表型图
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明了，结合以下具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种诱导植物产生变异的诱变方法，通过化学诱变剂诱导植物遗传基因发生变异，化学诱变剂为甲基磺酸乙酯(EMS)，其分子式CH3SO2OC2H5，其结构式为
甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)其诱变机理是DNA双链中鸟嘌呤的氧原子位置被EMS烷基化，在DNA复制过程中，烷基化的鸟嘌呤能与胸腺嘧啶配对，导致碱基替换，使G∶C变为T∶A。与其他诱变方法相比，EMS诱变具有如下特点:
(1)较高的突变频率和较少的染色体畸变：主要是EMS诱变使DNA分子上产生较多的点突变，对染色体损伤轻而不致引起染色体断裂产生畸变，可以针对农作物的某一特殊性质进行改良。
(2)对处理材料损伤轻：EMS诱变相对于其它物理诱变的生物损伤小，不容易引起生活力和可育性下降，尤其是无性繁殖的植物由于不经历减数分裂过程繁殖后代，相对于可产生种子的植物，这种突变更容易向后代遗传。
(3)成本低廉，操作简便。使用的EMS诱变剂处理材料不需要特殊的设备，成本较低，一次可以诱变大量的材料，诱变效果较好。
(4)在EMS诱变过程中，用5％硫代硫酸钠EMS诱变作为解毒剂。
诱导植物为大豆，化学诱变剂诱变处理，包括以下步骤：
(1)配制磷酸盐缓冲液：按Na2HPO4·12H2O：NaH2PO4为3.5的用量比例取原料。用水稀释至100mL，pH6.8，磷酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1mol/L。
(2)浸种：用磷酸盐缓冲液浸种5h，冲洗干净后将种子放入锥形瓶中；
(3)配制化学诱变剂溶液：化学诱变剂溶于70％酒精，加入磷酸盐缓冲液，搅拌混匀，即得。
(4)将配制好的化学诱变剂溶液倒入锥形瓶，封口，浸种22h，期间进行缓慢摇动；
(5)流水冲洗0.8h，去除残留化学诱变剂溶液；
(6)进行种子吸胀、萌发、移栽后续步骤。
其中EMS溶液的配制，比如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％、 1.2％的EMS溶液的配制：分别将0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、 1.2mLEMS溶于70％酒精，然后分别加入99.8mL、99.7mL、99.6mL、99.5mL、99.4mL、 99.2mL、99.0mL、98.8mL磷酸盐缓冲液，将其搅拌混匀，即得。
实施例2
其它内容如实施例中，其中化学诱变剂诱变处理，包括以下步骤：
(1)配制磷酸盐缓冲液：按Na2HPO4·12H2O：NaH2PO4为4.2的用量比例取原料。用水稀释至100mL，pH7.2，磷酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1mol/L。
(2)浸种：用磷酸盐缓冲液浸种7h，冲洗干净后将种子放入锥形瓶中；
(3)配制化学诱变剂溶液：化学诱变剂溶于70％酒精，加入磷酸盐缓冲液，搅拌混匀，即得。
(4)将配制好的化学诱变剂溶液倒入锥形瓶，封口，浸种26h，期间进行缓慢摇动；
(5)流水冲洗1.2h，去除残留化学诱变剂溶液；
(6)进行种子吸胀、萌发、移栽后续步骤。
实施例3
其它内容如实施例中，其中化学诱变剂诱变处理，包括以下步骤：
(1)配制磷酸盐缓冲液：按Na2HPO4·12H2O：NaH2PO4为4的用量比例取原料。用水稀释至100mL，pH7，磷酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1mol/L。
(2)浸种：用磷酸盐缓冲液浸种6h，冲洗干净后将种子放入锥形瓶中；
(3)配制化学诱变剂溶液：化学诱变剂溶于70％酒精，加入磷酸盐缓冲液，搅拌混匀，即得。
(4)将配制好的化学诱变剂溶液倒入锥形瓶，封口，浸种24h，期间进行缓慢摇动；
(5)流水冲洗1h，去除残留化学诱变剂溶液；
(6)进行种子吸胀、萌发、移栽后续步骤。
实施例4
诱导植物产生变异的诱变方法的应用，其所述应用为构建野生型大豆突变体库及筛选野生型大豆突变体。最适EMS剂量可由萌发的大豆种子的半致死率确定。
栽培大豆突变体筛选的剂量分别为0.0％、0.2％、0.5％、0.8％,时间梯度为4h、8h、 12h。
应用具体包括以下步骤内容：
(1)将诱变后的种子置于人工气候室中培养，进行全生育期突变体的观察；
(2)根据实际情况筛选有利性状突变体，并进行收种。
主要观察、关注与株型及产量相关的性状。
生长期间主要观察大豆生长速度、叶柄夹角、分枝夹角、叶丛生等性状；成熟期观察统计株高、有效分枝数、单株荚数、结荚高度、单株有效荚数、每荚粒数、单株粒数、单株粒重、百粒重、叶面积、叶面积指数等性状指标。根据以上性状指标寻找与正常大豆差异大的植株，以确认突变体。
选育耐荫性强的大豆新品种，是提高间套作种植模式下大豆产量的有效方法。为了培育出更多大豆耐荫品种，需要研究荫蔽下植株高度即株型建成机理。对于大豆的诱变来说，应重点观察其与株型及产量相关的性状。这些性状，是跟大豆株型及产量所密切相关，可以从各方面反映大豆的在株型及产量两个方面上的变化。
本发明EMS诱变方法在构建野生大豆突变体库及筛选其耐荫突变体的应用，不仅可以被应用到间套作模式中高杆作物玉米对低杆作物大豆的避荫反应机理研究，而且也可以将筛选到的突变体用于遗传育种研究。
实施例5
本例选用EMS溶液作为诱变试剂，选用山东东营地区的野生型大豆作为诱变对象。
EMS不论是从突变谱的广度还是突变频率来讲，都是创建突变体库的优良诱变剂。而 EMS诱变在野生型大豆突变体库的构建及功能基因组的研究方面尚处于起步阶段。
野生大豆相比栽培大豆，其基因资源更丰富，具有高蛋白、多花荚、多节、多分枝、抗逆性强等优异性状，而栽培大豆在人工驯化过程中有很多基因已经丢失，栽培大豆的蛋白质含量普遍低于野生大豆。目前仅报道在栽培大豆构建突变体库较多，但以野生大豆构建突变体库较少，因此，进行野生大豆最适EMS剂量的筛选及构建野生大豆突变体库是获得与避荫反应相关的重要基因突变体的很有前景的一条途径，并在此基础上进行表型描述，为进一步研究大豆避荫反应的分子机理奠定基础，同时为大豆耐荫种质资源的创制提供遗传材料。而山东东营地区的野生型大豆种源多，数量充足，性状较优，故选其为实验对象。
因野生大豆种皮较硬，短时间内萌发率低，因此先用浓硫酸做浸种处理，破坏种皮，促进种子萌发，提高种子萌发率。然后再用磷酸盐缓冲液浸种，主要目的是使种子达到更易吸收EMS的状态，之后将用EMS溶液浸种，其中包括磷酸盐缓冲液，不过其主要目的变为维持溶液pH稳定等于7。
浓硫酸浸种处理，包括以下步骤：
(1)取一定粒数的健康完好的野生型大豆种子放入烧杯中；
(2)杯中分别缓慢倒入浓硫酸，以没过种子为宜；对烧杯进行缓慢摇动，浸泡时间设置为2min、4min、6min、8min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min共 11个时间梯度；
(3)到达规定时间后，将种子倒入滤网，用清水冲洗种子，直至去除酸的残留。分别清洗、分开培养后统计各个时间梯度的出芽率。
其中浓硫酸浸种处理的部分结果如下：
诱变处理，包括以下步骤：
(1)配制磷酸盐缓冲液：取Na2HPO4·12H2O 2.3498g和NaH2PO4 0.6088g，用水稀释至 100mL，pH7.0；磷酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1mol/L。
(2)浸种：用磷酸盐缓冲液浸种6h，冲洗干净后将种子放入锥形瓶中；
(3)配制化学诱变剂溶液：化学诱变剂溶于70％酒精，加入磷酸盐缓冲液，搅拌混匀，即得。
(4)将配制好的化学诱变剂溶液倒入锥形瓶，封口，浸种24h，期间进行缓慢摇动；
(5)流水冲洗1h，去除残留化学诱变剂溶液。
为使EMS诱变效果最佳，获得高质量的诱变材料，其诱变时间和诱变浓度等基本条件分析是诱变处理的的前提。其中野生大豆EMS化学诱变处理条件为：EMS浓度分别为0％、 0.8％、1％、1.2％、2％、2.8％，时间均为24h。通过在恒温培养箱中进行野生大豆突变体的萌发试验，统计野生大豆萌发率进而确定半致死率，并将诱变的野生大豆第一代突变体种植在人工气候室培养，进行全生育期观察，发现了部分对荫蔽不敏感的突变体植株。
不同EMS浓度、不同处理时间的萌发率的部分实验结果如下：
第一次：EMS处理野生大豆条件
第二次：EMS处理野生大豆条件
从以上表中可以看出及多次实验验证，过高浓度的EMS诱变致死率过高，过低浓度的EMS诱变诱变效果受影响，而经0.8％浓度的EMS处理24h后的野生大豆萌发率最接近半致死率，因此选择0.8％，24h的EMS诱变条件作为合适的野生大豆诱变剂量。
本实例中EMS诱变处理，包括以下步骤：
(1)0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0)的配制：取Na2HPO4·12H2O 2.3498g和NaH2PO4 0.6088g，用水稀释至100mL，即得。
(2)用磷酸盐缓冲液浸种6h，而后冲洗干净。将冲洗干净的种子放入锥形瓶中。
(3)0.8％EMS溶液的配制：将0.8mLEMS溶于70％酒精，然后加99.2mL磷酸盐缓冲液，用玻璃棒搅拌混匀，即得。
(4)将配制好的EMS溶液倒入锥形瓶，用锡箔纸封口，浸种24h，期间用摇床缓慢摇动。
(5)到达规定时间后，流水冲洗1h，去除残留EMS溶液。
(6)进行种子吸胀、萌发、移栽等流程。
用未诱变的野生大豆和经EMS处理的野生大豆突变体植株分别对其进行形态、生理实验及分子遗传学方法鉴定，以验证所观察到的野生大豆突变体。下面结合具体示例对本发明进行进一步说明。
试验一
诱变操作步骤如下：
(1)取一定粒数的健康完好的野生型大豆种子放入烧杯中；
(2)缓慢倒入98％浓硫酸，以没过种子为宜。将烧杯放置在摇床上缓慢摇动，浸泡时间为20min；
(3)到达规定时间后，将种子倒入滤网，用清水冲洗种子，直至去除酸的残留；
(4)0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0)的配制：取Na2HPO4·12H2O 2.3498g和 NaH2PO4 0.6088g，用水稀释至100mL，即得；
(5)用磷酸盐缓冲液浸种6h，而后冲洗干净，将冲洗干净的种子放入锥形瓶中；
(6)0.8％EMS溶液的配制：将0.8mLEMS溶于70％酒精，然后加99.2mL磷酸盐缓冲液，用玻璃棒搅拌混匀，即得；
(7)将配制好的EMS溶液倒入锥形瓶，用锡箔纸封口，浸种24h，期间用摇床缓慢摇动；
(8)到达规定时间后，流水冲洗1h，去除残留EMS溶液；
(9)进行种子吸胀、萌发、移栽等流程；
(10)将第一代诱变的野生大豆种子种于人工气候室内培养，进行全生育期突变体植株的观察。
分别对经EMS处理的野生大豆突变体植株和未诱变的野生大豆植株进行表型观察，以初步筛选获得野生大豆突变体，具体结果如图1-图5中所示的性状特征。
正常的野生大豆在子叶节是不着生叶器官或花器官的且子叶是伸展的椭圆形，野生大豆的第一对真叶是椭圆形。图3中显示的是“鸡爪形”，叶片不规则，叶面积明显小，其光合作用也会受到一定程度影响，进而影响大豆植株产量。而在图4中，突变体子叶呈现凹沟状，叶片变厚，外切向壁具有较厚的角质层，有利于植物叶片对光的折射，防止灼伤；其叶片的栅栏组织较多，且富含大量叶绿体，具有更强的光合能力；其变异可能使其能够适应条件更苛刻的环境。这些叶片突变性状可以作为形态标记，应用于杂交育种和突变体的筛选，简化良种繁育过程，提高育种效率。
图1和图2为表现矮化的突变体。适宜的株高是衡量大豆品种优劣的重要指标，矮化是一种优良的农艺性状，可以提高种植密度，提高光能利用率。因此，矮杆大豆是优良的种质资源。突变群体中出现的矮杆植株和高杆植株，有助于研究控制大豆植株的功能基因，为减少玉米-大豆带状复合种植模式中大豆的倒伏现象，以及筛选高光效大豆材料提供了可能。
图6和图7为本发明中突变体表型图，从图中均说明该实验方法可以使大豆性状产生显著变异，例如：引起野生大豆下胚轴缩短，进而影响株高等。
图5为本发明中EMS诱变后的野生大豆萌发率(左侧为对照，右侧为处理)。两组培养条件正常且相同，对照组种子均萌发，而处理组种子一半萌发，一半未萌发，符合诱变的半致死率。
本发明中诱导植物遗传基因发生变异，产生对人类或其他生物，及生产有利的植物性状，并通过连续几代收种、种植，使其突变性状逐渐稳定，用以研发培育新植物品种，或是期间通过筛选基因、基因工程等方法措施，发现优良基因，并将其直接应用于研发培育植物新品种中。根据以上方法，研发培育适合当地栽培条件，能够提高产量，符合人类生产所需，或是对其他生物、生态环境产生有利影响的植物新品种，使植物向着有利于人类的方向快速发展。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。