一种楸树的体外培养方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510443187.7 (22)申请日 2015.07.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105010143 A (43)申请公布日 2015.11.04 (73)专利权人 三峡大学 地址 443002 湖北省宜昌市大学路8号 (72)发明人 陈发菊 王玉宇 梁宏伟 王玉兵 王长兰 张德春 姚伟 (74)专利代理机构 宜昌市三峡专利事务所 42103 代理人 成钢 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) 审查员 王涛 (54)发明名。

2、称 一种楸树的体外培养方法 (57)摘要 一种楸树的体外培养方法包括1） 愈伤组织 的诱导： 将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈 伤组织； 愈伤组织诱导培养基是在1/2MS基本培 养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2, 4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)； 2） 愈伤组织的增殖： 将 愈伤组织置于增殖培养基上增殖； 增殖培养基是 在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌 呤(6-BA)和 -萘乙酸(NAA)； 3） 胚性愈伤组织的 诱导和体细胞胚胎的分化： 将增殖后的愈伤组织 置于诱导分化培养基上； 诱导分化培养基是在1/ 2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤 (6-B。

3、A)和 -萘乙酸(NAA)； 4） 植株再生： 将分化出 的体细胞胚胎置于再生培养基上诱导体胚萌发， 得到楸树再生植株。 本发明是为了扩大楸树的繁 殖系数， 为种质保存、 遗传转化提供条件。 权利要求书1页 说明书5页 附图11页 CN 105010143 B 2017.03.29 CN 105010143 B 1.一种楸树的体外培养方法， 其特征在于： 所述方法包括以下步骤： 1)愈伤组织的诱导： 以经灭菌的楸树为外植体， 外植体为未成熟的子叶胚， 将其置于愈 伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织； 所述愈伤组织诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基 础上添加了浓度为0.1mg/L6-苄基腺嘌呤(。

4、6-BA） 和浓度为1.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D)； 2)愈伤组织的增殖： 将愈伤组织置于增殖培养基上增殖； 所述增殖培养基是在1/2MS基 本培养基的基础上添加了浓度为1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和浓度为0.01mg/L的 -萘 乙酸 （NAA） ； 3)胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的分化： 将增殖后的愈伤组织置于分化诱导培养基 上诱导胚性愈伤组织， 在诱导培养基上继代培养诱导体细胞胚胎； 所述的诱导培养基是在 1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.2mg/L 的6-苄基嘌呤(6-BA)和浓度为0.05mg/L 的 -萘乙酸 （NAA） ； 4)植。

5、株再生： 将分化出的体细胞胚胎置于再生培养基上诱导体胚萌发， 得到楸树再生 苗； 所述植株再生培养基为1/2MS培养基。 2.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法， 其特征在于： 子叶胚进行灭菌的方 法为： 取楸树未成熟细长蒴果， 用75%酒精棉球擦拭消毒， 套剥去果皮， 然后用2% 的NaClO对 种子进行表面消毒4min,无菌水清洗， 4 环境下保存10小时以上； 再用2% 的NaClO浸泡 3min,无菌水清洗， 剥去种皮， 取出子叶胚作为外植体。 3.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法， 其特征在于： 所述步骤1） 的培养条件为： 温度252， 光照时间12-16h天， 。

6、光照强度2000- 2500lux； 步骤2） 的培养条件为： 温度252， 光照时间12-16h 天， 光照强度2000-2500lux； 步骤3） 的培养条件为： 温度252， 光照时间12-16h 天， 光照强度2000-2500lux。 4.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法， 其特征在于： 所述步骤1） 中愈伤组织的诱导时间为10-17天, 外植体成为长满浅绿色的愈伤组织； 步骤2） 中的增殖时间为30-60天, 浅绿色愈伤组织转变为黑色颗粒状愈伤组织； 步骤3） 中的诱导分化时间为60-90天, 黑色颗粒状愈伤组织分化产生浅黄色的胚性愈 伤组织； 步骤4） 中的植株再生培养。

7、时间为30天, 体细胞胚萌发生成再生苗。 5.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法， 其特征在于： 对步骤4） 中经再生培 养后得到的完整植株进行炼苗， 方法为： 待再生苗长出3-5片真叶时， 打开组培瓶盖， 使再生 植苗与空气接触， 在20-25下炼苗7-10天。 6.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法， 其特征在于： 所述楸树的体外培养 方法还包括移植， 待再生苗生长至5cm左右时， 将再生苗从培养瓶中移至缓冲间培养， 再将 再生苗移至培养室外常温培养， 再取出再生苗， 在流水下彻底清洗根部的培养基， 最后将再 生苗移至已灭菌培养基质中培养。 权 利 要 求 书 1/1 页 。

8、2 CN 105010143 B 2 一种楸树的体外培养方法 技术领域 0001 本发明涉及植物的体外培养方法， 特别是一种楸树的体外培养方法。 背景技术 0002 楸树(Catalpa bungei C. A. Mey)属紫葳科 （Bignoniaceae） 梓属 （Catalpa） 的高 大乔木， 是起源我国的乡土树种， 分布范围东起海滨， 西至甘肃， 南始云南， 北到长城的广 大区域内。 该树种适应性强， 分布广， 素有 “木王” 之称(王文采等 1990)。 树姿俊秀， 高大挺 拔， 花多盖冠， 其花形若钟， 红斑点缀白色花冠， 每至花期， 繁花满枝， 是我国历史上著名园 林观赏树种，。

9、 自古以来就种植于皇家庭院、 古刹寺庙和风景名胜等地， 同时楸树还是优良的 药用和用材树种， 具有很高的生态效益和经济效益。 此外， 楸树的环保性能较强， 可消声， 滞 尘， 有效吸收二氧化硫、 氯气等有毒气体。 因此提高楸树的种植面积和利用效益意义极其重 大。 0003 由于楸树木材具有诸多其它树种不可替代的优良特性， 加剧了人们对它的开发利 用， 自然分布面积不断缩小， 数量的急剧减少。 又因为楸树花而不实， 不同无性系经昆虫传 粉， 即使能结实， 结实量也很少(郭从俭 1988)。 实生繁殖困难， 自古以来人们一直延用 “取 傍生者植之” 的方法繁衍楸树， 代代相传形成了楸树的单一无性系。

10、， 使楸树的发展受到很大 限制。 目前楸树资源日趋减少， 已濒于 “临危植物” 的边缘， 亟待拯救。 楸树资源的大量毁灭， 给人们带来严重的不良后果。 当前已造成材种比例结构失调， 直接影响到国民经济建设和 人民的生产生活。 因此， 迅速恢复楸树生产， 大力发展楸树已成为林业生产的当务之急。 0004 楸树传统繁殖方法主要采用播种、 埋根、 嫁接、 扦插等方法。 而采用这些方法存在 实生苗生长周期长， 果实收集困难, 种子发芽率低, 出苗率不稳定等缺陷, 无法满足生产 和市场的需求(韩创举等 2006)。 因此,探索快速繁殖楸树的有效途径成为亟待解决的问 题。 组织培养具有需要材料量少、 繁殖。

11、快、 不受季节影响等特点， 是快速繁殖木本植物一个 重要方法。 近年来， 对于楸树的组织培养研究主要侧重于用幼嫩的茎尖、 带芽点的嫩茎做外 植体诱导腋芽(孟永红等 2004； 傅玉兰等 2009； 聂琳 2011)和不定芽(王军辉等 2011)。 主 要研究了培养基的种类、 植物生长调节剂的组合和配比、 碳源、 蔗糖浓度和琼脂浓度对腋芽 和不定芽的诱导影响。 杨燕(杨燕 2008)， Lin juan (Lin et al. 2010)等探究了不同的激 素浓度和不同的外植体对楸树愈伤组织的影响。 于永明(于永明等 2012)等报道基因型也 是楸树腋芽诱导、 增殖和生根的主要影响因素。 但楸树体。

12、细胞胚胎发生的研究还未见报道， 因此建立稳定高频率发生楸树体细胞胚胎再生体系， 为楸树的生物技术育种、 种质资源保 存、 快速繁殖、 遗传转化、 人为控制楸树的生长发育研究提供良好的实验体， 具有十分重要 的作用。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种利用楸树体细胞胚胎进行体外培养的方法， 其方法的培 育周期在 天左右、 再生植株成活率达到85%以上。 说 明 书 1/5 页 3 CN 105010143 B 3 0006 为解决上述技术问题， 本发明采取以下技术方案： 楸树的体外培养方法， 包括以下 步骤： 0007 1)愈伤组织的诱导： 以经灭菌的楸树为外植体， 将其置于愈伤组织诱导。

13、培养基上 诱导愈伤组织； 所述愈伤组织诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺 嘌呤(6-BA） 和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)； 0008 2)愈伤组织的增殖： 将愈伤组织置于增殖培养基上增殖； 所述增殖培养基是在1/ 2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0-2.0 mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和浓度为0- 0.1mg/L的 -萘乙酸 （NAA） ； 0009 3)胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的分化： 将增殖后的愈伤组织置于分化诱导培 养基上诱导胚性愈伤组织， 在诱导培养基上继代培养诱导体细胞胚胎； 所述的诱导培养基 是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度。

14、为0-1.0 mg/L 的6-苄基嘌呤(6-BA)和浓度为 0-0.1 mg/L 的 -萘乙酸 （NAA） ； 0010 4)植株再生： 将分化出的体细胞胚胎置于再生培养基上诱导体胚萌发， 得到楸树 再生苗； 所述植株再生培养基为1/2MS培养基。 0011 进一步讲， 所述步骤1） 中的外植体为未成熟的子叶胚。 0012 进一步讲， 所述方法步骤1） 中愈伤组织诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为 0-2.0 mg/L， 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度为0-2.0 mg/L。 0013 进一步讲， 所述步骤1） 中愈伤组织诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为 0.1。

15、mg/L， 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度为1.0 mg/L。 0014 进一步讲， 所述方法步骤2） 增殖培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为1.0mg/L， - 萘乙酸 （NAA） 的浓度为 0.01mg/L； 0015 所述方法步骤3） 分化诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为0.2mg/L， -萘乙 酸 （NAA） 的浓度为0.05mg /L。 0016 进一步讲， 未成熟子叶胚进行灭菌的方法为： 取楸树未成熟细长蒴果， 用75%酒精 棉球擦拭消毒， 套剥去果皮， 然后用2% 的NaClO对种子进行表面消毒4min,无菌水清洗， 4 环境下保存10小时以上； 再用。

16、2% 的NaClO浸泡3min,无菌水清洗,剥去种皮， 取出子叶胚作 为外植体。 0017 进一步讲， 所述步骤1） 的培养条件为： 温度252， 光照时间12-16h 天， 光照强 度2000-2500lux； 0018 步骤2） 的培养条件为： 温度252， 光照时间12-16h天， 光照强度2000- 2500lux； 0019 步骤3） 的培养条件为： 温度252， 光照时间12-16h天， 光照强度2000- 2500lux。 0020 进一步讲,所述步骤1） 中愈伤组织的诱导时间为10-17天, 外植体成为长满浅绿 色的愈伤组织； 0021 步骤2） 中的增殖时间为30-60天, 。

17、浅绿色愈伤组织逐渐转变为黑色颗粒状愈伤组 织； 0022 步骤3） 中的诱导分化时间为60-90天, 黑色颗粒状愈伤组织分化生成浅黄色的胚 性愈伤组织； 说 明 书 2/5 页 4 CN 105010143 B 4 0023 步骤4） 中的再生培养时间为30天, 体细胞胚萌发生成再生苗。 0024 进一步讲， 对步骤4） 中经再生培养后得到的完整植株进行炼苗， 方法为： 待再生苗 长出3-5片真叶时， 逐步打开组培瓶盖， 使再生植苗与空气接触， 在20-25下炼苗7-10天。 0025 进一步讲， 所述楸树的体外培养方法还包括移植， 待再生苗生长至5cm左右时， 将 再生苗从培养瓶中移至缓冲间。

18、培养， 再将再生苗移至培养室外常温培养， 再取出再生苗， 在 流水下彻底清洗根部的培养基， 最后将再生苗移至已灭菌培养基质中培养。 0026 本发明提供了楸树的一种体外培养方法。 该方法是利用未成熟子叶胚及其它类似 材料作为外植体， 通过胚性愈伤组织诱导途径得到再生植株。 以子叶胚为外植体进行离体 再生的优势在于取材方便、 可提供的材料充足。 用该方法可高频率地诱导出大量的楸树体 细胞胚胎， 再生植株成活率高， 可达85， 而且具有再生植株变异小和遗传稳定性较高的优 点。 本发明为扩大楸树的繁殖系数、 该物种的种质保存及其遗传转化奠定了良好的基础， 应 用前景广阔。 附图说明 0027 图1为。

19、未成熟子叶胚诱导的愈伤组织。 0028 图2为增殖后的黑色颗粒状愈伤组织。 0029 图3为胚性愈伤组织。 0030 图4为显微镜下观察到的球形胚。 0031 图5为显微镜下观察到的心形胚。 0032 图6为显微镜下观察到的鱼雷胚。 0033 图7为显微镜下观察到的子叶胚。 0034 图8为胚状体。 0035 图9为体细胞胚萌发的小植株。 0036 图10为炼苗成活的再生植株。 0037 图11为本发明方法步骤。 具体实施方式 0038 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 0039 1/2MS基本培养基： 可参照文献 （Murashige T, Skoog F. A revised。

20、 medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 1962, 15: 473-497） 配制， 仅将大量元素减为原来的一半。 0040 如图11中， 楸树的体外培养方法主要内容如下， 灭菌愈伤组织的诱导愈 伤组织的增殖胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的分化植株再生移植， 并以未 成熟的子叶胚为外植体具体实施如下： 0041 1)子叶胚的灭菌 0042 取楸树未成熟细长蒴果， 用75%酒精棉球擦拭消毒2-3遍， 进入无菌操作台用75%的 酒精棉球再擦拭消毒2-3遍， 戴上无菌手套剥。

21、去果皮， 然后用2% 的NaClO对种子进行表面消 毒4min,无菌水清洗5次， 4 过夜(时间不少于10小时)； 再用2% 的NaClO浸泡3min,无菌水 清洗5次。 戴上无菌手套剥去种皮， 取出子叶胚作为外植体。 说 明 书 3/5 页 5 CN 105010143 B 5 0043 2） 愈伤组织的诱导及含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D)组合的愈伤组织诱导培养基的诱导效果比较。 0044 愈伤组织诱导培养基： 在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0-2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 0-2.0mg/。

22、L。 0045 以步骤1） 获得的经灭菌的未成熟子叶胚为外植体， 将其置于上述含有不同浓度6- 苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的愈伤组织诱导培养基 （每个培养瓶 中接种20粒， 每个组合接种5瓶， 重复3次） 上， 在温度252， 光照时间12-16h 天， 光照强 度2000-2500lux下诱导愈伤组织， 并对含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧 乙酸(2,4-D)组合的愈伤组织诱导培养基的诱导效果进行比较。 0046 结果在含不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的MS培 养基上的子叶胚外植体均能产生。

23、愈伤， 接种后第5天， 未成熟子叶胚中部膨胀， 子叶胚中部 膨胀， 表面开始变得模糊， 有少量浅绿色的愈伤组织出现， 接种8天后， 外植体长满浅绿色 愈伤组织， 整体变大图1。 培养15 d后各组合培养基上愈伤组织的诱导率均较高， 其中在 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 1.0mg/L, 6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0.1mg/L培养基上， 诱导率最 高达到90%； 在只含6-苄基腺嘌呤(6-BA) (0-2.0mg/L)的培养基上诱导率最低， 接近于0， 在 只含有2,4-二氯苯氧乙酸(0-2.0mg/L)的培养基上诱导率也偏低， 最高只达到 78%， 表明在 楸树的愈伤组织诱导过程中2。

24、,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄基腺嘌呤(6-BA)是必须的， 只有在2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄基腺嘌呤(6-BA)达到一定的比例时能提高愈伤组 织的诱导率。 因此将愈伤组织诱导培养基定为： 在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基 腺嘌呤(6-BA) 0-2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 0-2.0mg/L。 0047 3)愈伤组织的增殖及含有不同浓度的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和 -萘乙酸 （NAA） ， 6- 苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的培养基对愈伤组织增殖的效果比 较。 0048 将在不同浓度的2,4-二。

25、氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄基腺嘌呤(6-BA)的组合培养基 上诱导的部分愈伤组织转置添加6-苄基腺嘌呤(6-BA) （0-1.0mg/L） 和 -萘乙酸 （NAA） (0- 0.1mg/L)的培养基上进行增殖。 部分愈伤组织会大量增殖， 形态没有发生明显变化， 但颜色 会逐渐加深呈棕色， 另外部分的愈伤组织生长较慢， 颜色逐渐褐化。 45天之后， 只有在6-苄 基腺嘌呤(6-BA)和 -萘乙酸 （NAA） 的组合培养基上有黑色颗粒状的愈伤出现(图2)， 在6-苄 基腺嘌呤(6-BA)1.0mg/L和 -萘乙酸 （NAA） 0.01mg/L的培养基中黑色颗粒状愈伤(褐化愈伤 组织生成黑色颗。

26、粒状愈伤)最多, 在6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.9mg/L和-萘乙酸 （NAA） 0.07mg/L的培养基中黑色颗粒状愈伤(褐化愈伤组织生成黑色颗粒状愈伤)次之， 在只有2, 4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的培养基无黑色颗粒状愈伤产生。 0049 4） 体细胞胚的分化及含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和 -萘乙酸 （NAA） 组合的 分化培养基的诱导分化效果比较 0050 分化培养基： 在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0-1.0mg/ L和 -萘乙酸 （NAA） 0-0.1mg/L。 0051 将步骤3)获得的愈伤组织转置不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA。

27、)和 -萘乙酸 （NAA） 组 合的培养基， 在温度252， 光照时间12-16h 天， 光照强度2000-2500lux下诱导分化， 并 对含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和 -萘乙酸 （NAA） 组合的分化培养基的诱导分化效果 说 明 书 4/5 页 6 CN 105010143 B 6 进行比较。 0052 结果45天之后只有黑色的颗粒状愈伤组织在上述含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6- BA)和 -萘乙酸 （NAA） 组合的培养基上有浅黄色的胚性愈伤组织的产生(图3)， 说明在愈伤 组织的增殖阶段合适的培养基为6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1.0mg/L， -萘乙酸 （NAA） 0.0。

28、1mg/ L， 愈伤长期在含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的培养基上培养对胚性愈伤组织的诱导有阻 碍作用。 其中， 颗粒状的黑色愈伤组织在含6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0.2mg/L和 -萘乙酸(NAA) 0.05mg/L的1/2MS培养基上， 诱导率最高， 在含6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0.23mg/L和 -萘乙酸 (NAA) 0.06mg/L的1/2MS培养基上， 诱导率次之,继代30天后， 浅黄色胚性愈伤组织的体积 是转接时的100倍以上， 随后， 进一步发育成球形胚(图4)、 心形胚(图5)、 鱼雷胚(图6)和子 叶胚(图7)， 据统计， 每0.5g的胚性愈伤组织中含有1000。

29、个以上的胚状体(图8)， 继续培养， 产生大量体细胞胚。 0053 5） 植株再生 0054 再生培养基： 1/2 MS培养基 （大量元素为MS基本培养基全量的1/2） 0055 将步骤3） 获得的已经长出两片子叶的子叶期胚转接到1/2 MS培养基上在温度25 2， 光照时间12-16h 天， 光照强度2000-2500lux下诱导萌发， 茎端和根端同时发育， 最 后发育成完整植株(图9)。 0056 6） 炼苗和移栽 0057 先将步骤5） 中经生根培养后得到的再生植株进行炼苗， 移植。 炼苗方法为： 待再生 苗长出3-5片真叶时， 将再生苗从培养瓶中移至缓冲间培养， 逐步打开组培瓶盖， 使。

30、再生植 苗与空气接触， 在20-25下炼苗7天； 再将再生苗从缓冲间中移至培养室外常温下炼苗培 养7天左右。 0058 再取出再生苗， 在流水下彻底清洗根部的培养基， 最后将幼苗移至装有已灭菌培 养基质(腐殖土： 珍珠岩=1： 1)的花盆中， 浇透水置于温棚中培养(图10)。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105010143 B 7 图1 说 明 书 附 图 1/11 页 8 CN 105010143 B 8 图2 说 明 书 附 图 2/11 页 9 CN 105010143 B 9 图3 说 明 书 附 图 3/11 页 10 CN 105010143 B 10 图4 说 明 书 附 。

31、图 4/11 页 11 CN 105010143 B 11 图5 说 明 书 附 图 5/11 页 12 CN 105010143 B 12 图6 说 明 书 附 图 6/11 页 13 CN 105010143 B 13 图7 说 明 书 附 图 7/11 页 14 CN 105010143 B 14 图8 说 明 书 附 图 8/11 页 15 CN 105010143 B 15 图9 说 明 书 附 图 9/11 页 16 CN 105010143 B 16 图10 说 明 书 附 图 10/11 页 17 CN 105010143 B 17 图11 说 明 书 附 图 11/11 页 18 CN 105010143 B 18 。