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一种具有协同抗骨肉瘤功效的药物组合物及其应用.pdf

上传人：Y948****062

文档编号：6430135

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810309050.6 (22)申请日 2018.04.09 (71)申请人徐州维康生物科技有限公司地址 221001 江苏省徐州市经济技术开发区软件园E1-924 (72)发明人赵蔚邹昌业 (74)专利代理机构北京太兆天元知识产权代理有限责任公司 11108 代理人陈伯秋 (51)Int.Cl. A61K 31/506(2006.01) A61K 31/4545(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称一种具有协同抗骨肉。

2、瘤功效的药物组合物及其应用 (57)摘要一种具有协同抗骨肉瘤功效的药物组合物及其应用。本发明公开了包含VEGFR2选择性抑制剂阿帕替尼(Apatinib)和组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK-J4的药物组合物及其应用。将阿帕替尼 (Apatinib)和GSK-J4联合使用，具有协同抗肿瘤功效，可明显抑制骨肉瘤肿瘤细胞生长，用于骨肉瘤等肿瘤的治疗。权利要求书1页说明书5页附图3页 CN 108186643 A 2018.06.22 CN 108186643 A 1.一种抑制肿瘤增长的药物组合物，其特征在于，包含VEGFR2选择性抑制剂阿帕替尼和组蛋白去甲基化酶抑制剂。

3、GSK-J4。 2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述阿帕替尼和GSK-J4的摩尔比为 (13)： (13)。 3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述阿帕替尼使用浓度为10- 100mg/kg；所述GSK-J4的使用浓度为5-50mg/kg。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述癌症为骨肉瘤。 6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的治疗癌症的药物能够降低肿瘤体积和重量。权利要求书 1/1 页 2 CN 108186643 A 2 一种具。

4、有协同抗骨肉瘤功效的药物组合物及其应用技术领域 0001 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有协同抗肿瘤功效的药物组合物及其应用。背景技术 0002 骨肉瘤是一种起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，其特征为增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。典型骨肉瘤临床少见，其发病率约为0.3/万，约占恶性肿瘤的0.2，原发骨肿瘤的15。典型骨肉瘤好发于男性，发病年龄多为825岁， 6岁前及60岁之后少见；好发部位为长骨，一般为股骨远端或胫骨近端，其次为肱骨近端，其他部位较少见。其血行转移发生早且发生率高，进展迅速。 1970年以前骨肉瘤的标准治疗方法是截。

5、肢术，但80的患者在确诊时已有微小转移灶，从外科治疗到出现肺转移的平均时间为8个月， 5年总体生存率低，大部分肿瘤肺转移患者死于确诊后1年以内。有研究显示，近十年来我国骨肉瘤患者5年总体生存率为7.577.6，平均64.0， 5年无瘤生存率为34.8 69.7，平均56.0。 0003 现行治疗骨肉瘤的方法主要有化疗、手术、放疗、基因治疗、免疫治疗以及分子靶向治疗。其中手术治疗尽管保肢手术取代了以往的截肢手术，但是手术治疗存在限制，如瘤段骨切除加关节融合术会造成关节功能的丧失，目前临床上已较少应用；旋转成形术对保肢有积极意义，但因其外观欠佳限制了其。

6、发展。在化疗方面，目前的放疗方法对骨肉瘤的效果仍欠佳，患者生存率低，一般仅用于减轻患者疼痛和无法切除骨肉瘤的患者。 0004 而在药物治疗方面，化疗领域逐渐形成了 “新辅助化疗” 概念，但是研究结果表明新辅助化疗并不能在辅助化疗的基础上提高远期生存率。常用的化疗药物也存在一定的问题，首先是小剂量传统化疗药物如甲氨蝶呤(MTX)并不能有效杀灭肿瘤细胞；大剂量化疗虽然取得了很好疗效，但化疗所导致的严重毒副作用不容忽视，例如严重的粒细胞和或血小板下降及由此可能引起的严重感染；耐药问题也是化疗失败的主要原因。分子靶向治疗药物和其他治疗药物一样，也会产生耐药和不良。

7、反应。主要有皮肤毒性、胃肠毒性反应，高血压和心脏不良事件，以及对血液的影响，可表现为中性粒细胞减少。近年来骨肉瘤的治疗遇到了瓶颈，尤其是对一些转移骨肉瘤及化疗耐药患者的治疗，我们缺少有效的骨肉瘤治疗药物，需要研发新的药物和治疗策略。因此，新的药物的开发，以及新的药物组合的应用，对于骨肉瘤的治疗进展的突破具有重要意义。 0005 GSK-J4，结构如式I所示，是一种组蛋白去甲基酶抑制剂。现有技术认为GSK-J4通过抑制组蛋白H3第27位氨基酸的去甲基化酶UTX(又称KDM6A)和JMJD3(又称KDM6B)活性发挥作用，抑制胶质瘤和乳腺癌细胞的增殖。。

8、说明书 1/5 页 3 CN 108186643 A 3 0006 0007 阿帕替尼，结构如式 I所示，又名艾坦，是目前晚期胃癌靶向药物中唯一一个口服制剂，同时也是被证实在晚期胃癌标准化疗失败后安全有效的口服药物。经大量的临床研究表明，通过抑制肿瘤组织新血管的生成，阿帕替尼能够显著延长晚期胃癌患者生存期。 0008 发明内容 0009 本发明旨在提供具有较好的抗癌的效果、低毒、低副作用的联合药物，且效率能最大化。有鉴于此，本发明提供一种药物组合物及其应用。 0010 本发明提供以下技术方案： 0011 本发明提供了一种药物组合物，包含VEGFR2选择性抑。

9、制剂阿帕替尼和组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK-J4。 0012 将阿帕替尼和GSK-J4联合使用，其联合使用的药效大于单独药效，对骨肉瘤和骨肉瘤的发展具有明显的抑制效果。 0013 经试验测定本发明提供的技术方案可明显抑制骨肉瘤细胞生长，具有较佳的抗肿瘤功效，本技术方案提供的两药联合中，使用量少，减少副作用。 0014 在本发明的一些具体实施方案中，所述阿帕替尼和GSK-J4的摩尔比为(13)： (1 3)。 0015 在本发明的一些具体实施方案中，所述阿帕替尼使用浓度为10-100mg/kg；所述 GSK-J4的使用浓度为5-50mg/kg。 0016 本发明还提供了所。

10、述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。 0017 在本发明的一些具体实施方案中，所述骨肉瘤细胞为143B细胞和SJSA1细胞。 0018 本发明对药物的剂型不作限定，凡是药物领域接受的剂型均在本发明的保护范围之内。说明书 2/5 页 4 CN 108186643 A 4 附图说明 0019 图1示采用细胞活力实验测定阿帕替尼和GSK-J4分别对骨肉瘤细胞的存活率的抑制作用； 0020 图2示两种药物对骨肉瘤细胞的存活率的抑制作用存在协同效果；图2A为协同指数的测定。图2B为两种药物联合与两种药物单独使用相比，对骨肉瘤细胞的存活率的抑制作用。 0021 图3至图5示。

11、检测两药联合及阿帕替尼和GSK-J4单药分别对骨肉离细胞诱导凋亡作用；其中，图3A和图4为药物对于骨肉瘤细胞系143B细胞的作用，由左至右依次为对照组、 GSK-J4组、阿帕替尼组、联合组。图3B和图5为药物对于骨肉瘤细胞系SJSA1细胞的作用，由左至右依次为对照组、 GSK-J4组、阿帕替尼组、联合组。 0022 图6示两药联合与相应单药相比，对骨肉瘤细胞143B细胞和SJSA1细胞在实验动物体内成瘤的抑制作用；其中，图6A为143B细胞组，由上至下依次为照组、 GSK-J4组(50mg/ kg)、阿帕替尼组(100mg/kg)、联合组(GSK-J4 50。

12、mg/kg加阿帕替尼100mg/kg)。图6B为SJSA1 组，由上至下依次为照组、 GSK-J4组(50mg/kg)、阿帕替尼组(100mg/kg)、联合组(GSK-J4 50mg/kg加阿帕替尼100mg/kg)。具体实施方式 0023 本发明公开了一种药物组合物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与。

13、组合，来实现和应用本发明技术。 0024 以下实施案例中，抑制率+存活率1。 0025 下面结合实施例，进一步阐述本发明： 0026 1.实施例1 0027 阿帕替尼(购自sel leck,货号S2221)和GSK-J4(购自sel leck,货号S7070)按照不同浓度配置好后待用。 0028 通过MTT实验的方法，检测测试不同浓度药物对人骨肉瘤细胞143B和SJSA1增殖的影响。将处于指数级增长期的143B(ATCC编号CRL-8303TM，人源，上皮样贴壁生长)和SJSA1 细胞(ATCC编号CRL-2098TM，人源，上皮样贴壁生长)，用胰酶消化，吹散成单细胞。

14、悬液，计数，接种到96孔培养板中。在培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，加入不同浓度的测试药物，分别作用48h后终止培养，每孔加入20 l MTT(5mg/mL)， 37避光孵育4h。然后将各个孔内液体弃去，加入150 L DMSO，震荡15min，使结晶物充分溶解，在酶标仪490nm波长下测定细胞光密度值。 0029 采用上述MTT方法分别检测阿帕替尼和GSK-J4对骨肉瘤两种细胞系细胞的抑制作用。药物作用关系计算方法：生存率(实验组数值-空白组数值)/(对照组数值-空白组数值) 0030 实验结果：说明书 3/5 页 5 CN 108186643 。

15、A 5 0031 结果表明阿帕替尼和GSK-J4单独对143B和SJSA1细胞具有一定的抑制作用(图1)。 0032 2.实施例2 0033 进而考察阿帕替尼和GSK-J4联用对143B和SJSA1细胞的增殖抑制作用，通过计算获得药物相互作用指数CI。 0034 采用MTT法测定 0035 阿帕替尼和GSK-J4单药及上述两种药物联合对143B和SJSA1细胞增殖的抑制效应。 0036 实验分组：实验分组143B和SJSA1细胞系分别处理如下： 1)空白对照组：未加任何药物处理； 2)各单药组：阿帕替尼组：在40、 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625 mol。

16、/L阿帕替尼作用下培养48h； GSK-J4组：在20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.3125 mol/LGSK-J4作用下培养48h； 3)联合用药组：阿帕替尼+GSK-J4组： 40、 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625 mol/L阿帕替尼分别与 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.3125 mol/LGSK-J4作用下培养48h；每组设3个复孔，实验重复 3次，取平均值为最终结果。 0037 细胞活力测定同实施例1中，联合指数测定应用CalcuSyn software(Bio-soft， Ferguso。

17、n， MO，美国)软件分析协同指数(Combi-nation index， CI)，结果分别以CI1为拮抗作用 0038 结果发现，阿帕替尼和GSK-J4联合使用时，可以在不同浓度(0.1 g/ml100 g/ ml)下表现出对骨肉瘤细胞的协同抑制作用(图2A)。 0039 对于SJSA1细胞系，当抑制率(fa)1，此时两药具有拮抗效应,fa20 均有协同效应；而对于143B， fa范围内均有协同效应， fa在100左右， CI值最小，此时协同效应最显著(图2A)。 0040 然后固定两种药物的比例和浓度，检测联合用药的协同效应。实验分组如下： 1)空白对照组：未加任。

18、何药物处理； 2)各单药组：阿帕替尼组：在10 mol/L阿帕替尼作用下培养 24h、 48h、和72h； GSK-J4组：在5 mol/LGSK-J4作用下培养24h、 48h、和72h； 3)联合用药组：阿帕替尼10 mol/L阿帕替尼与5 mol/LGSK-J4作用下培养24h、 48h、和72h。对于24h、 48h、和 72h时间点的细胞活力测定，阿帕替尼和GSK-J4联合时，对143B和SJSA1细胞的增殖抑制作用均强于各单药组(P0.05)(图2B)。 0041 为确定阿帕替尼和GSK-J4联合使用对骨肉瘤细胞是否具有更强的细胞凋亡作用，采用Annex。

19、in V-FITC/PI双染的方法，通过流式细胞仪检测经阿帕替尼和GSK-J4单药及上述两种药物联合处理12h后的143B和SJSA1细胞的凋亡诱导效应。 0042 实验过程为不同组药物分别作用于105个143B或SJSA1细胞12h，离心得细胞，洗涤后用双染试剂AnnexinV-FITC/PI染色1520min，离心、洗涤，用染色Buffer重悬后，流式细胞仪测定FITC/PI对应的荧光通道，正常细胞为FITC-/PI-，凋亡早期细胞为FITC+/PI-，凋亡晚期及坏死细胞为FITC+/PI+。 0043 结果显示，与单药组比较，阿帕替尼和GSK-J4联合使用。

20、对骨肉瘤143B和SJSA1细胞的诱导细胞凋亡作用显著增强，差异有极其显著的统计学意义(P0.01)。 (图3A和3B，图4、图5)。 0044 3.实施例3 0045 将骨肉瘤细胞143B和SJSA1细胞进行细胞培养，待细胞处于指数级增长期时，用胰说明书 4/5 页 6 CN 108186643 A 6 酶消化，收集细胞，用无菌生理盐水制成1107个/mL的细胞悬液，皮下注射于雄性裸鼠左侧腋下位置处，每只0.2mL。每日观测小鼠状况，用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短径(b)，根据公式V(mm3)(ab2)/2计算瘤体积。待肿瘤体积达到80100mm3时，。

21、将动物随机分为4 组，每组5只。分别为：对照组：生理盐水；阿帕替尼组： 100mg/kg； GSK-J4组： 50mg/kg；联用组：阿帕替尼100mg/kg+GSK-J4 50mg/kg。采用对照组、阿帕替尼组、 GSK-J4组和联用组隔日一次腹腔给药，连续给药5次。 27天后，颈部脱臼处死小鼠，将肿瘤剥离、称重，对比肿瘤生长大小。 0046 实验结果 0047 如图6所示，两者联合使用时，移植瘤的生长被更大程度地抑制。结果表明联合给药组显著降低小鼠肉瘤体积和瘤重。说明书 5/5 页 7 CN 108186643 A 7 图1 图2 说明书附图 1/3 页 8 CN 108186643 A 8 图3 图4 说明书附图 2/3 页 9 CN 108186643 A 9 图5 图6 说明书附图 3/3 页 10 CN 108186643 A 10 。

摘要
申请专利号：	CN201810309050.6	申请日：	20180409
公开号：	CN108186643A	公开日：	20180622
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	A61K31/506,A61K31/4545,A61P35/00	主分类号：	A61K31/506,A61K31/4545,A61P35/00
申请人：	徐州维康生物科技有限公司
发明人：	赵蔚,邹昌业
地址：	221001 江苏省徐州市经济技术开发区软件园E1-924
优先权：	CN201810309050A
专利代理机构：	北京太兆天元知识产权代理有限责任公司	代理人：	陈伯秋
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内容摘要

一种具有协同抗骨肉瘤功效的药物组合物及其应用。本发明公开了包含VEGFR2选择性抑制剂阿帕替尼(Apatinib)和组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK‑J4的药物组合物及其应用。将阿帕替尼(Apatinib)和GSK‑J4联合使用，具有协同抗肿瘤功效，可明显抑制骨肉瘤肿瘤细胞生长，用于骨肉瘤等肿瘤的治疗。

权利要求书

1.一种抑制肿瘤增长的药物组合物，其特征在于，包含VEGFR2选择性抑制剂阿帕替尼和组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK-J4。 2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述阿帕替尼和GSK-J4的摩尔比为(1～3)：(1～3)。 3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述阿帕替尼使用浓度为10-100mg/kg；所述GSK-J4的使用浓度为5-50mg/kg。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述癌症为骨肉瘤。 6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的治疗癌症的药物能够降低肿瘤体积和重量。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有协同抗肿瘤功效的药物组合物及其应用。

背景技术

骨肉瘤是一种起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，其特征为增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。典型骨肉瘤临床少见，其发病率约为0.3/万，约占恶性肿瘤的0.2％，原发骨肿瘤的15％。典型骨肉瘤好发于男性，发病年龄多为8～25岁，6岁前及60岁之后少见；好发部位为长骨，一般为股骨远端或胫骨近端，其次为肱骨近端，其他部位较少见。其血行转移发生早且发生率高，进展迅速。1970年以前骨肉瘤的标准治疗方法是截肢术，但80％的患者在确诊时已有微小转移灶，从外科治疗到出现肺转移的平均时间为8个月，5年总体生存率低，大部分肿瘤肺转移患者死于确诊后1年以内。有研究显示，近十年来我国骨肉瘤患者5年总体生存率为7.5％～77.6％，平均64.0％，5年无瘤生存率为34.8％～69.7％，平均56.0％。

现行治疗骨肉瘤的方法主要有化疗、手术、放疗、基因治疗、免疫治疗以及分子靶向治疗。其中手术治疗尽管保肢手术取代了以往的截肢手术，但是手术治疗存在限制，如瘤段骨切除加关节融合术会造成关节功能的丧失，目前临床上已较少应用；旋转成形术对保肢有积极意义，但因其外观欠佳限制了其发展。在化疗方面，目前的放疗方法对骨肉瘤的效果仍欠佳，患者生存率低，一般仅用于减轻患者疼痛和无法切除骨肉瘤的患者。

而在药物治疗方面，化疗领域逐渐形成了“新辅助化疗”概念，但是研究结果表明新辅助化疗并不能在辅助化疗的基础上提高远期生存率。常用的化疗药物也存在一定的问题，首先是小剂量传统化疗药物如甲氨蝶呤(MTX)并不能有效杀灭肿瘤细胞；大剂量化疗虽然取得了很好疗效，但化疗所导致的严重毒副作用不容忽视，例如严重的粒细胞和或血小板下降及由此可能引起的严重感染；耐药问题也是化疗失败的主要原因。分子靶向治疗药物和其他治疗药物一样，也会产生耐药和不良反应。主要有皮肤毒性、胃肠毒性反应，高血压和心脏不良事件，以及对血液的影响，可表现为中性粒细胞减少。近年来骨肉瘤的治疗遇到了瓶颈，尤其是对一些转移骨肉瘤及化疗耐药患者的治疗，我们缺少有效的骨肉瘤治疗药物，需要研发新的药物和治疗策略。因此，新的药物的开发，以及新的药物组合的应用，对于骨肉瘤的治疗进展的突破具有重要意义。

GSK-J4，结构如式I所示，是一种组蛋白去甲基酶抑制剂。现有技术认为GSK-J4通过抑制组蛋白H3第27位氨基酸的去甲基化酶UTX(又称KDM6A)和JMJD3(又称KDM6B)活性发挥作用，抑制胶质瘤和乳腺癌细胞的增殖。

阿帕替尼，结构如式ⅠI所示，又名艾坦，是目前晚期胃癌靶向药物中唯一一个口服制剂，同时也是被证实在晚期胃癌标准化疗失败后安全有效的口服药物。经大量的临床研究表明，通过抑制肿瘤组织新血管的生成，阿帕替尼能够显著延长晚期胃癌患者生存期。

发明内容

本发明旨在提供具有较好的抗癌的效果、低毒、低副作用的联合药物，且效率能最大化。有鉴于此，本发明提供一种药物组合物及其应用。

本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种药物组合物，包含VEGFR2选择性抑制剂阿帕替尼和组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK-J4。

将阿帕替尼和GSK-J4联合使用，其联合使用的药效大于单独药效，对骨肉瘤和骨肉瘤的发展具有明显的抑制效果。

经试验测定本发明提供的技术方案可明显抑制骨肉瘤细胞生长，具有较佳的抗肿瘤功效，本技术方案提供的两药联合中，使用量少，减少副作用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述阿帕替尼和GSK-J4的摩尔比为(1～3)：(1～3)。

在本发明的一些具体实施方案中，所述阿帕替尼使用浓度为10-100mg/kg；所述GSK-J4的使用浓度为5-50mg/kg。

本发明还提供了所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述骨肉瘤细胞为143B细胞和SJSA1细胞。

本发明对药物的剂型不作限定，凡是药物领域接受的剂型均在本发明的保护范围之内。

附图说明

图1示采用细胞活力实验测定阿帕替尼和GSK-J4分别对骨肉瘤细胞的存活率的抑制作用；

图2示两种药物对骨肉瘤细胞的存活率的抑制作用存在协同效果；图2A为协同指数的测定。图2B为两种药物联合与两种药物单独使用相比，对骨肉瘤细胞的存活率的抑制作用。

图3至图5示检测两药联合及阿帕替尼和GSK-J4单药分别对骨肉离细胞诱导凋亡作用；其中，图3A和图4为药物对于骨肉瘤细胞系143B细胞的作用，由左至右依次为对照组、GSK-J4组、阿帕替尼组、联合组。图3B和图5为药物对于骨肉瘤细胞系SJSA1细胞的作用，由左至右依次为对照组、GSK-J4组、阿帕替尼组、联合组。

图6示两药联合与相应单药相比，对骨肉瘤细胞143B细胞和SJSA1细胞在实验动物体内成瘤的抑制作用；其中，图6A为143B细胞组，由上至下依次为照组、GSK-J4组(50mg/kg)、阿帕替尼组(100mg/kg)、联合组(GSK-J4 50mg/kg加阿帕替尼100mg/kg)。图6B为SJSA1组，由上至下依次为照组、GSK-J4组(50mg/kg)、阿帕替尼组(100mg/kg)、联合组(GSK-J4 50mg/kg加阿帕替尼100mg/kg)。

具体实施方式

本发明公开了一种药物组合物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下实施案例中，抑制率+存活率＝1。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

1.实施例1

阿帕替尼(购自sel leck,货号S2221)和GSK-J4(购自sel leck,货号S7070)按照不同浓度配置好后待用。

通过MTT实验的方法，检测测试不同浓度药物对人骨肉瘤细胞143B和SJSA1增殖的影响。将处于指数级增长期的143B(ATCC编号CRL-8303TM，人源，上皮样贴壁生长)和SJSA1细胞(ATCC编号CRL-2098TM，人源，上皮样贴壁生长)，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，接种到96孔培养板中。在培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，加入不同浓度的测试药物，分别作用48h后终止培养，每孔加入20μl MTT(5mg/mL)，37℃避光孵育4h。然后将各个孔内液体弃去，加入150μL DMSO，震荡15min，使结晶物充分溶解，在酶标仪490nm波长下测定细胞光密度值。

采用上述MTT方法分别检测阿帕替尼和GSK-J4对骨肉瘤两种细胞系细胞的抑制作用。药物作用关系计算方法：生存率＝(实验组数值-空白组数值)/(对照组数值-空白组数值)

实验结果：

结果表明阿帕替尼和GSK-J4单独对143B和SJSA1细胞具有一定的抑制作用(图1)。

2.实施例2

进而考察阿帕替尼和GSK-J4联用对143B和SJSA1细胞的增殖抑制作用，通过计算获得药物相互作用指数CI。

采用MTT法测定

阿帕替尼和GSK-J4单药及上述两种药物联合对143B和SJSA1细胞增殖的抑制效应。

实验分组：实验分组143B和SJSA1细胞系分别处理如下：1)空白对照组：未加任何药物处理；2)各单药组：阿帕替尼组：在40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μmol/L阿帕替尼作用下培养48h；GSK-J4组：在20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μmol/LGSK-J4作用下培养48h；3)联合用药组：阿帕替尼+GSK-J4组：40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μmol/L阿帕替尼分别与20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μmol/LGSK-J4作用下培养48h；每组设3个复孔，实验重复3次，取平均值为最终结果。

细胞活力测定同实施例1中，联合指数测定应用CalcuSyn software(Bio-soft，Ferguson，MO，美国)软件分析协同指数(Combi-nation index，CI)，结果分别以CI<1代表具有协同作用，≈1为相加作用，>1为拮抗作用

结果发现，阿帕替尼和GSK-J4联合使用时，可以在不同浓度(0.1μg/ml～100μg/ml)下表现出对骨肉瘤细胞的协同抑制作用(图2A)。

对于SJSA1细胞系，当抑制率(fa)<20％时，CI>1，此时两药具有拮抗效应,fa>20％均有协同效应；而对于143B，fa范围内均有协同效应，fa在100％左右，CI值最小，此时协同效应最显著(图2A)。

然后固定两种药物的比例和浓度，检测联合用药的协同效应。实验分组如下：1)空白对照组：未加任何药物处理；2)各单药组：阿帕替尼组：在10μmol/L阿帕替尼作用下培养24h、48h、和72h；GSK-J4组：在5μmol/LGSK-J4作用下培养24h、48h、和72h；3)联合用药组：阿帕替尼10μmol/L阿帕替尼与5μmol/LGSK-J4作用下培养24h、48h、和72h。对于24h、48h、和72h时间点的细胞活力测定，阿帕替尼和GSK-J4联合时，对143B和SJSA1细胞的增殖抑制作用均强于各单药组(P<0.05)(图2B)。

为确定阿帕替尼和GSK-J4联合使用对骨肉瘤细胞是否具有更强的细胞凋亡作用，采用Annexin V-FITC/PI双染的方法，通过流式细胞仪检测经阿帕替尼和GSK-J4单药及上述两种药物联合处理12h后的143B和SJSA1细胞的凋亡诱导效应。

实验过程为不同组药物分别作用于105个143B或SJSA1细胞12h，离心得细胞，洗涤后用双染试剂AnnexinV-FITC/PI染色15～20min，离心、洗涤，用染色Buffer重悬后，流式细胞仪测定FITC/PI对应的荧光通道，正常细胞为FITC-/PI-，凋亡早期细胞为FITC+/PI-，凋亡晚期及坏死细胞为FITC+/PI+。

结果显示，与单药组比较，阿帕替尼和GSK-J4联合使用对骨肉瘤143B和SJSA1细胞的诱导细胞凋亡作用显著增强，差异有极其显著的统计学意义(P<0.01)。(图3A和3B，图4、图5)。

3.实施例3

将骨肉瘤细胞143B和SJSA1细胞进行细胞培养，待细胞处于指数级增长期时，用胰酶消化，收集细胞，用无菌生理盐水制成1×107个/mL的细胞悬液，皮下注射于雄性裸鼠左侧腋下位置处，每只0.2mL。每日观测小鼠状况，用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短径(b)，根据公式V(mm3)＝(a×b2)/2计算瘤体积。待肿瘤体积达到80～100mm3时，将动物随机分为4组，每组5只。分别为：①对照组：生理盐水；②阿帕替尼组：100mg/kg；③GSK-J4组：50mg/kg；④联用组：阿帕替尼100mg/kg+GSK-J4 50mg/kg。采用对照组、阿帕替尼组、GSK-J4组和联用组隔日一次腹腔给药，连续给药5次。27天后，颈部脱臼处死小鼠，将肿瘤剥离、称重，对比肿瘤生长大小。

实验结果

如图6所示，两者联合使用时，移植瘤的生长被更大程度地抑制。结果表明联合给药组显著降低小鼠肉瘤体积和瘤重。