技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及螺旋藻蛋白酶解物的用途及其制备方法。
背景技术
随着人口老龄化的加剧，衰老及衰老过程中的相关疾病给社会带来的压力越来越大，研究人员逐渐意识到，不仅要延长寿命，更重要的是防治衰老过程中的相关疾病，提高老年人的生活质量，所以，延长健康寿命成为研究抗衰老领域的关键。
多聚谷氨酰胺(polyQ)疾病是衰老过程中常见的神经退行性疾病，疾病的发生源于致病基因编码区CAG三核苷酸重复扩展突变导致基因的编码蛋白——polyQ蛋白产生多聚谷氨酰胺扩展突变，其中典型的疾病有亨廷顿舞蹈病(HD)、延髓脊肌萎缩症(SBMA)等。α-突触核蛋白病是具有α-突触核蛋白病理特征的疾病，包括帕金森病、路易体痴呆、路易体变异型阿尔兹海默病等，其共同的病理特征是α-突触核蛋白选择性地在易损的神经元和神经胶质细胞中积聚，形成包涵体。目前对上述两类神经性疾病的治疗手段相当有限，只能改善症状而不能阻止疾病的进展，相关治疗药物的研究进展也十分缓慢。
螺旋藻是一类低等的原核生物，由单细胞或多细胞组成，含有丰富的蛋白质、微量元素、必需氨基酸、必需脂肪酸、类胡萝卜素、维生素等活性物质，具有降低胆固醇、调节血糖、增强免疫系统、保护肠胃、抗肿瘤等功能，目前已被广泛的应用在食品和药品等研究领域。如中国专利申请CN101928743A公开了一种螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物及其应用，所述酶解产物采用胰蛋白酶、地衣芽孢杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或其组合进行酶解制备，可应用于降低自由基水平或增强个体的抗氧化体系。中国专利申请CN106923337A公开了一种螺旋藻全活性物质的制备方法及其应用，该方法采用不同极性(从小到大)溶剂提取及复合蛋白酶酶解等方法提取制备螺旋藻全活性物质，可用于降血糖、降血脂等。上述两个发明申请都对螺旋藻进行了酶解制备，所得产物具有良好的抗氧化、降血脂、降血糖等功效作用，但均没有提及螺旋藻酶解物在抗衰老、抑制神经毒性蛋白聚集、缓解神经毒性等方面的用途。
因此，迫切需要开发螺旋藻蛋白酶解物在延缓衰老、抑制神经毒性蛋白聚集、缓解神经毒性方面的用途及其制备方法。
发明内容
本发明旨在提供螺旋藻蛋白酶解物在延缓衰老、抑制神经毒性蛋白聚集、缓解神经毒性方面的用途及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
螺旋藻蛋白酶解物在制备抑制神经毒性蛋白聚集或缓解神经毒性的药物或保健品中的用途。
进一步地，所述神经毒性蛋白包括polyQ蛋白和α-突触核蛋白。
更进一步地，所述药物或保健品可缓解Aβ蛋白聚集产生的毒性。
另外的，本发明还提供了一种polyQ蛋白聚集抑制剂，包含有效量的螺旋藻蛋白酶解物。
另外的，本发明还提供了一种α-突触核蛋白聚集抑制剂，包含有效量的螺旋藻蛋白酶解物。
另外的，本发明还提供了一种Aβ蛋白毒性缓解剂，包含有效量的螺旋藻蛋白酶解物。
另外的，本发明还提供了螺旋藻蛋白酶解物在制备抗衰老药物、保健品或化妆品中的用途。
另外的，本发明还提供了一种抗衰老制剂，包含有效量的螺旋藻蛋白酶解物。
另外的，本发明还提供了一种抗衰老化妆品，包含螺旋藻蛋白酶解物。
另外的，本发明还提供了所述螺旋藻蛋白酶解物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、破壁：用Tris-HCl缓冲液将钝顶螺旋藻粉配制成重量体积百分数为8～12％的悬液，调节pH为7.0～7.5，浸泡1～3天，置于-20～-40℃冷冻12～24h，然后置于4～25℃解冻，反复冻融3～5次后，5000～8000rpm离心10～30min，得上清液；
S2、分离蛋白：取步骤S1所得上清液，缓慢加入NH4SO4至其饱和度为50％，持续搅拌，置于4℃条件下过夜，5000～8000rpm离心10～30min，取沉淀复溶于一级水中，置于3.5KDa的透析带中，先用流动水透析2～3d，然后用去离子水透析3～5次，每12h小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液冻干，得螺旋藻蛋白提取物；
S3、酶解：将步骤S2所得螺旋藻蛋白提取物溶于一级水中，制成重量体积百分数为15～30％的蛋白溶液，用0.5mol/L的NaOH溶液将pH调整为7.0～8.0，按照4000～4500U/g加入碱性蛋白酶，调节温度为45～60℃，搅拌酶解120～180min后，冷却至室温，用1mol/L的HCl调节pH为6.0～7.0，按酶与底物重量百分数3.5～5.0％加入木瓜蛋白酶，调节温度为55～65℃，搅拌水解180～250min，置于95～100℃的恒温水浴锅中10～15min，冷却、冻干，即得。
本发明螺旋藻蛋白酶解物的应用及其制备方法，通过反复冻融使细胞壁充分破裂，细胞内容物溶出；再采用硫酸铵沉淀法粗分离蛋白，透析除盐，避免了杂质对后续生物活性试验的影响；然后采用两步酶解法对所得螺旋藻蛋白进行分步酶解，可以得到具有延缓衰老、抑制神经毒性蛋白聚集、缓解神经毒性作用的螺旋藻蛋白酶解物。试验例1～3可以看出，螺旋藻蛋白酶解物可显著提高秀丽线虫自然条件、热激条件和氧化胁迫条件下的存活率，试验例4可以看出，本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物可以降低秀丽线虫脂褐素的聚集，减少色斑的形成，说明本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物可有效的延长寿命，延缓衰老；试验例5可以看出，本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物可显著抑制polyQ蛋白的聚集，对多聚谷氨酰胺病有一定的缓解和治疗作用；试验例6可以看出，本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物可以显著抑制α-突触核蛋白的聚集，试验例7可以看出，本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物能有效缓解Aβ蛋白聚集导致的神经毒性，说明本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物对α-突触核蛋白病有一定的缓解和治疗作用，特别是其中的阿尔茨海默症。
本发明具有以下优点：
(1)本发明螺旋藻蛋白酶解物制备方法制备的螺旋藻蛋白酶解物生物活性高，可以显著延缓衰老，具有显著的神经保护作用，对多聚谷氨酰胺病和α-突触核蛋白病有一定的缓解和治疗作用，可以显著提高患病老年人的晚年生活质量。
(2)本发明一种螺旋藻蛋白酶解物的制备方法，先破壁再分离蛋白然后在进行酶解，步骤简单，操作简便，适用于工业化大规模生产，所得产物可广泛应用于药品、食品和化妆品领域，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为螺旋藻蛋白酶解物对自然条件下秀丽线虫存活率的影响。
图2为螺旋藻蛋白酶解物对热激条件下秀丽线虫存活率的影响。
图3为螺旋藻蛋白酶解物对氧化胁迫条件下秀丽线虫存活率的影响。
图4为螺旋藻蛋白酶解物对秀丽线虫体内脂褐素聚集的影响。
图5为螺旋藻蛋白酶解物对转基因线虫AM141体内polyQ蛋白聚集的影响。
图6为螺旋藻蛋白酶解物对转基因线虫NL5901体内α-突触核蛋白聚集的影响。
图7为螺旋藻蛋白酶解物对转基因线虫CL2355趋化能力的影响。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
其中，螺旋藻粉购自云南庆逸螺旋藻生物开发产业有限公司，大肠杆菌NA22和秀丽隐杆线虫(包括野生型和转基因型)均购自美国明尼苏达大学秀丽线虫遗传信息保藏中心，其余试剂均为常用试剂，可于常规试剂生产企业购买。
S Basal溶液：称取5.8g NaCl、1.3g K2HPO4·3H2O和6.0g KH2PO4置于试剂瓶中，加入750ml去离子水，完全溶解后定容至1L，灭菌30min，冷却至40～50℃备用。
S Medium溶液：取1L灭菌后的S Basal溶液，逐滴加入1ml浓度为5.0mg/ml的胆固醇乙醇溶液，边加边振摇，使其充分溶解(溶液由无色透明转为微乳白透明，无明显沉淀)，然后依次加入3ml浓度为1mol/L的CaCl2溶液、3ml浓度为1mol/L的MgSO4溶液、10ml浓度为1mol/L的柠檬酸钾溶液(pH＝6.0)和10ml微量元素溶液，混匀，常温放置备用。
实施例1一种螺旋藻蛋白酶解物(SPPH)
由以下步骤制成：
S1、破壁：用Tris-HCl缓冲液将钝顶螺旋藻粉配制成重量体积百分数为10％的悬液，调节pH为7.4，浸泡1天，置于-20℃冷冻12h，然后置于4℃解冻，反复冻融3次后，5000rpm离心30min，得上清液；
S2、分离蛋白：取步骤S1所得上清液，缓慢加入NH4SO4至其饱和度为50％，持续搅拌，置于4℃条件下过夜，5000rpm离心30min，取沉淀复溶于一级水中，置于3.5KDa的透析带中，先用流动水透析3d，然后用去离子水透析3次，每12h小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液冻干，得螺旋藻蛋白提取物；
S3、酶解：将步骤S2所得螺旋藻蛋白提取物溶于一级水中，制成重量体积百分数为20％的蛋白溶液，用0.5mol/L的NaOH溶液将pH调整为7.0，按照4300U/g加入碱性蛋白酶，调节温度为55℃，搅拌酶解160min后，冷却至室温，用1mol/L的HCl调节pH为6.5，按酶与底物重量百分数4.5％加入木瓜蛋白酶，调节温度为60℃，搅拌水解210min，置于99℃的恒温水浴锅中10min，冷却、冻干，即得。
实施例2一种螺旋藻蛋白酶解物(SPPH)
由以下步骤制成：
S1、破壁：用Tris-HCl缓冲液将钝顶螺旋藻粉配制成重量体积百分数为12％的悬液，调节pH为7.5，浸泡2天，置于-20℃冷冻24h，然后置于4℃解冻，反复冻融4次后，6000rpm离心10min，得上清液；
S2、分离蛋白：取步骤S1所得上清液，缓慢加入NH4SO4至其饱和度为50％，持续搅拌，置于4℃条件下过夜，6000rpm离心10min，取沉淀复溶于一级水中，置于3.5KDa的透析带中，先用流动水透析3d，然后用去离子水透析4次，每12h小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液冻干，得螺旋藻蛋白提取物；
S3、酶解：将步骤S2所得螺旋藻蛋白提取物溶于一级水中，制成重量体积百分数为25％的蛋白溶液，用0.5mol/L的NaOH溶液将pH调整为7.5，按照4500U/g加入碱性蛋白酶，调节温度为55℃，搅拌酶解180min后，冷却至室温，用1mol/L的HCl调节pH为6.5，按酶与底物重量百分数为4.8％加入木瓜蛋白酶，调节温度为63℃，搅拌水解200min，置于100℃的恒温水浴锅中10min，冷却、冻干，即得。
实施例3一种螺旋藻蛋白酶解物(SPPH)
由以下步骤制成：
S1、破壁：用Tris-HCl缓冲液将钝顶螺旋藻粉配制成重量体积百分数为8％的悬液，调节pH为7.3，浸泡2天，置于-20℃冷冻18h，然后置于25℃解冻，反复冻融5次后，8000rpm离心10min，得上清液；
S2、分离蛋白：取步骤S1所得上清液，缓慢加入NH4SO4至其饱和度为50％，持续搅拌，置于4℃条件下过夜，8000rpm离心10min，取沉淀复溶于一级水中，置于3.5KDa的透析带中，先用流动水透析3d，然后用去离子水透析5次，每12h小时换一次去离子水，取透析后的蛋白液冻干，得螺旋藻蛋白提取物；
S3、酶解：将步骤S2所得螺旋藻蛋白提取物溶于一级水中，制成重量体积百分数为20％的蛋白溶液，用0.5mol/L的NaOH溶液将pH调整为7.5，按照4000U/g加入碱性蛋白酶，调节温度为52℃，搅拌酶解170min后，冷却至室温，用1mol/L的HCl调节pH为6.5，按酶与底物重量百分数为4.2％加入木瓜蛋白酶，调节温度为62℃，搅拌水解240min，置于98℃的恒温水浴锅中15min，冷却、冻干，即得。
试验例1螺旋藻蛋白酶解物对秀丽线虫自然条件下寿命的影响
1.试验材料：本发明实施例1制备的螺旋藻蛋白酶解物(SPPH)。
2.试验对象：野生型秀丽线虫(N2)。
3.试验方法：
将L4期的秀丽线虫转入1.5ml的无菌EP管中，用S Medium洗涤3次，除去没有孵出的卵和线虫碎片，用S Medium溶液将密度调至20条/10μL，摇匀后每孔加入10μl秀丽线虫液，再加入溶解于S Medium溶液的螺旋藻蛋白酶解物使并其终浓度为2mg/ml(对照组加入等体积的S Medium溶液)，然后加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素和终浓度为75μg/ml的5-氟尿嘧啶脱氧核苷(5-FUDR)，最后以含有NA22菌液的S Medium补足至100μl，置于20℃摇床培养，然后每隔12h统计秀丽隐杆线虫存活的比例，直至其全部死亡。
4.试验结果：
秀丽隐杆线虫的存活率以生存曲线表示，结果用Kaplan-Meier法进行分析，详见图1。由图1可见，螺旋藻蛋白酶解物能延长秀丽线虫在自然条件下的寿命，说明本发明提供的螺旋藻蛋白酶解物具有延缓衰老的作用。
试验例2螺旋藻蛋白酶解物对秀丽线虫热激条件下存活率的影响
1.试验材料：本发明实施例1制备的螺旋藻蛋白酶解物(SPPH)。
2.试验对象：野生型秀丽线虫(N2)。
3.试验方法：
将L4期的秀丽线虫转入1.5ml的无菌EP管中，用S Medium洗涤3次，除去没有孵出的卵和线虫碎片，用S Medium溶液将密度调至20条/10μL，摇匀后每孔加入10μl秀丽线虫液，再加入溶解于S Medium溶液的螺旋藻蛋白酶解物使并其终浓度为2mg/ml(对照组加入等体积的S Medium溶液)，然后加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素和终浓度为75μg/ml的5-氟尿嘧啶脱氧核苷(5-FUDR)，最后以含有NA22菌液的S Medium补足至100μl，置于20℃摇床培养48h，将微孔板置于35℃热激6h，再置于20℃孵育15h，统计秀丽线虫的存活率。
4.试验结果：
由图2可见，与对照组相比，螺旋藻蛋白酶解物能显著提高热激胁迫下秀丽线虫的存活率，说明本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物可显著增强秀丽线虫的抗热激胁迫能力。
试验例3螺旋藻蛋白酶解物对秀丽线虫氧化胁迫条件下存活率的影响
1.试验材料：本发明实施例1制备的螺旋藻蛋白酶解物(SPPH)。
2.试验对象：野生型秀丽线虫(N2)。
3.试验方法：
将L4期的秀丽线虫转入1.5ml的无菌EP管中，用S Medium洗涤3次，除去没有孵出的卵和线虫碎片，用S Medium溶液将密度调至20条/10μL，摇匀后每孔加入10μl秀丽线虫液，再加入溶解于S Medium溶液的螺旋藻蛋白酶解物使并其终浓度为2mg/ml(对照组加入等体积的S Medium溶液)，然后加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素和终浓度为75μg/ml的5-氟尿嘧啶脱氧核苷(5-FUDR)，最后以含有NA22菌液的S Medium补足至100μl，置于20℃摇床培养24h后，加入终浓度为50mmol/L的白枯草进行氧化胁迫造模，然后每隔12h统计秀丽隐杆线虫的存活比例，直至其全部死亡。
4.试验结果：
秀丽隐杆线虫的存活率以生存曲线表示，结果用Kaplan-Meier法进行分析。由图3可知，螺旋藻蛋白酶解物可以显著提高氧化胁迫下秀丽线虫的存活率，说明本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物可以增强线虫的抗氧化能力，缓解氧化胁迫引起的损伤。
试验例4螺旋藻蛋白酶解物对秀丽线虫体内脂褐素聚集的影响
1.试验材料：本发明实施例1制备的螺旋藻蛋白酶解物(SPPH)。
2.试验对象：野生型秀丽线虫(N2)。
3.试验方法：
将L4期的秀丽线虫转入1.5ml的无菌EP管中，用S Medium洗涤3次，除去没有孵出的卵和线虫碎片，用S Medium溶液将密度调至20条/10μl，摇匀后每孔加入10μl秀丽线虫液，再加入溶解于S Medium溶液的螺旋藻蛋白酶解物使并其终浓度为2mg/ml(对照组加入等体积的S Medium溶液)，然后加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素和终浓度为75μg/ml的5-氟尿嘧啶脱氧核苷(5-FUDR)，最后以含有NA22菌液的S Medium补足至100μl，置于20℃摇床培养10d，收集秀丽线虫用M9缓冲液清洗3次，转移至2％的琼脂糖凝胶片上，并滴加10μl浓度为100mmol/L的NaN3麻醉秀丽线虫，设置激发波长为355nm，发射波长460nm，用荧光显微镜进行拍照，并利用Image J软件对图片进行分析，计算出各组荧光密度。
4.试验结果：
由图4可知，添加螺旋藻蛋白酶解物的秀丽体内荧光强度较对照组显著降低，说明本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物可以降低秀丽线虫脂褐素的聚集，减少色斑的形成，延缓衰老。
试验例5螺旋藻蛋白酶解物对亨廷顿疾病模型(AM141)polyQ蛋白聚集的影响
1.试验材料：本发明实施例1制备的螺旋藻蛋白酶解物(SPPH)。
2.试验对象：转基因线虫株AM141，可表达polyQ40::YFP融合蛋白，从孵出到长成成虫阶段，polyQ蛋白不断聚集，即随着线虫的衰老，黄绿色荧光点不断增多，可应用于研究polyQ毒性相关通路，是研究HD的常用疾病模型。
3.试验方法：
取同步化后L1期的转基因线虫株AM141加入到24孔板中，每孔约500条，然后加入螺旋藻蛋白酶解物和NA22菌液，震荡后置于20℃摇床培养，每24h收集转基因线虫于EP管中，用M9缓冲液洗涤3次后将收集到的转基因线虫液滴至2％琼脂糖垫上，并滴加10μl浓度为100mmol/L的NaN3麻醉转基因线虫，设置激发波长485nm，发射波长538nm，通过荧光显微镜进行观察，统计每组(约20条转基因线虫)每条转基因线虫黄绿色荧光聚集点。
4.试验结果：
由图5可知，3天内，螺旋藻蛋白酶解物组的转基因线虫荧光聚集数量都少于对照组，其中，第3天螺旋藻蛋白酶解物处理的转基因线虫荧光点聚集数量与对照组相比显著减少，结果说明本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物可显著抑制polyQ蛋白的聚集，对多聚谷氨酰胺病有一定的缓解和治疗作用。
试验例6螺旋藻蛋白酶解物对帕金森模型(NL5901)α-突触核蛋白聚集的影响
1.试验材料：本发明实施例1制备的螺旋藻蛋白酶解物(SPPH)。
2.试验对象：转基因线虫株NL5901，是在体壁肌肉细胞表达有绿色荧光蛋白标记的人源α-突触核蛋白的转基因线虫株，随着衰老的进行，α-突触核蛋白表达的越多，绿色荧光也越强，是常用于研究PD的线虫模型。
3.试验方法：
取同步化后L1期的转基因线虫株NL5901加入到24孔板中，每孔约500条，然后加入螺旋藻蛋白酶解物和NA22菌液，震荡后置于20℃摇床培养72h，收集转基因线虫于EP管中，用M9缓冲液洗涤3次后将转基因线虫液滴至2％琼脂糖垫上，并滴加10μl浓度为100mmol/L的NaN3麻醉秀丽线虫，设置激发波长485nm，发射波长538nm，通过荧光显微镜进行观察，利用Image J软件对图片进行分析统计每条线虫荧光密度。
4.试验结果：
由图6可知，螺旋藻蛋白酶解物处理的转基因线虫表达的荧光蛋白的荧光强度显著低于对照组，说明本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物能显著抑制α-突触核蛋白的聚集，对α-突触核蛋白病有一定的缓解和治疗作用。
试验例7螺旋藻蛋白酶解物对阿尔茨海默症模型(CL2355)趋化能力的影响
1.试验材料：本发明实施例1制备的螺旋藻蛋白酶解物(SPPH)。
2.试验对象：转基因线虫株CL2355，在高温下会诱导表达Aβ蛋白，是引起阿尔茨海默病的重要物质，会造成神经损伤，对化学物质(cANP、苯甲醛、双乙酰等)的敏感性下降，通过检测热激后的转基因线虫的趋化能力可以判断样品是否能缓解Aβ聚集产生的神经毒性。
3.试验方法：
取同步化后的转基因线虫株CL2355的卵在15℃摇床培养23小时后调虫密度，等量的加入到24孔板中，每孔约500条，然后加入螺旋藻蛋白酶解物和NA22菌液，震荡后置于15℃培养36h，然后升温至23℃继续培养36h，收集转基因线虫于EP管中，用M9缓冲液洗涤3次，将转基因线虫转移至9cm趋化平板的中央，在平板两侧距离边缘1cm位置分别滴加引诱剂苯甲醛(A)与无水乙醇(B)，23℃培养1h后取出，于50℃烘箱加热15min处死，显微镜下统计转基因线虫受到苯甲醛诱导的情况。
趋化指数CI＝(Number(A)-Number(B))/(Number(A)+Number(B))。
4.试验结果：
由图7可知，本发明实施例1制备的螺旋藻蛋白酶解物处理后的转基因线虫趋化指数显著高于对照组，说明本发明制备的螺旋藻蛋白酶解物能有效缓解Aβ蛋白聚集导致的神经毒性，对阿尔茨海默症具有缓解和治疗的一定的作用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。