鼓槌石斛种苗商品化生产方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410392173.2 (22)申请日 2014.08.01 A01H 1/02(2006.01) (71)申请人 云南省德宏热带农业科学研究所 地址 678600 云南省瑞丽市目瑙路 36 号 (72)发明人 高燕 白燕冰 李泽生 李桂琳 李薇莎 (54) 发明名称 鼓槌石斛种苗商品化生产方法 (57) 摘要 本发明公开了一种鼓槌石斛种苗商品化生产 方法， 属于植物生物技术领域。本发明是以鼓槌 石斛的果荚为外植体， 采用改良的 Ma 基本培养 基， 在培养各阶段添加去皮的马铃薯泥、 香蕉泥， 建立鼓槌石斛无菌快繁技术体系， 包括良。

2、种选育、 培养基制备、 瓶苗培育、 假植培育等相关技术， 能 有效解决了鼓槌石斛优良种苗的来源和种苗纯度 性， 与常规种苗组培快繁相比， 种子萌发率提高到 98以上， 生产成本降低 20， 生长周期缩短了 60 天， 污染率降低 5， 炼苗、 移栽成活率提高到 95以上， 假植培育6090天， 可出售或移栽， 与 分株繁殖种苗种植相比， 本发明培育鼓槌石斛种 苗种植的每丛新抽生的幼苗增加 5 7 株。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 CN 105309301 A 2016.02.10 CN 105309301 A 。

3、1/2 页 2 1. 鼓槌石斛种苗商品化生产方法， 其特征在于以下步骤 ： (1) 良种选育方法 ： 以优良母株盛花期进行种内人工杂交异株异花授粉 ； 将父本的花药小心放入母本花朵的柱头窝内， 授完粉后， 套上袋， 经过 150-180 天果实 成熟 ； (2) 培养基制备方法 ： 采用 MS 为基本培养基 ( 无水氯化钙、 铁盐浓度减半、 肌醇不用 ) 改良基本母液为 Ma ； 去皮的马铃薯或香蕉打成泥， 母液、 琼脂、 白糖加热至沸腾， 充分混合均匀， 出锅时拧紧 瓶盖， 放置 3 天后备用 ； (3) 瓶苗培育方法 ： 以果荚为外植体采用 0.1 HgCl2( 升汞 ) 灭菌 20 分钟。

4、处理后 ； 将种子接种于 1/2Ma+NAA(- 萘乙酸 )0.1 毫克 / 升 +2马铃薯泥原球茎诱导培养上， 进行诱导培养 ； 将分化的小苗接种于3/4Ma+6-BA(6-苄基腺嘌呤)0.1毫克/升+NAA(-萘乙酸)0.2 毫克 / 升 +8马铃薯泥 +2香蕉泥增殖分化培养中， 进行增殖分化培养 ； 将2-3cm长的丛生苗接种于3/5Ma+IBA(吲哚丁酸)0.2毫克/升+NAA(-萘乙酸)0.5 毫克 / 升 +AC( 活性炭 )0.5 克 / 升 +3马铃薯泥 +7香蕉泥生根培养中， 进行壮苗生根培 养 ； 培养条件 ： 白糖 20 克 / 升， 琼脂粉 4 克 / 升， PH 值 。

5、5.8 6.0， 培养温度 252， 光照 强度 1600 20001x， 光照时间 12 小时 / 天 ； (4) 假植培育方法 ： 将瓶苗置于荫蔽度 75的塑料大棚内炼苗 20 天， 通风透气， 控制好光照 ； 基质配比为杂木屑树皮屑腐质土 ( 混合， 体积比 ) 1 1 1， 将混合基质均匀 铺在苗床上， 厚度 8 10cm， 用 0.1 0.2高锰酸钾对基质消毒处理 ； 将清洗干净的生根苗用 0.05精甲、 咯菌腈 +0.1百毒剂 +0.01硫酸铜混合液浸泡 10 分钟， 晾干至根部发白后， 按 3 株 / 丛， 株行距 5cm5cm， 移栽， 加强水肥管理， 控制好温 度和光照， 培。

6、育 60 90 天后即可出圃移栽 ； 将苗拔起， 按 10 丛 / 捆， 用 2cm 宽的报纸条缠 紧， 装箱出圃。 2. 根据权利要求 1 所述的一种鼓槌石斛种苗商品化生产方法， 其特征在于 ： 步骤 1) 中， 所述良种选育方法是 ： 以优良母株盛花期进行种内人工杂交异株异花授粉 ； 将父本的 花药小心放入母本花朵的柱头窝内， 授完粉后， 套上袋， 经过 150 180d 果实成熟。 3. 根据权利要求 1 所述的一种鼓槌石斛种苗商品化生产方法， 其特征在于 ： 步骤 2) 中， 所述培养基的配制方法为 ： 改良基本母液 Ma， 去皮的马铃薯或香蕉打成泥， 母液、 琼脂、 白糖加热至沸腾，。

7、 充分混合均匀， 出锅时拧紧瓶盖。 4. 根据权利要求 1 所述的一种鼓槌石斛种苗商品化生产方法， 其特征在于 ： 步骤 3) 中， 所述瓶苗培育方法为 ： 以果荚为外植体采用 0.1 HgCl2( 升汞 ) 灭菌 20 分钟处理后 ； 将种子接种于 1/2Ma+NAA(- 萘乙酸 )0.1 毫克 / 升 +2马铃薯泥原球茎诱导培养上， 进 行诱导培养 ； 将分化的小苗接种于 3/4Ma+6-BA(6- 苄基腺嘌呤 )0.1 毫克 / 升 +NAA0.2 毫 克 / 升 +8马铃薯泥 +2香蕉泥增殖分化培养中， 进行增殖分化培养 ； 将 2 3cm 长的丛 生苗接种于 3/5Ma+IBA( 吲。

8、哚丁酸 )0.2 毫克 / 升 +NAA(- 萘乙酸 )0.5 毫克 / 升 +AC( 活 权 利 要 求 书 CN 105309301 A 2 2/2 页 3 性炭)0.5克/升+3马铃薯泥+7香蕉泥生根培养上， 进行壮苗生根培养 ； 所述培养条件 为白糖 20 克 / 升， 琼脂粉 4 克 / 升， PH 值 5.8 6.0， 培养温度 252， 光照强度 1600 20001x， 光照时间 12 小时 / 天。 5. 根据权利要求 1 所述的一种鼓槌石斛种苗商品化生产方法， 其特征在于 ： 步骤 4) 中， 所术假植培育方法为 ： 将瓶苗置于荫蔽度 75的塑料大棚内炼苗 20 天， 通风。

9、透气， 控制 好光照 ； 基质配比为树皮屑腐质土 ( 混合， 体积比 ) 1 1 1， 用 0.1 0.2高锰 酸钾对基质消毒处理 ； 清洗的生根苗用 0.05精甲、 咯菌腈 +0.1百毒剂 +0.01硫酸铜 混合液浸泡 10 分钟， 晾干至根部发白后， 按 3 株 / 丛， 株行距 5cm5cm， 移栽， 加强水肥管 理， 控制好温度和光照， 培育 60 90 天后即可出圃移栽 ； 将苗拔起， 按 10 丛 / 捆， 用 2cm 宽 的报纸条缠紧， 装箱出圃。 权 利 要 求 书 CN 105309301 A 3 1/5 页 4 鼓槌石斛种苗商品化生产方法 技术领域 0001 本发明涉及食药。

10、观植物鼓槌石斛种苗商品化生产方法， 属于植物生物技术领域。 背景技术 0002 鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum)为兰科石斛属多年生附生草本植物， 别名金 弓石斛， 是一种集食、 药、 观赏为一身石斛种类， 鼓槌石斛花呈金黄色， 茎呈纺锤形， 观赏价 值极高， 既可作切花和盆栽观赏， 花又可开发系列鼓槌石斛茶、 酒、 鲜花饼等产品， 鼓槌石斛 花资源丰富， 据报道含有 22 个化合物， 具有美容明目、 安神补血、 抗癌解郁、 降三高等功效 ； 其茎可药用， 具有清热解毒， 增强免疫力等功效， 由于鼓槌石斛资源花的差异大而颜色多， 以唇瓣中心斑块颜色为紫红色最艳丽， 茎的长。

11、短、 粗细差异大而形态多， 以中杆茎粗的品质 及观赏最佳 ； 近年来， 人们过渡采挖， 加上自然条件下种子萌发率极低， 导致野生资源濒临 枯竭， 那么选择优良鼓槌石斛进行人工杂交授粉选育出新品种， 进行组培快繁育苗， 为鼓槌 石斛规模化种植提供大量优质种苗， 解决市场上原料紧缺， 加快创新育种的进程， 对其资源 的保护及开发利用具有深远的意义。 0003 近年来， 有关鼓槌石斛组培繁殖有一些报道， 通过组织培养试验也获得一定的组 培苗， 但在石斛规模化生产技术上， 培育的种苗根细而少， 种胚萌发率低 75， 污染率高达 10， 种苗繁殖周期长(8个月以上)， 种苗生产成本高达1.2元/丛， 因。

12、此， 开展鼓槌石斛有 性系的组培繁育研究， 提高鼓槌石斛种苗商品化生产技术， 还存在以下问题 ： 0004 1、 由于鼓槌石斛种质资源性状上差异较大， 而在产量上遗传性比较稳定， 茎、 叶、 花的生长差异明显， 鼓槌石斛自然结果， 在光照和水肥不足， 果荚发育小而不好， 品种的纯 度性低， 导致萌发率低、 增殖速度慢、 种苗质量差。 0005 2、 目前， 鼓槌石斛种苗主要是采用分株繁殖， 原材料浪费大， 发芽率低， 难以满足 市场需求 ； 而鼓槌石斛现有的组培技术， 是以自然结果的果荚为外植体， 种胚萌发率低、 种 苗生产速度慢、 苗黄化严重、 增殖倍数低等问题使种苗生产速度慢、 生根苗质量。

13、差、 炼苗和 移栽成活率低、 生长慢， 极大的影响了鼓槌石斛种苗商品化生产的规模和速度。 0006 加快鼓槌石斛种苗商品化生产速度， 降低成本， 提高移栽成活率、 鲜花产量、 增加 花观赏价值及有效成份含量是急需解决的问题。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种鼓槌石斛人工有性杂交授粉育种， 培育良种， 种苗商品 化生产速度快、 生产成本低、 自然光炼苗和假植培育成活率高、 出圃率高的种苗商品化生产 方法。 0008 鼓槌石斛种苗商品化生产方法， 包括以下方法步骤 ： 0009 良种选育方法 ： (1) 优良母株选择 ： 鼓槌石斛的盛花期为45月， 选择生长健壮花期长、 花朵大而艳丽、 。

14、植株形态美观、 有 说 明 书 CN 105309301 A 4 2/5 页 5 效成分高的优良母株进行种内人工杂交异株异花授粉 ； (2) 杂交授粉方法 ： 工具 ： 直径 6cm 培养皿一套， 7cm 小镊子 1 把， 75酒精和棉球， 套袋， 标签 ； 授粉方法 ： 一般在早上 10 点以前， 镊子用 75酒精消毒后， 将花药取出放在培养皿 中， 再用镊子去掉母本上花朵的药帽， 将父本的花药小心放入母本花朵的柱头窝内， 每授一 朵花， 镊子、 培养皿用 75酒精消毒后才能再使用， 每穗花穗授粉 5 8 朵， 授完粉后， 用白 色无纺布做成口袋套上， 挂上标签， 2 3 天之内不能浇水， 。

15、加强大田管理， 保证充足阳光， 提高果实的质量， 一般经过 150 180 天果实成熟。 0010 基本母液采用改良的 MS( 无水氯化钙、 铁盐浓度减半、 肌醇不用 ) 为 Ma 的制备方 法 ： 大量元素配成 50 倍液 ( 用量 20 毫克 / 升 )， 微量元素配成 200 倍液 ( 用量 5 毫克 / 升 )， 植物激素配成 50 倍液， 所有药剂用纯净水溶解定容， 微量元素用低温保存， 母液保存 不要超过一个月。 0011 培养基的配制方法 ： 按培养基的配方要求， 称取去皮的马铃薯或香蕉， 按马铃薯或 香蕉水(体积比)13， 用果汁机打碎成泥加入定容桶内， 量取母液和激素、 称取。

16、琼脂 和白糖， 按琼脂粉 + 白糖母液 + 水 ( 混合， 体积比 ) 1 5， 用木棍边搅边加热至沸腾 加入定容桶内， 用纯净水定容， 充分混合均匀， 用 1 摩尔的 NaOH( 氢氧化钠 ) 和 HCl( 盐酸 ) 溶液调 PH 值 5.8-6.0， 将培养液倒入不锈钢桶内放在恒温磁力搅拌器 (900 1000r/min) 不停搅拌， 用塑料杯趁热分装， 分装标准 ： 小瓶 18 20 瓶 /L， 大瓶 9 10 瓶 /L ； 培养基厚 度 ： 小瓶 1.4 1.6cm， 大瓶 2.0 2.2cm， 在 123 125高温下灭菌 20 分钟， 出锅时拧紧 瓶盖， 标签注明培养基编号、 日期。

17、， 放置 3 天后备用。 0012 瓶苗培育 ： (1) 外植体选择与消毒 ： 将成熟未开裂的果荚用 0.01洗衣粉冲洗干净后， 经 75酒精浸泡 60 秒， 用 0.1 HgCl2( 升汞 ) 灭菌 20 分钟， 然后用无菌水冲洗 5 6 次， 过滤纸吸干水分 ； (2) 培养基与培养条件 ： 原球茎诱导培养 ： 切开消毒过的果荚， 将种子接种于 1/2Ma+NAA(- 萘乙酸 )0.1 毫 克 / 升 +2马铃薯泥培养基上进行诱导培养， 暗培养 5d， 再转入光照培养， 5d 后， 种胚漫漫 吸水膨大， 逐渐撑破种皮， 形成针尖样淡绿色原球茎， 培养 45 天后， 诱导大量的类原球茎或 分。

18、化小苗 ； 增殖分化培养 ： 将分化的小苗接种于 3/4Ma+6-BA(6- 苄基腺嘌呤 )0.1 毫克 / 升 +NAA0.2 毫克 / 升 +8马铃薯泥 +2香蕉泥培养基中进行增殖分化培养， 苗间距 1.5 2cm， 2 3 株 / 丛， 培养 50 天后， 长成高 2 3cm 丛生苗， 叶 2 4 片 ； 壮苗生根培养 ： 将 2 3cm 高的丛生苗接种于 3/5Ma+IBA( 吲哚丁酸 )0.2 毫克 / 升 +NAA(c- 萘乙酸 )0.5 毫克 / 升 +AC( 活性炭 )0.5 克 / 升 +3马铃薯泥 +7香蕉泥培养基 中进行壮苗生根培养， 苗间距 2 2.5cm， 1 2 株。

19、 / 丛， 培养 60 天后， 每丛苗高 4 6cm， 根 长 3-4cm， 生根数 6 8 条 / 株 ； 培养条件 ： 白糖 20 克 / 升， 琼脂粉 4 克 / 升， PH 值 5.8 6.0， 培养温度 252， 光 照强度 1600 20001x， 光照时间 12 小时 / 天。 0013 假植培育 ： 说 明 书 CN 105309301 A 5 3/5 页 6 (1) 炼苗 ： 选取生根苗株高 3 5cm， 根长 3cm 以上， 将瓶苗置于荫蔽度 75的塑料大 棚内炼苗 20d， 苗瓶之间间隔 1 2cm， 通风透气， 控制好光照 ； (2)栽培基质 ： 杂木屑树皮屑腐质土(混。

20、合， 体积比)111， 假植前1-2d， 将 基质配比好， 均匀铺在苗床上， 苗床的标准(高80cm、 宽120cm、 长10m)， 用0.10.2高 锰酸钾等消毒液将基质淋透消毒处理， 基质厚度为 8 10cm， 下层 4cm 为粗基质， 上层 4cm 为细基质 ； (3) 移栽 ： 移栽时将瓶苗取出， 洗净根上附着的培养基， 用 0.05精甲、 咯菌腈 +0.1 百毒剂 +0.01硫酸铜混合液浸泡 10min， 捞起放在透气塑料筐中晾干至根部发白后移栽， 按 3 株 / 丛， 株行距 5cm5cm， 移栽时根基部与基质平， 根不能外露， 苗不能睡倒在基质上， 根据天气情况， 掌握浇水次数，。

21、 保持基质湿润， 控制好光照， 移栽 10d 后， 可结合浇水喷一些 低浓度叶面肥， 培育 60 90d 后即可出圃移栽 ； (4) 出圃 ： 将抽新根发新叶达到标准的苗， 轻轻拔起， 不要伤根， 按 10 丛 / 捆， 用 2cm 宽 的报纸条缠紧， 整齐放进纸箱内， 标明出苗日期和数量。 0014 本发明技术方案具有以下有益效果 ： 选用鼓槌石斛良种进行快繁 ； 采用改良的基本培养基 Ma 与标准基本培养基 MS 相比无 水氯化钙、 铁盐浓度减半、 肌醇不用 ； 附加物马铃薯和香蕉去皮直接打成泥， 可减少用量， 提 高营养成分， 琼脂粉、 糖、 母液加热至沸腾， 有利于培养基均匀溶解， 降。

22、低污染率， 本方法有 效解决了鼓槌石斛优良种苗的来源和种苗纯度性， 与常规种苗组培快繁相比， 种胚萌发率 提高到98以上， 生产成本降低20， 生长周期缩短了60天， 污染率降低5， 炼苗、 移栽成 活率提高到 95以上 ； 种苗假植培育 60 90 天， 可出售或规模化栽培， 与分株繁殖种苗种 植相比， 本发明培育鼓槌石斛种苗种植的每丛新抽生的幼芽增加 5 7 株。 具体实施方式 0015 鼓槌石斛种苗商品化生产方法， 包括以下方法步骤 ： 0016 良种选育方法 ： (1) 优良母株选择 ： 鼓槌石斛的盛花期为45月， 选择生长健壮花期长、 花朵大而艳丽、 植株形态美观、 有 效成分高的优。

23、良母株进行种内人工杂交异株异花授粉 ； (2) 杂交授粉方法 ： 工具 ： 直径 6cm 培养皿一套， 7cm 小镊子 1 把， 75酒精和棉球， 套袋， 标签 ； 授粉方法 ： 一般在早上 10 点以前， 镊子用 75酒精消毒后， 将花药取出放在培养皿 中， 再用镊子去掉母本上花朵的药帽， 将父本的花药小心放入母本花朵的柱头窝内， 每授一 朵花， 镊子、 培养皿用 75酒精消毒后才能再使用， 每穗花穗授粉 5 8 朵， 授完粉后， 用白 色无纺布做成口袋套上， 挂上标签， 2 3 天之内不能浇水， 加强大田管理， 保证充足阳光， 提高果实的质量， 一般经过 150 180 天果实成熟。 00。

24、17 基本母液采用改良的 MS( 无水氯化钙、 铁盐浓度减半、 肌醇不用 ) 为 Ma 的制备方 法 ： 大量元素配成 50 倍液 ( 用量 20 毫克 / 升 )， 微量元素配成 200 倍液 ( 用量 5 毫克 / 升 )， 植物激素配成 50 倍液， 所有药剂用纯净水溶解定容， 微量元素用低温保存， 母液保存 不要超过一个月。 说 明 书 CN 105309301 A 6 4/5 页 7 0018 培养基的配制方法 ： 按培养基的配方要求， 称取去皮的马铃薯或香蕉， 按马铃薯或 香蕉水(体积比)13， 用果汁机打碎成泥加入定容桶内， 量取母液和激素、 称取琼脂 和白糖， 按琼脂粉 + 白。

25、糖母液 + 水 ( 混合， 体积比 ) 1 5， 用木棍边搅边加热至沸腾 加入定容桶内， 用纯净水定容， 充分混合均匀， 用 1 摩尔的 NaOH( 氢氧化钠 ) 和 HCl( 盐酸 ) 溶液调 PH 值 5.8-6.0， 将培养液倒入不锈钢桶内放在恒温磁力搅拌器 (900 1000r/min) 不停搅拌， 用塑料杯趁热分装， 分装标准 ： 小瓶 18 20 瓶 /L， 大瓶 9 10 瓶 /L ； 培养基厚 度 ： 小瓶 1.4 1.6cm， 大瓶 2.0 2.2cm， 在 123 125高温下灭菌 20 分钟， 出锅时拧紧 瓶盖， 标签注明培养基编号、 日期， 放置 3 天后备用。 001。

26、9 瓶苗培育 ： (1) 外植体选择与消毒 ： 将成熟未开裂的果荚用 0.01洗衣粉冲洗干净后， 经 75酒精浸泡 60 秒， 用 0.1 HgCl2( 升汞 ) 灭菌 20 分钟， 然后用无菌水冲洗 5 6 次， 过滤纸吸干水分 ； (2) 培养基与培养条件 ： 原球茎诱导培养 ： 切开消毒过的果荚， 将种子接种于 1/2Ma+NAA(- 萘乙酸 )0.1 毫 克 / 升 +2马铃薯泥培养基上进行诱导培养， 暗培养 5d， 再转入光照培养， 5d 后， 种胚漫漫 吸水膨大， 逐渐撑破种皮， 形成针尖样淡绿色原球茎， 培养 45 天后， 诱导大量的类原球茎或 分化小苗 ； 增殖分化培养 ： 将。

27、分化的小苗接种于 3/4Ma+6-BA(6- 苄基腺嘌呤 )0.1 毫克 / 升 +NAA0.2 毫克 / 升 +8马铃薯泥 +2香蕉泥培养基中进行增殖分化培养， 苗间距 1.5 2cm， 2 3 株 / 丛， 培养 50 天后， 长成高 2 3cm 丛生苗， 叶 2 4 片 ； 壮苗生根培养 ： 将 2 3cm 高的丛生苗接种于 3/5Ma+IBA( 吲哚丁酸 )0.2 毫克 / 升 +NAA(- 萘乙酸 )0.5 毫克 / 升 +AC( 活性炭 )0.5 克 / 升 +3马铃薯泥 +7香蕉泥培养基 中进行壮苗生根培养， 苗间距 2 2.5cm， 1 2 株 / 丛， 培养 60 天后， 每。

28、丛苗高 4 6cm， 根 长 3-4cm， 生根数 6 8 条 / 株 ； 培养条件 ： 白糖 20 克 / 升， 琼脂粉 4 克 / 升， PH 值 5.8 6.0， 培养温度 252， 光 照强度 1600 20001x， 光照时间 12 小时 / 天。 0020 假植培育 ： (1) 炼苗 ： 选取生根苗株高 3 5cm， 根长 3cm 以上， 将瓶苗置于荫蔽度 75的塑料大 棚内炼苗 20d， 苗瓶之间间隔 1 2cm， 通风透气， 控制好光照 ； (2)栽培基质 ： 杂木屑树皮屑腐质土(混合， 体积比)111， 假植前1-2d， 将 基质配比好， 均匀铺在苗床上， 苗床的标准(高80。

29、cm、 宽120cm、 长10m)， 用0.10.2高 锰酸钾等消毒液将基质淋透消毒处理， 基质厚度为 8 10cm， 下层 4cm 为粗基质， 上层 4cm 为细基质 ； (3) 移栽 ： 移栽时将瓶苗取出， 洗净根上附着的培养基， 用 0.05精甲、 咯菌腈 +0.1 百毒剂 +0.01硫酸铜混合液浸泡 10min， 捞起放在透气塑料筐中晾干至根部发白后移栽， 按 3 株 / 丛， 株行距 5cm5cm， 移栽时根基部与基质平， 根不能外露， 苗不能睡倒在基质上， 根据天气情况， 掌握浇水次数， 保持基质湿润， 控制好光照， 移栽 10d 后， 可结合浇水喷一些 低浓度叶面肥， 培育 60 90d 后即可出圃移栽 ； (4) 出圃 ： 将抽新根发新叶达到标准的苗， 轻轻拔起， 不要伤根， 按 10 丛 / 捆， 用 2cm 宽 说 明 书 CN 105309301 A 7 5/5 页 8 的报纸条缠紧， 整齐放进纸箱内， 标明出苗日期和数量。 说 明 书 CN 105309301 A 8 。