技术领域
本发明属于果树种植技术领域，尤其涉及一种复配杀菌剂及其制备方法。
背景技术
苹果树腐烂病是由黑腐皮壳属Valsa ceratosperma引起的，是苹果上一种分布广、危害重的病害。从我国首次发现苹果树腐烂病以来，国内已经有四次大的流行(曾士迈.宏观植物病理学.北京：中国农业出版社，2005)。2007年，国家苹果产业技术体系建立，为全国范围内苹果病虫害的调研和防控研究创造了条件，2008年的调查结果显示，全国苹果主产省苹果腐烂病的平均发病株率为52.7％，由此可见腐烂病的发生十分普遍且严重。
化学防治是控制苹果树腐烂病的有效措施之一，常用杀菌剂有甲基硫菌灵、甲硫萘乙酸、腐植酸酮、代森铵等。在生产过程中，频繁使用单一的化学药剂极易产生苹果树腐烂病对杀菌剂的抗药性，致使防治效果急剧降低。因此，寻找新型、高效、安全的化学杀菌剂是目前生产中亟待解决的问题。
苹果树腐烂病病原有性态为苹果黑腐皮壳属[Valsa mali Miyabe et Yamada]，子囊菌亚门、黑腐皮壳属；无性态为壳囊孢[Cytospora mandshurica Miura]，半知菌亚门、壳囊孢属。戊唑醇为三唑类杀菌剂，三唑类杀菌剂主要作用机理是破坏和阻止病菌细胞膜重要组成成分麦角甾醇的生物合成，导致细胞膜不能形成，使病菌死亡，对高等真菌表现出明显的抑制作用。多菌灵又名棉萎灵、苯并咪唑44号。多菌灵是一种广谱性杀菌剂，对多种作物由真菌(如半知菌、多子囊菌)引起的病害有防治效果。
另外，涂抹剂是治愈腐烂病伤口最适合的剂型，也是目前防治腐烂病药剂的发展方向。已登记的药剂多为涂抹剂(膏剂、糊剂、涂抹剂)有一定粘度的剂型，这样可以黏住树体组织，既能预防外来病菌的侵入，又能杀死组织内残留的腐烂病菌。由于病菌孢子的周年传播和伤口众多，新药剂还必须具有长效性和使用方便的特点。由此可知研发涂抹剂型的药剂是防治腐烂病重要的研究方向。
目前，尚未见有关于将多菌灵与戊唑醇组合成复配杀菌剂并做成膏剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复配杀菌剂及其制备方法，旨在解决现有的防治腐烂病的药剂存在的效果较差，操作复杂，有效期短的问题。
本发明是这样实现的，一种复配杀菌剂，该复配杀菌剂按照重量份数包括：多菌灵2.7g、戊唑醇0.3g、Op10：10.20～10.70g、赤霉素GA：0.002g、酒精 4.3±0.5g，乳胶漆补齐至100g。
进一步，多菌灵、戊唑醇分别为原药。
进一步，复配杀菌剂为涂抹剂。
本发明的另一目的在于提供一种复配杀菌剂制备方法包括以下步骤：
取2.7g多菌灵、0.3g戊唑醇放入搅拌罐中，加10.20～10.70g乳化剂Op10充分搅拌溶解后，静置混合均匀，再用小烧杯称量赤霉素0.002g，加4.3±0.5g酒精溶解后放入搅拌罐中搅拌均匀，乳胶漆补齐至100g即可。
进一步，该复配杀菌剂配制成乳油、可湿性粉剂、粒剂、可溶性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂、水乳剂、徼乳剂、乳剂、干悬剂、涂抹剂。
进一步，该复配杀菌剂使用方法，采用枝干涂抹，在树干处病疤刮除干净涂抹。
本发明提供的复配杀菌剂及其制备方法，复配杀菌剂由活性成分、填料和助剂组成，其中，活性成分由三唑类杀菌剂戊唑醇、苯并咪唑类杀菌剂多菌灵组成。可有效防治苹果树皮腐烂病菌、苹果轮纹病菌等苹果枝干真菌性病害。本发明在防治苹果树腐烂病真菌性病害上增效作用显著，X％DW膏剂120天内铲除效果达100％，均明显高于单一制剂；复配制剂速效性和持效性好，作用机制和位点多，能有效延缓病原菌抗药性的发生和发展。此外，本发明的制备工艺简单，成本低，经济效益显著，防病谱广，生物安全性高。
附图说明
图1是本发明实施例提供的复配杀菌剂的制备方法流程图；
图2是本发明实施例提供的常温下不同药剂对苹果腐烂病菌抑菌带宽度的影响示意图；
图3是本发明实施例提供的3％DW经高、低温处理后对苹果树皮腐烂病抑菌带形成的影响示意图；
图4是本发明实施例提供的5％DW经高、低温处理后对苹果树皮腐烂病抑菌带形成的影响示意图；
图5是本发明实施例提供的铲除苹果树腐烂病病斑经不同处理后伤口愈伤组织形成的影响示意图；
图6是本发明实施例提供的不同复配药剂对苹果树皮腐烂病菌菌丝生长EC50测定示意图；
图7是本发明实施例提供的离体枝条试验示意图；
图8是本发明实施例提供的不同药剂对苹果树腐烂病菌抑菌带形成的影响示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明实施例的复配杀菌剂：由活性成分、填料和助剂组成，其中，活性成分由三唑类杀菌剂戊唑醇、苯并咪唑类杀菌剂多菌灵组成；
该复配杀菌剂按照重量份数包括：多菌灵2.7g、戊唑醇0.3g、Op10：10.20～10.70g、赤霉素GA：0.002g、酒精4.3±0.5g，乳胶漆补齐至100g。
进一步，多菌灵、戊唑醇分别为原药。
进一步，复配杀菌剂为涂抹剂。
含有增效有效量的活性成分组合；填料是赤霉素、乳胶漆；所用助剂为OP10、酒精。
本发明所述的复配杀菌剂，可以配制成各种类型的制剂，例如乳油、可湿性粉剂、粒剂、可溶性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂、水乳剂、徼乳剂、乳剂、干悬剂、涂抹剂(膏剂)等。
本发明的复配杀菌剂使用方法，一般采用枝干涂抹，主要是树干处病疤刮除干净涂抹本杀菌剂。
如图1所示，本发明实施例的复配杀菌剂的制备方法包括以下步骤：
S101：取2.7g多菌灵、0.3g戊唑醇放入搅拌罐中，加10.20～10.70g乳化剂Op10充分搅拌溶解后，静置混合均匀；
S102：再用小烧杯称量赤霉素0.002g，加4.3±0.5g酒精溶解后放入搅拌 罐中搅拌均匀，乳胶漆补齐100g即可。
通过以下的试验对本发明的应用效果做进一步的说明：
一、材料与方法
1试验材料
1.1菌株，供试病原菌苹果树腐烂病菌Valsa ceratosperma由实验室分离保存；
1.1.1化学药剂，三唑类杀菌剂97％戊唑醇原药；苯并咪唑类杀菌剂98％多菌灵原药；
2方法：
试验1对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响
采用菌丝生长速率法测定，将97％戊唑醇原药和98％多菌灵原药，以及戊唑醇与多菌灵的不同配比用丙酮溶解后分别制成1000ug/mL的母液待用，试验时将供试药剂配制成不同浓度的药液，用灭菌移液管吸取1mL药液(加入灭菌后稍冷却的PDA培养基99mL中充分摇匀，倒入培养皿中，每种药剂每个浓度设4次重复，以丙酮作对照，无菌水作空白对照，于菌落边缘打取直径为0.7cm的菌饼，接种到含药平板中央，每皿放1块菌饼，置25℃恒温培养箱中培养4d后采用十字交叉法测量菌落直径(图6)，计算抑制率，将抑制率换算成机率值，将药剂浓度换算成浓度对数，再由相对抑制效果的几率值与药剂浓度是的对数值之间的线性回归分析，求出抑制苹果树腐烂病菌菌丝生长的 50％的有效浓度(EC50值)，抑制率％＝(对照菌丝生长直径-处理菌丝生长直径)/对照菌丝生长直径×100％
表1戊唑醇和多菌灵及其复配对苹果腐烂病菌菌丝生长的抑制作用
注：SR＜0.5时，表示拮抗作用；0.5≤SR≤1.5时，表示相加作用；SR＞1.5时，表示增效作用
由表1可知，室内条件下测定了多菌灵、戊唑醇及其不同混配组合对苹果树皮腐烂病病菌菌丝生长表现不同的抑制作用效果，确定了最佳配比，当多菌灵与戊唑醇原药按9∶1配比表现增效作用，增效系数为1.533，此配比为二者的最佳配比。
试验2对苹果树腐烂病菌孢子萌发的影响：
对腐烂病菌孢子萌发的抑制作用：从田间采集带有腐烂病分生孢子器的苹果树皮，室温下保湿培养促使孢子角产生，挑取黄色孢子角融入灭菌水中，制成浓度为1×106～1×107个分生孢子/mL的孢子悬浮液备用；
试验时将供试药剂配制成不同浓度的药液，用灭菌移液管吸取1mL药液 加入灭菌后稍冷却的PDA培养基99mL中充分摇匀，倒入培养皿中，每种药剂每个浓度设4次重复，以丙酮作对照，无菌水作空白对照，25℃黑暗条件下培养，待对照萌发率达到80％左右时，在光学显徼镜(40×10)下检查孢子萌发率，每皿至少计数200个孢子，计算孢子萌发率和抑制率，萌发标准为芽管长至超过孢子短径一半；
孢子萌发率％＝每视野已萌发孢子数/每视野镜检孢子总数×100
抑制孢子萌发率％＝(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100
由相对抑制效果的几率值与药剂浓度的对数值之间的线性回归分析，求出抑制苹果树腐烂病菌孢子萌发50％的有效浓度(EC50值)；
表2戊唑醇和多菌灵及其复配对苹果腐烂病菌孢子萌发的抑制作用
注：SR＜0.5时，表示拮抗作用；0.5≤SR≤1.5时，表示相加作用；SR＞ 1.5时，表示增效作用
由表2可知，室内条件下测定了多菌灵、戊唑醇及其不同混配组合对苹果树皮腐烂病病菌孢子萌发表现不同的抑制作用效果，确定了最佳配比；当多菌灵与戊唑醇原药按9∶1配比表现增效作用，增效系数为6.319，此配比为二者的最佳配比；
由多菌灵与戊唑醇得到不同比例的复配制剂对苹果树皮腐烂病菌丝生长和孢子萌发的抑制作用不同，其中多菌灵与戊唑醇以9∶1比例混配而达成的混配抑制苹果树皮腐烂病菌和孢子萌发的增效系数较高，均达到增效水平。
试验3膏剂在不同温度处理后对苹果树腐烂病菌抑菌带的影响测定
作为农药商品，保质期要求至少(54±2)℃贮存14d，作为涂抹剂维持良好的乳状液状态，只是分出乳状液和水，轻轻摇动仍能成均匀乳状液算合格，只分出油层为不合格，并且没有出现絮状物和凝结，流动性好；具体方法：取适当量样品，密封于广口瓶中，(54±2)℃恒温箱中储存14d后，观察是否出现油层和絮状物、凝结，确定产品热贮稳定性是否合格；
为确保药剂的安全过冬，需进行低温贮存稳定试验，将适量样品装入瓶中，密封后于-15℃冰箱中，贮存14d后观察，不分层为合格；
采用改良对峙法：将灭菌后稍冷却的约30mL PDA培养基倒入培养皿(d＝9cm)制成平板，用7mm打孔器在平板中央打孔，将药剂加入孔中与平板持平，在孔四周接种4个培养72h后的7mm苹果腐烂病菌菌盘，每 个菌盘与孔中心相距约2.8cm，放入26℃恒温培养箱培养，以加灭菌水和乳胶漆的处理为对照，以3.315％甲硫萘乙酸(涂抹剂型)为对照药剂，每处理重复4次；待对照长满皿时测量各处理抑菌直径并照相(图8)；
由图2可知室内常温(25±2)℃条件下3％DW、5％DW膏剂的抑菌效果高于3.315％甲硫萘乙酸对照药剂，在P＝0.05水平上差异显著，由此可以看出多菌灵戊唑醇混配膏剂抑菌效果为最好，因此选择该配方进行下一步的试验；
如图3、4所示，在高温(54±2)℃、低温(-15±2)℃贮存14d后测定抑菌效果，可以看出经高温、低温处理后3％DW膏剂抑菌效果与常温下差异不显著，5％DW膏剂经高温、低温处理后抑菌效果与常温相比在5％水平抑菌效果与常温下差异显著，说明本配方满足农药商品的保质期要求，且稳定性较好；确定该配方为本试验最终产品。
试验4药剂对苹果树腐烂病的防治效果——离体枝条实验
药剂对苹果树离体枝条的治疗作用
治疗作用：剪取1年生苹果树(富士品种)枝条，截成20cm长，用自来水冲洗干净，再用75％酒精进行表面消毒，每枝用直径4mm的打孔器打孔，去掉树皮，将培养3d的苹果树腐烂病菌菌饼(d＝4mm)放置于枝条打孔处，用保鲜膜对打孔处进行缠绕，使菌饼固定于枝条上，枝条两端用凡士林封口；然后将枝条放于26℃恒温箱中保湿21h，使病原菌与寄主建立寄生关系，然后解除保湿材料，按枝条的粗细和长势分组，在孔口处涂抹药剂，以不涂药 剂的处理为对照，将其插入湿砂盘中，放于25℃组培室进行保湿培养，待对照发病后调查统计各处理的发病情况，测量病斑大小，计算病斑面积和防治效果；每个处理接种4个枝条，每个枝条2个接种孔(图7)；
防治效果(％)＝[(对照病斑面积-菌饼面积)-(处理病斑面积-菌饼面积)]/(对照病斑面积-菌饼面积)×100
发病率＝发病接种点数/总接种点数×100％
病疤面积＝1/4×π×长径×短径
不同药剂对离体枝条苹果树腐烂病的治疗作用结果见表4；
表4不同药剂对离体枝条苹果树皮腐烂病的治疗作用
注：表中数据为平均值±标准误，同列数据后相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在P＜0.05水平差异不显著，下同。
表4显示出实施例3制备的3％、5％DW膏剂对病斑的扩展有一定的抑制效果；治疗试验中5％DW防效最高，为93.18％，其次3％DW防治效果为92.28％，与对照药剂3.315％甲硫萘乙酸差异不显著，其中5％DW防治效果显著高于3.315％甲硫萘乙酸；
试验5不同药剂对苹果树皮腐烂病病斑铲除的防治效果
于2014年5月在树体主干接种苹果腐烂病菌，待其发病后，选择典型病斑，用梵氏刮刀将病组织彻底刮除干净，周围露出健康组织并往外再刮0.5cm左右；使用药剂涂抹伤口及周围健康组织，设置的处理：3％DW膏剂、5％DW膏剂、3.315％甲硫萘乙酸为对照药剂、乳胶漆对照、无菌水为空白对照；每处理5块病斑，重复3次；
接种方法：选择侧枝较多且树干光滑无病的苹果树，用4mm的打孔器在树干侧枝下端的光滑处打孔，将同样大小的病树皮组织填充到所处理的孔中，用蘸有无菌水的脱脂棉保湿，再用保鲜膜绕树干把脱脂棉缠住并封严；处理树发病后将保鲜膜及脱脂棉剥离，观察发病情况；
于2014年5月20日刮除病斑后进行处理，待对照复发后调查、记录病斑的复发情况，游标卡尺测量愈伤组织的宽度，并计算防治效果；如图4所示；
防治效果(％)＝(对照复发率-处理复发率)/对照复发率×100
表6不同处理对苹果树皮腐烂病病斑的铲除作用及对苹果树愈伤组织形成的影响
刮除病斑后涂抹3％、5％DW膏剂，对照药剂3.315％甲硫萘乙酸，助剂乳胶漆120天后调查各个处理15块病斑复发情况，空白对照有8块复发，乳 胶漆处理复发2块，防效为13.33％(见表6)；3％、5％DW膏剂处理后形成的愈伤组织宽度为9.07mm、8.53mm，两者之间差异不显著，与CK处理的对照形成显著差异，与对照药剂甲硫萘乙酸无显著差异。
最后通过综合比较，暂且确定3％DW膏剂为本试验产品。
实施例1涂抹剂(膏剂)
多菌灵：2.7％、戊唑醇：0.3％、乳化剂Op10：10.20％～10.70％、赤霉素GA：0.002％、酒精(4.3±0.5)％乳胶漆补齐至100g
首先准确称取上述配方各成分，将多菌灵与戊唑醇放入搅拌罐中，加适量乳化剂Op10充分搅拌溶解后，再用小烧杯准确称量赤霉素，加适量酒精溶解后放入搅拌罐中搅拌均匀，乳胶漆补齐至100g即可。
实施例2涂抹剂(膏剂)
多菌灵：4.5％、戊唑醇：0.5％、乳化剂Op10：15.94％～16.50％、赤霉素GA：0.002％、酒精(4.3±0.5)％乳胶漆补齐至100g。制备过程见实施例1。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。