减少培养基中大量元素进行菊花离体保存的方法
一、技术领域
本发明涉及通过减少培养基中大量元素进行菊花离体保存的方法，专用于 菊花种质资源离体保存。
二、技术背景
菊花(Dendranthema×grandiflorum Ramat.)是我国十大传统名花和世界 四大切花之一，具有观赏、食用、药用等多种价值。我国是栽培菊花的起源中心 和菊属种质资源的分布中心，菊属40余种在我国分布的有20余种，栽培菊花品 种达3000余个。栽培菊花在遗传上存在高度杂合性，后代性状分离，难以通过 种子保存种质资源，而主要通过扦插进行无性繁殖，需要耗费大量土地、人力和 物力进行母本的保存和种苗的扦插繁殖，且在长期的无性繁殖过程中易出现人为 混杂和种性退化现象。
在生产上，目前由于组织培养产业化生产的种苗不仅要顺应瞬息万变的供 求市场的需求而且又受到生长季节的限制，使得一些材料的扩繁在一定阶段内没 有实际意义，需要将其进行暂时保存，当生产的发展使得这些材料再次成为需要 时，可以将其快速恢复到正常快繁应用状态。同时，夏季高温高湿，继代容易污 染，如能将其进行短期保存则可安然越夏。
为克服菊花传统田间种植保存的缺点及解决组织培养产业化生产中的现 实问题，开展菊花种质资源的离体保存的研究显得日益迫切。离体保存，有着不 费时、不费工，不易引起种质资源混杂，保持种质优良性状等优点，而且方便于 无病毒种质的交换。随着近几十年离体培养技术的全面展开，通过改变培养物生 长的外界环境条件来达到延长继代时间目的的缓慢生长法离体保存技术也得到 了迅猛发展。自20世纪90年代以来，研究者已成功地进行了百合、蒙自凤仙花、 淡黄花百合、铁皮石斛的等花卉种质资源的试管离体保存，但目前国内利用减少 培养基中大量元素来保存菊花试管苗，尚未有报道。
三、发明内容
技术问题 本发明的目的是针对目前菊花种质资源田间种植保存工作量大，易 受极端自然灾害及病虫害影响，而组织培养正常继代保存转接频繁、成本高等缺 陷，提供一种通过减少培养基中大量元素进行菊花离体保存的方法，用于菊花种 质资源离体保存，不但保存1年后植株生长正常，而且保存材料的后代未发生遗 传性变异。
技术方案 本发明通过减少培养基中大量元素进行菊花离体保存的方法，包 括：
以菊花脚芽为外植体，用75％乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗2次，再用0.1 ％升汞灭菌8min，无菌水冲洗5次后，将其切割成去叶带1个节的茎段接入MS 培养基中；20d后将萌发的腋芽转接到MS+0.3mg.L-1 6-BA+0.1mg.L-1NAA培养 基上进行增殖培养；30d后将增殖的不定芽切割成去叶带2个节的茎段转入 1/2MS(大量元素均减少1/2的量)或1/2MS(1/2NH4+)(NH4NO3减少3/4的量， 其余大量元素减少1/2的量)或1/4MS(大量元素均减少3/4的量)，均附加 6-BA0.3mg/L和NAA0.1mg/L的培养基上进行保存。
以上培养基中含蔗糖3％、琼脂0.7％，pH为6.0(高温高压灭菌前)，培养条 件23±2℃、光照强度2000～3000lux、光照时间12h/d。
有益效果 本发明提供的离体保存菊花种质资源的方法，与现有技术相比具有 如下优点和积极效果：
1.本发明所提供的通过减少培养基中大量元素进行菊花离体保存的方法，用于 菊花种质资源离体保存，试管苗保存12个月后存活率仍为100％，且植株生 长正常，正常MS培养基上的试管苗仅存活4个月。
2.本发明方法保存12个月的菊花试管苗，其后代POD、EST同工酶酶谱及引物 135的ISSR扩增谱带与对照没有差异，保存材料稳定，没有发生遗传变异。
3.本发明首次利用减少培养基中大量元素保存菊花试管苗并对其后代进行遗传 稳定性鉴定，与传统的菊花田间种植保存相比，可节省保存空间，工作量小。
4.可防止多代繁殖后种性退化及病毒感染，保证种质的优良性和纯洁性。
5.打破了植物生长季节的限制，可随时提供材料，同时具有节省贮存空间，便 于运输和交流等优点。
6.可防止种质资源的流失。
7.减少生产中繁重的继代工作，而且降低生产操作过程中不必要的人力、物力 资源的浪费，为实际生产降低生产成本和提高经济效益提供必要的途径。
四、附图说明
图1不同培养基养分水平上保存6个月的试管苗
图2不同培养基养分水平上保存12个月的试管苗
自左之右依次为：1/2MS(1/2NH4+)、1/2MS、1/4MS
图3保存植株在增殖培养上恢复培养25d的生长状况
左图：CK右图：保存植株
图4再生植株驯化25d的生长状况
图5再生植株移栽大棚3个月的生长状况
图6移栽大棚3个月再生植株与对照株叶型的对比
自左之右依次为：CK、1/2MS(1/2NH4+)、1/2MS、1/4MS
图7同工酶酶谱左图：POD同工酶酶谱 右图：EST同工酶酶谱
图8引物I35的ISSR扩增结果
注：(M)100bp DNA分子量标记CK：对照；(1)1/2MS(1/2NH4+)；(2)1/2MS；(3)1/4MS；
五、具体实施方式
本发明所提供的离体保存菊花种质资源的方法，其实施方式如下：
1.菊花种质资源的离体保存：以本课题组选育的‘奥运火炬’(Dendranthema× grandiflorum Ramat.‘Aoyunhuoju’)(公知公用品种，见参考文献陈发棣，房伟民 等.菊花新品种一夏花型盆栽小菊系列.园艺学报，2005，32(3)：567)品种为 供试材料。取‘奥运火炬’脚芽为外植体，用75％乙醇表面消毒30s，无菌水冲 洗2次，再用0.1％升汞灭菌8min，无菌水冲洗5次后，将其切割成去叶带1个 节的茎段接入MS培养基中。外植体接种5d后，腋芽萌发率为83.3％；20d后将 腋芽转接到MS+0.3mg.L-1 6-BA+0.1mg.L-1NAA培养基上进行增殖培养；30d后 将增殖的不定芽切割成去叶带2个节的茎段转入1/2MS(大量元素均减少1/2的 量)或1/2MS(1/2NH4+)(NH4NO3减少3/4的量，其余大量元素减少1/2的量) 或1/4MS(大量元素均减少3/4的量)，附加6-BA0.3mg/L和NAA0.1mg/L的培 养基上进行保存。
以上培养基中含蔗糖3％、琼脂0.7％，pH为6.0(高温高压灭菌前)，培养 条件23±2℃、光照强度2000～3000lux、光照时间12h/d。
2.保存材料后代的遗传稳定性鉴定：‘奥运火炬’试管苗在增殖培养基(对照) 上生长3个月后，其顶梢及培养盖折回向下，整株扭曲生长，且茎段上长满气生 根，只有最顶梢嫩绿色可用，到4个月后，植株衰老枯死。而试管苗在大量元素 不同程度减少的培养基上生长缓慢，5个月后植株生长正常(图1)，12个月后 顶梢及培养盖(图2)，植株中下部失绿干枯，但中上部可用。减少培养基中大 量元素大大延长了试管苗继代培养时间，使继代间隔由平时的1个月继代1次转 为12个月继代1次，且12个月后3种培养基上试管苗的存活率均为100％，比 对照延长存活8个月；试管苗保存12个月后，与1个月继代1次正常培养保存 的对照试管苗转接至增殖培养基上，培养10d后保存材料分化出形态正常的不定 芽，且与对照相比分化能力正常，表明保存材料恢复生长正常(图3)；30d后把 再生的不定芽转接到生根培养基上，生根培养基为1/2MS+0.1mg.L-1 NAA；生根 培养15d后打开培养盖练苗，7d后移栽到经高温灭菌过的珍珠岩中进行驯化， 每天浇水一次，3～4d浇MS营养液一次，25d后移栽到大棚(图4)；移栽大 棚2个月后取植株心叶提取粗酶液(方法见参考文献何忠效，张树政主编.电泳 [M].科学出版社，北京，1999)和总DNA(方法见参考文献肖军，杨立国等.两 种提取菊花总DNA方法的比较.辽宁农业科学，2005(1)：40～41)，经过氧化物 酶(POD)和酯酶(EST)同工酶、ISSR分子标记检测未发现有特异性条带产生(图 7、图8)。以上结果说明减少培养基中大量元素保存12个月的菊花种质保持了 良好的遗传稳定性。
上述同工酶检测的方法为，取植株心叶0.15g，加入450ml缓冲液冰浴上迅 速研磨成匀浆，转移至离心管中8000rmp/min 4℃离心20min，上清液即为酶的 粗提液；制备9％的分离胶、3％的浓缩胶，采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法分 析POD和EST同工酶，每孔点样20ul。浓缩胶采用100V稳压电泳，分离胶后改 用200V稳压电泳。当溴酚蓝色带跑至接近底部1cm时停止电泳；POD采用改良 联苯胺法染色，EST用a-萘酯、坚牢兰染色，凝胶成像分析仪(上海培清科技有 限公司，JS-380型)上观察发现，离体保存材料后代株和对照的酶谱一致(图7)， 说明减少培养基中大量元素保存12个月的菊花种质在蛋白质水平上没有发生遗 传变异。
上述ISSR分子标记鉴定的方法为，取植株心叶于小玻璃研钵中用液氮混合磨 样。样品总DNA提取参照CTAB法(方法见参考文献肖军，杨立国等.两种提取菊 花总DNA方法的比较.辽宁农业科学，2005(1)：40～41)。扩增反应采用20.0ul 反应体系(见表1，所有试剂均购自南京生通生物技术有限责任公司)，于美国 MJ Research公司PTC-100TM型扩增仪中进行PCR扩增，反应程序为：95℃预变 性5min；94℃变性45s，55℃复性40s；72℃延伸70s，45个循环；72℃延伸7min， 10℃保存。扩增反应结束后，在ISSR扩增产物反应液中各加入6×溴酚蓝0.4ul， 离心混匀后，各吸取混合液6.5ul注入2％琼脂糖凝胶上的点样孔中电泳，凝胶含 0.05％溴化乙锭(EB)。电极缓冲液为1×Tris-乙酸(TAE)，分离电压180伏，电 泳50～60min后在凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司，JS-380型)上观 察发现，离体保存材料后代株其引物I35的ISSR扩增条带与对照一致，没有特 异性条带产生(图8)，说明减少培养基中大量元素保存12个月的菊花种质在分 子水平上没有发生遗传变异。
表1 PCR反应体系
成分 体积(ul) 10×Buffer(Mg2+Free) 25mM Mg2+10mM d NTP Mixture 5U/ul Taq酶 20uM引物I35 ddH2O 20ng/ul模板DNA 反应总体积 2.0 1.5 0.8 0.2 0.5 13.0 2.0 20.0
注：引物I35的序列为(AG)8TA