技术领域
本发明涉及一种棉花品种对棉蚜的抗性鉴定方法，尤其是一种以 人工网室为鉴定场所的棉花品种抗棉蚜鉴定改良方法，属于植物抗虫 育种及抗虫性鉴定方法领域。
背景技术
棉蚜、棉铃虫、棉红铃虫和棉叶螨是棉花的四大害虫。在棉花栽 培过程中，虽然一直存在着棉蚜的危害，但对棉花危害最重、影响产 量和品质明显的有三个时期，即：苗期、蕾铃期和吐絮期，其中以苗 期的危害影响最大。棉花苗期受棉蚜侵害后，叶片卷曲呈球形，出现 枯斑逐渐失去光合作用功能，严重导致棉苗枯萎甚至死苗。
二十世纪七十年代以来，世界各主要产棉国相继开展棉花抗虫育 种，从抗性资源筛选、抗虫新品种选育、抗虫性鉴定方法、抗性机理、 抗性遗传和虫害发生规律等方面着手研究，取得了显著进展。
建立年份间重复性好的抗虫鉴定方法是棉花抗虫育种的前提条 件。“七五”期间国家设立“棉花抗虫育种”攻关项目，经过反复试 验研究，建立了棉花对四大靶标害虫的抗虫性鉴定方法。其中“棉花 品种对棉蚜的抗性鉴定方法”由中国农业科学院棉花研究所(1983) 建立，随后该单位(1989)对这一鉴定方法进行了校正。该鉴定技术 体系以大田为鉴定场所，利用自然虫源进行抗棉蚜鉴定。在承担江苏 省“九五”农业科技重点攻关项目“转基因抗蚜虫棉花新种质的培育” 期间，江苏省农业科学院经济作物研究所建立了“棉花温室内单株抗 蚜性鉴定方法”。该鉴定方法以温室为鉴定场所，采用人工接蚜途径 进行抗虫鉴定。
本专利申请的发明人在长期棉花抗虫育种实践中发现，利用自然 发生的虫源进行大田抗蚜鉴定，棉蚜的发生动态易受环境条件的影 响，高温干旱年份棉蚜发生重，抗棉蚜品种可能被淘汰，低温多雨年 份棉蚜发生轻，感棉蚜品种可能误入抗蚜类型；同时大田棉蚜的发生 地点和发生量也是随机的，无法实现区组内处理的一致性，因此在大 田进行抗蚜鉴定具有较大的盲目性。而冬季在温室内进行抗蚜鉴定， 由于水泥池的面积小，供试品种的数量有限，存在规模小、虫源繁殖 保存困难的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于：针对大田抗蚜鉴定和温室抗蚜鉴定存在的问 题，建立一种年份间重复性好的棉花品种人工网室抗棉蚜鉴定方法， 从而提高棉花品种抗蚜鉴定的准确率和可靠性。
经过反复试验和比较，本专利申请的发明人发现，传统棉花品种 抗棉蚜鉴定方法存在上述问题的原因主要有：
1、鉴定场所不适宜。大田鉴定是在自然条件下进行的，尽管试 验规模不受限制，但棉蚜的发生量易受环境因素的影响，这些因素包 括降雨、气温、天敌和其它害虫等。温室鉴定一般在秋冬季进行，温 室规模小，供试品种数量受到限制，并且棉蚜的繁殖与保存比较繁琐。 根据供试品种的数量确定试验规模，在试验田建立人工网室，利用塑 料薄膜的增温作用和尼龙网的隔离作用，可以克服大田鉴定和温室鉴 定存在的问题。
2、缺乏简便、高效、高度一致的接虫途径。大田鉴定以棉蚜的 自然发生作为接虫途径，无需人工接种棉蚜，但在试验区内棉蚜的发 生具有很大的随机性，无法保证同一区组内各供试品种接蚜处理的一 致性。温室鉴定采用人工接蚜，接虫处理繁琐，当供试的品种数量少 时，能够保持处理的一致性，但当供试的品种较多时，不同操作人员 将无法保证处理的一致性。在人工网室内首先种植常规品种繁殖棉 蚜，当单株蚜量达到200头左右时，将供试品种3叶期棉苗移栽到人 工网室，采用繁殖行间自然传播棉蚜进行接蚜处理，不仅省略了接虫 环节，而且可以实现接蚜处理的一致性。
3、鉴定方法不完善。传统抗蚜鉴定以非洲E-40为对照品种，而 该品系是1个抗棉蚜材料，以它为对照，计算所得的供试品种蚜害指 数减退率(D)不能真实地反映供试品种的抗性水平；传统抗蚜鉴定 在苗蚜期、恢复期、伏蚜期具有不同的分级标准，但棉蚜对棉花危害 最严重的时期是苗蚜期，因而该阶段的鉴定结果能够反映整体水平， 棉花品种对棉蚜的抗性分级标准必须修订。尤其是转外源凝集素基因 棉花的抗棉蚜鉴定，只有以受体品种为对照，才能正确评价转基因材 料的抗蚜水平。以常规品种为对照，根据供试品种的蚜害指数较对照 的减退率，建立抗性分级标准，并确定供试品种的抗性水平。
在分析了传统棉花品种抗棉蚜鉴定方法存在问题及产生原因的 基础上，形成了本发明的技术体系——棉花品种人工网室抗棉蚜鉴定 方法，该方法包括以下步骤：
1)、建立人工网室——选择排灌方便地块，按设定面积搭建框架 后，罩上网罩，覆盖薄膜；通常标准网室设定为180m2(30m×6m)， 每个供试品种占地26.67m2，框架主体为塑钢结构，顶部为半椭圆形， 在钢架外侧先罩上尼龙网，在尼龙网的外表覆盖厚度为1mm的塑料薄 膜，在人工网室的两端各设立一个2m×1m矩形结构门。
2)、冬耕杀虫——冬季耕翻人工网室内的土壤，使耕作层内的越 冬虫蛹暴露在土壤表面，利用低温冻害杀死虫卵，以确保第二年人工 网室内无其它害虫及棉蚜天敌的发生。
3)、建立棉蚜繁殖行——开春后，在人工网室内种植非抗蚜棉品 种，行距1米左右(0.8-1.2米)，作为棉蚜繁殖行，待第二片真叶 展平后，取保存棉蚜的棉株叶片，按单株接蚜量标准(通常40头)， 采用搭叶接混合蚜的方式，对棉蚜繁殖行进行接蚜。
4)、接虫处理——对供试品种及对照品种育苗，待棉苗普遍达到 3叶期时，以预定移栽分布规律，将供试品种及对照品种棉苗分别栽 入人工网室内的两个棉蚜繁殖行之间，(此时棉蚜繁殖行中的棉苗因 受棉蚜的危害，生长发育停滞，子叶和两片真叶卷曲呈球形，并发黄 变枯，无新生叶出现，由于原来寄主缺乏营养物质，棉蚜由无翅蚜蜕 变为有翅蚜，随即趋近迁飞到供试品种的棉株上，)实现棉蚜繁殖行 间栽种供试品种的接虫；通常采用营养钵育苗，预定移栽分布规律为 每个品种移栽10行，每行10棵。
5)、调查蚜害级别——分别于苗蚜发生高峰期(通常为5叶期)、 苗蚜危害恢复期(通常为7叶期)、伏蚜期及秋蚜期调查供试品种棉 花蚜害级别，鉴定各参试品种对棉蚜的抗性，以常规品种为对照，计 算蚜害指数及其比对照减退率；通常调查时随机抽样40株，苗蚜期 调查以全株受害最重叶片为标准叶，其它时期均以棉株顶部5叶中受 害最重叶片为标准叶。
6)、确定抗性水平——根据各供试品种的蚜害指数比对照减退率， 建立棉花品种对棉蚜的抗性分级标准，确定其对棉蚜的抗性水平。
本专利申请人所在的课题组经过反复实践，大量的实验结果证明 采用本发明的技术方案后，可以有效地排除环境条件包括生物和非生 物因素的干扰，克服棉蚜发生的随机性，省略人工接蚜环节，能够真 实地反映供试品种的抗性水平，从而显著提高棉花品种对棉蚜抗性鉴 定的准确性和可重复性。
由于本发明突破了传统抗棉蚜鉴定的禁锢，通过对整个鉴定方法 体系每个环节的统盘优化，采用人工网室为鉴定场所、棉蚜繁殖行间 自然传蚜为接虫途径、以常规品种为对照等一系列改进技术措施，因 而与现有的鉴定方法相比，能够显著提高抗棉蚜鉴定的准确性。
以下为分别利用大田鉴定和人工网室鉴定对两个具有形态抗性 品种川抗77、川棉109连续3年(2002-2004年)苗蚜期抗棉蚜鉴定 结果。2002、2004年苗期干旱，2003年苗期多雨。由此可知，3年 大田鉴定的结果不一致，在严重干旱的2004年川抗77、川棉109表 现感蚜；在较干旱的2002年川抗77表现中抗棉蚜，川棉109表现感 蚜；在多雨的2003年川抗77表现抗蚜，川棉109表现中抗棉蚜。而 连续3年人工网室的鉴定结果高度一致，反映了品种原有的特性，即 川抗77在整个生育期表现中抗棉蚜，川棉109苗期感蚜，蕾铃期及 吐絮期中抗棉蚜。 品种鉴定方法 大田鉴定 人工网室鉴定 蚜指 减退率％ 抗级 蚜指 减退率％ 抗级 川抗77(2002) 56.26 22.57 MR 55.48 21.33 MR 川棉109(2002) 60.84 16.27 S 58.96 16.39 S 苏棉12号(2002) 72.66 / / 70.52 / / 川抗77(2003) 18.70 57.37 R 53.45 23.76 MR 川棉109(2003) 32.08 26.87 MR 57.62 17.82 S 苏棉12号(2003) 43.87 / / 70.11 / / 川抗77(2004) 65.45 16.66 S 55.06 24.80 MR 川棉109(2004) 67.62 13.89 S 59.78 18.36 S 苏棉12号(2004) 78.53 / / 73.22 / /
备注：HR-高抗；R-抗；MR-中抗；S-感；HS-高感
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例一
本实例的棉花人工网室抗棉蚜鉴定方法应用于转外源凝集素基 因棉花工程植株及品系的抗棉蚜性状鉴定，可以简便、快速、准确地 筛选鉴定抗棉蚜植株和品系，具体过程如下：
1、根据鉴定规模建立人工网室。1个标准网室180m2，可栽种600 棵被鉴定的棉苗。按照标记基因检测获得60个阳性植株、形成40-50 个株行、育成20-30个品系计算，一般从事转外源凝集素基因棉花研 究的单位需要建立5-6个标准网室。
2、冬前深翻土壤，耕翻深度为35公分，使土壤耕作层内各种害 虫的越冬虫蛹暴露在土壤表面，利用低温冻害杀死虫卵，确保第二年 人工网室内无其它害虫及棉蚜天敌的发生。
3、4月上旬(江苏地区开春后)采用地膜覆盖的方式在人工网 室内种植常规品种，株行配置为：株距0.8尺、行距3尺，第二片真 叶展平后，从温室保存棉蚜的棉株上用剪刀剪取带有棉蚜的叶片，按 单株接蚜量40头的标准，采用搭叶接混合蚜的方式，建立棉蚜繁殖 行。
4、转外源凝集素基因棉花当代种籽或品系于4月中旬采用营养 钵塑料棚架育苗，第1片真叶展平后在苗床进行标记基因检测，保留 阳性植株，5月中旬当棉苗普遍达到3叶期时，按组合将阳性植株或 品系分别栽入人工网室内，每个品种(系)栽种10行，每行10株， 以常规品种作为对照。棉蚜随即迁飞到供试材料的棉株上，实现供试 材料的接蚜处理。
5、分别于5叶期、7叶期、伏蚜期及秋蚜期逐株调查棉花的蚜 害症状及级别，鉴定转外源凝集素基因棉花工程植株对棉蚜的抗性。 对转外源凝集素基因棉花品系进行抗蚜鉴定时，随机抽样40株，苗 蚜期调查以全株受害最重叶片为标准叶，其它时期均以棉株顶部5叶 中受害最重叶片为标准叶。以常规品种为对照，计算蚜害指数及其比 对照减退率。以转半夏凝集素基因棉花品系苗蚜期抗棉蚜鉴定为例， 说明实验结果的统计与计算过程。其中苏抗208、苏抗201和苏抗219 为转半夏凝集素基因棉花品系，苏棉8号、新陆中T和徐州219分别 为其受体品种即对照。蚜害分级标准为：
0级，无蚜虫，叶片平展；I级，有蚜虫，叶片无受害；II级， 有蚜虫，叶片皱缩或微卷，未达半圆；III级，有蚜虫，叶片卷曲达半 圆或半圆以上，呈瓢形；IV级，有蚜虫，叶片完全卷曲，呈球形。
供试材料 0级株数 I级株数 II级株数 III级株数 IV级株数 蚜害指数 苏抗208 23 17 0 0 0 10.28 苏棉8号 0 0 7 29 4 73.51 苏抗201 20 20 0 0 0 12.08 新陆中T 0 0 15 20 5 68.15 苏抗219 25 15 0 0 0 9.70 徐州219 0 0 20 13 7 66.34
苏抗208比对照苏棉8号蚜害指数减退率＝(73.51-10.28)×100％ ÷73.51＝86.02％
苏抗201比对照新陆中T蚜害指数减退率＝(68.15-12.08)×100％ ÷68.15＝82.27％
苏抗219比对照徐州219蚜害指数减退率＝(66.34-9.70)×100％÷ 66.34＝85.38％
6、参照棉花品种对棉蚜的抗性分级标准，根据转外源凝集素基 因棉花品系的蚜害指数比对照减退率，确定其对棉蚜的抗性水平。
以转半夏凝集素基因棉花品系苗蚜期抗棉蚜鉴定为例，说明供试 品系对棉蚜抗性水平的确定。将步骤5得出的3个转半夏凝集素基因 棉花品系蚜害指数减退率，与棉花品种抗蚜虫分级标准进行比较，可 知苏抗208、苏抗201和苏抗219在苗蚜期对棉蚜的抗性达到高抗水 准。 抗性级别 分级标准 高抗 D＞80％ 抗 50％＜D≤80％ 中抗 20％＜D≤50％ 感 -10％＜D≤20％ 高感 ≤-10％
实施例二
棉花对棉蚜的抗性可分为形态抗性和转基因抗性，形态抗性主要 是由多茸毛性状产生的，而转基因抗性是指通过外源基因如野生荠菜 凝集素基因的导入所获得的抗性。因而同样可以用棉花人工网室抗棉 蚜鉴定方法对多茸毛品种进行抗棉蚜鉴定，具体过程如下：
1、按照1个供试品种占地26.67m2，畦宽8尺，株距0.8尺，行 距3尺进行种植规划，1个标准人工网室可移栽6个品种，其中5个 供试品种，1个对照品种，以此为依据确定人工网室所需的数量。
步骤2-3与实施例一相同。
4、供试品种于4月中旬采用营养钵育苗，5月中旬当棉苗普遍 达到3叶期时，将供试材料分别栽入人工网室内，每个品种(系)栽 种10行，每行10株，以常规品种作为对照。棉蚜随即迁飞到供试材 料的棉株上，进行供试材料的接蚜处理。
5、分别于苗蚜发生高峰期、苗蚜危害恢复期、伏蚜期及秋蚜期 调查供试品种和常规品种的蚜害级别。调查时随机抽样40株，苗蚜 期调查以全株受害最严重的叶片为标准叶，其它时期均以棉株顶部5 叶中受害最严重的叶片为标准叶。以常规品种为对照，计算蚜害指数 及其比对照减退率。
6、参照棉花品种对棉蚜的抗性分级标准，根据各供试品种的蚜 害指数比对照减退率，确定其对棉蚜的抗性水平。
以上实施例经多次试验，反复验证，不同年份间重复试验的结果 高度一致，未发现抗蚜品种鉴定结果与推广应用效果不符的现象，说 明有效避免了传统抗蚜鉴定方法的随机性，本专利技术鉴定结果准 确、可靠。
除上述两方面的实施例子外，本发明还可以有其他实施方式。凡 采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均属于本发明要求的保护 范围之内。