技术领域
本发明涉及生物技术和作物育种领域，特指基于组织培养且结合高浓度 2，4-D处理的体细胞无性系筛选育种的方法。
背景技术
基因突变在生物界中广泛存在。其中，自发突变是指自然条件下发生的突变， 是生物变异的重要来源，也是自然进化的基础。无论是低等生物，还是高等动植 物及人类，都可能发生自然突变。自发突变为人类提供了极有价值的育种材料。 例如在水稻育种中，上世纪60年代水稻矮杆突变的发现揭开了矮化育种的序幕； 细胞质雄性不育株的发现使水稻三系法杂种优势的利用成为现实；而光(温)敏 核不育水稻的发现则为采用两系法利用水稻亚种间的杂种优势铺平了道路，从而 降低了杂交育种的成本。然而自发突变的频率是很低的，在高等生物中，大约 10万个到1亿个生殖细胞中才会有一个生殖细胞发生突变，突变频率是10-5～ 10-8，且许多突变细胞通过表型无法鉴定而丢失，很难进行系统收集。通过自发 突变育种是一个极其漫长的过程，而且还需要一定的运气和机遇，因此，该方法 在作物育种中受到了极大的限制，只能是可遇而不可求。
随着分子生物学的不断发展，基因的克隆和转化已是一种常规的生物技术手 段，通过基因枪的轰击和农杆菌的介导等方法已成功地在单双子叶植物中进行了 基因的转化，并筛选培养出了许多转基因作物品种。然而在转基因过程中，转入 了一种外源的选择标记基因，如抗抗生素基因和抗除草剂基因等，使转基因作物 存在着一种潜在的风险，引起了人们极大的关注。为了不使这种选择抗性标记基 因在自然环境中扩散开来，国家和政府制定了较为严格的审查程序，须经多年的 审查方可在大田释放和推广。加之现在有些消费者担心转基因食品带来的潜在危 害，从而对转基因作物及其产品加以抵制。因此，转基因技术在作物育种中也受 到了一定的限制。
上个世纪遗传学上最重要的发现之一就是突变能够被诱发。利用物理因素、 化学药剂、太空射线以及组织培养等方法可以诱导生物发生突变。物理诱变和化 学诱变虽然是稳定高效的诱变方式，但往往造成多个基因的突变，从而导致多个 性状发生改变，甚至使无性系亲本的某些优良性状丢失，而且后代稳定慢。体细 胞无性系在培养过程中常常发生基因突变，变异体基本保持源品种的优良特性， 多数为单基因变异，后代稳定快。但是，通过组织培养的体细胞变异，其变异频 率随培养时间延长而提高，而且随着培养时间的延长，其愈伤组织的分化频率也 急剧下降，往往导致再生苗分化的极度困难。因此，寻找一种愈伤组织诱变处理 比较温和，而且有较高的分化频率，并能保持原无性系亲本的许多优良农艺性状 且后代稳定较快的新型育种方法显得极为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱变效率高，愈伤组织的分化频率高，育种周期短， 且不具有任何潜在风险的简便易行的新型水稻育种方法。
植物体细胞无性系在组织培养过程中，其染色体会发生断裂和重排以及DNA 的甲基化，也可导致点突变和转座元素的激活跳跃。因此，通过组织培养可以激 发染色体DNA的断裂和重排，以及激活内源转座子或反转录转座子的跳跃插入， 从而提高突变频率。组织培养的体细胞变异频率随培养时间的延长而提高。但是 随着培养时间的延长，其愈伤组织的分化频率也急剧下降，往往导致再生苗分化 的极度困难。在组织培养过程中，通过提高继代培养基中的2，4-D浓度，可提高 无性系的变异频率，并缩短了培养时间。因此，以高浓度2，4-D继代诱变胚性愈 伤组织1个周期(约25天)后，显著提高了诱变频率和分化频率，再结合一定 的选择压力对细胞突变体进行筛选可实现一定程度的定向诱变，从而提高了诱变 效率，缩短了育种周期。
本发明的目的是通过下述方法实现的：
水稻体细胞无性系在组织培养过程中，提高继代培养基中2，4-D(2，4-二氯 苯氧乙酸)浓度进行继代诱变处理，使体细胞突变，再结合在低温、高温、高盐、 病虫害的选择压力下对突变体进行筛选，实现无性系筛选育种。
所述的提高继代培养基中2，4-D浓度进行继代诱变处理则是指胚性愈伤组 织于基本培养基MS+2，4-D 3.5-4.5mg/L培养基中继代培养1个周期后，以24-26 天为1个培养周期；再转移至正常的继代培养基中培养。其中诱变处理最优的 2，4-D浓度为4mg/L。
所述的胚性愈伤组织为继代2-3个周期的胚性愈伤组织。
本发明以水稻的幼穗和成熟胚为外植体，在培养基中进行正常的愈伤组织的 诱导、继代，再经高浓度2，4-D的MS培养基继代诱变，再转移至正常的继代培 养基中培养，然后于分化培养基中进行分化及再生苗的生根。同时在培养基中离 体培养过程中或再生苗在大田栽培过程中结合一定的选择压力以获得所需农艺 性状的突变株。
经诱变得到的体细胞突变体根据需要采取不同的选择压力(如高温、低温、 高盐、病虫害等)进行筛选，可实现一定程度的定向诱变。该筛选过程可在离体 培养中进行，也可在大田栽培中进行。
体细胞突变体R1代经一定的选择压力筛选后，于抽穗期套袋自交结实，并 将符合目标性状的变异株分单株采种。然后在相同选择压力下对R2，R3代再进 行筛选，直至筛选到符合目标性状且性状不再分离的变异株为止。该变异株即为 体细胞无性系诱变得到的品种。
本发明以高浓度2，4-D诱变处理继代2-3个周期的胚性愈伤组织即可达到本 发明目的。在作物育种中，利用这种方法诱导作物发生突变，并结合一定的选择 压力进行筛选，从而加速了育种进程，同时也避免了因引入外源抗性标记基因所 带来的风险。
本发明方法具有操作简便，诱变效率高，突变后代性状稳定快，并且不需要 象转基因技术那样的昂贵的仪器设备，也因没有引入外源基因而没有任何潜在的 环境及生态风险等优点。针对不同的作物品种，只需将诱导、继代、分化和生根 培养基的激素浓度稍加改变，即可以通过本发明方法能快速高效地诱变出新的具 有优良农艺性状的作物品种。因此，本发明方法在作物育种及农业生产上具有十 分广泛的应用前景。
通过本发明方法，我们以新型两系温敏核不育系株1S的幼穗和成熟胚诱导 出了愈伤组织，再以高浓度2，4-D进行继代诱变，然后对诱变后的愈伤组织进行 分化和生根培养获得了再生植株。经过田间的筛选鉴定，于R3代就获得性状稳 定的矮杆突变株SV14S，而且还保留了株1S所具有的其它优良农艺性状。同时， 通过本发明方法我们以三系保持系中9B的幼穗诱导的愈伤组织，经高浓度2，4-D 进行继代诱变处理后，然后经继代、分化和生根培养，获得再生植株，并经过田 间的筛选鉴定，于R4获得了性状优良且稳定的突变株。
通过我们一系列的实验证实，本发明方法是十分简便可靠的，它具有诱导效 率高，后代稳定快，在作物育种中具有很好的应用前景。
本发明的优点在于：
1.本发明方法所需的组织培养技术是一种应用广泛的生物技术手段，且其 成本低，技术要求不高，易于使用者掌握及该方法的推广。
2.在提高诱导效率中所使用的2，4-D价廉易购，而且在使用中操作简便， 不需要昂贵的仪器设备和较高的技术要求。
3.由于没有外源基因的导入，因而也没有转基因作物所具有的潜在的生态 环境安全和食品健康安全等问题。通过此发明方法，一旦获得具有优良性状的突 变品种，就能很快获准大田释放和推广。
4.体细胞无性系经高浓度2，4-D的继代诱变处理可大幅度提高变异频率和 诱导效率，同时又能很大程度地保留源作物品种的优良性状，再结合一定的选择 压力可实现一定程度的诱发突变，从而大大缩短育种周期。一般来说，诱变突变 体只需经3代左右筛选即可定型。
附图说明
图1为幼穗诱导出的愈伤组织。
图2为成熟胚诱导出的愈伤组织。
图3为继代时间对绿苗分化频的影响。
图4为分化培养图。
图5为SV14S和株1S的田间表型。
具体实施方式
以下实施系列旨在说明本发明而不是对本发明做限制。
实施例
1.材料
于田间采集花粉母细胞形成期的幼穗立即用于接种培养或储存于4℃的冰箱 中备用。若以成熟胚为外植体，则应选取活力较强(于4℃储存不超过3年)饱 满无霉变的种子。
2.培养基及培养条件
选用MS为基本培养基，蔗糖浓度为3％，用0.7％的琼脂固化，pH为5.8～6.2， 在121℃湿热高压灭菌20min，在不同发育阶段添加不同的激素(见表1)。培养 温度为25±1℃，光照强度为2000lx，光照时间为12小时/天。
表1.培养基种类与成分 培养基的种类 成分 诱导培养基 继代培养基 分化培养基 生根培养基 MS+2，4-D 2mg/L MS+6-BA 0.2mg/L+2，4-D 2mg/L MS+6-BA 2mg/L MS+IAA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L
注：2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；6-BA(6-苄基腺嘌呤)；IAA(吲哚-3- 乙酸)；NAA(α-萘乙酸)
3、愈伤组织的诱导
将幼穗外层叶片剥去，留旗叶鞘，置于70％酒精中浸泡1～2min，再置于0.1％ HgCl2中灭菌7～10min。在超净工作台上用无菌水冲洗3～5次，除去旗叶鞘， 将幼穗切成1cm左右的小段，接种于诱导培养基中以获得愈伤组织(图1)。若以 成熟胚为外植体，则将水稻种子剥去颖壳，先用70％酒精浸泡1～2min，再置于 0.1％HgCl2中灭菌7～10min，在超净工作台上用无菌水冲洗3~5次，接种于诱 导培养基中以获得愈伤组织(图2)。
4.愈伤组织的继代培养
以25天为一个培养周期，挑取颜色淡黄，质地致密的胚性愈伤组织于继代 培养基进行继代培养。通过组织培养的体细胞变异，其变异频率随培养时间延长 而提高。但是随着培养时间的延长，其愈伤组织的分化频率也急剧下降(见图3)。 因此，为了保持较高的分化频率，我们以继代2-3个周期的胚性愈伤组织来进行 高浓度2，4-D的诱变处理。
5.高浓度2，4-D的诱变处理
将诱导得到的愈伤组织经继代培养2-3个周期后，选取淡黄色，质地致密的 胚性愈伤组织培养于MS+2，4-D 4mg/L培养基中培养1个周期(约25天)。高浓 度2，4-D的诱变处理只能是1个培养周期左右，若处理时间过长，愈伤组织的分 化频率则显著降低，甚至褐化坏死。1个周期后，再选取淡黄色致密的愈伤组织 转移至正常的继代培养基培养1个周期。
6.愈伤组织的分化培养
挑取经正常的继代培养基培养1个周期后的淡黄色、质地致密的胚性愈伤组 织于分化培养基进行分化培养(图4)。对于继代次数较多且较难分化的愈伤组 织，当愈伤组织显绿后可作适当的干燥处理以促进分化。
7.分化苗的生根培养
将分化苗培养于生根培养基中诱导生根。大约1周左右就有大量的不定根长 出。
8.练苗移栽
将生根后的水稻苗于栽种前20天左右移出培养室，揭去三角瓶的封口膜， 往三角瓶中加入少量水覆培养基以防霉菌生长。这样练苗一个星期后，即可移栽 于大田，移栽后一周内注意保温和遮阳，避免阳光直射，待生根定植后即可按常 规方法管理。
9.突变体的筛选
将R1代再生苗经练苗后分株系移栽于大田中，再根据需要采取不同的选择 压力(如高温、低温、高盐、病虫害等)进行筛选，抽穗期套袋使其自交结实。 将符合目标性状的变异株分单株采种。将R2代按株行再种于大田中，于各生长 发育时期考查其主要农艺性状，对于符合目标性状而其它优良农艺性状不发生改 变的株系再采种。再将R3代按株行种于大田，对其目标性状和其它优良农艺性 状进行考查，若其性状得以稳定，则该突变株系即是我们所需的优良诱变品种。 若是性状还不稳定，则仍需进行R4、R5代筛选，直至性状稳定。一般来说经筛 选至R3代后性状已经保持稳定了。
通过本实施例，我们从株1S的愈伤组织中经高浓度2.，4-D诱变后筛选到了 一系列矮杆温敏核不育系(见表2)，其中SV14S的株高较矮而其它优良农艺性 状基本不变，是一个优良的矮化温敏雄性核不育品种(图5)。同时，通过本实施 例我们以三系保持系中9B的幼穗诱导的愈伤组织，经高浓度2，4-D进行继代诱 变处理后，然后经继代、分化和生根培养，获得再生植株，并经过田间的筛选鉴 定，于R4获得了性状优良且稳定的突变株SV9B。目前，其性状正在田间做进一 步的鉴定。
表2.体细胞变异系(R3)株高考察统计结果 品系名 统计项 株高 节间长度(穗颈下) 穗长 I II III IV V 株1S SV5S SV10S SV14S 平均值 变异系数 平均值 变异系数 平均值 变异系数 平均值 69.3±4.21 6.1 42.9±0.96 47.3±2.15 4.5 44.8±1.96 19.5±2.15 11.0 11.99±1.19 9.9 12.7±1.62 12.7 11.9±2.24 14.3±1.22 8.5 8.2±0.85 10.4 8.98±0.62 6.9 9.0±0.67 11.5±1.37 11.9 5.5±0.59 10.8 5.57±0.72 12.9 5.9±1.05 5.7±1.97 34.6 2.7±0.99 36.1 2.4±0.8l 33.5 2.13±0.92 0.45±0.52 115.6 0.7±0.52 73.6 0.48±0.46 94.5 0.35±0.24 16.8±1.13 6.7 13.8±0.87 6.3 1595±1.77 11.1 15.51±1.71 变异系数 4.4 18.8 7.4 17.8 41.4 70.2 12.0