一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102047842 B (45)授权公告日 2012.07.25 CN 102047842 B *CN102047842B* (21)申请号 200910073169.9 (22)申请日 2009.11.10 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 东北农业大学 地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木材 街 59 号 (72)发明人 刘宏宇 陈磊 怀凤涛 秦智伟 周秀艳 CN 1806529 A,2006.07.26, 全文 . 周林等 . 诱导西瓜离体器官再生的主要影响 因素 .中国蔬菜 .2009,( 第 18 期 ),64-67. 宋道军等。

2、 . 西瓜高效组织培养再生体系的初 步研究 . 中国西瓜甜瓜 .2000,( 第 4 期 ),8-11. 张志忠等 . 西瓜高频再生系统的研究 . 中国 农学通报 .2004, 第 20 卷 ( 第 2 期 ),151-153. (54) 发明名称 一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种通过西瓜子叶节离体培 养直接再生植株的方法， 属于生物技术领域。包 括以下步骤 ： (1) 采用西瓜品种傲龙早蜜龙的种 子为材料培育无菌苗。(2) 在生长点下 3-4mm 处 切去下胚轴， 纵向切开胚轴， 刮除顶芽、 然后切除 2/3 子叶， 获得西瓜子叶节。(3) 将子叶节种于。

3、不 定芽诱导培养基 Ms5 上， 经过 14d 的培养， 出现不 定芽 ； 继续培养 20-25d， 即可获得 0.5-1.0cm 不 定芽。(4) 将不定芽移入伸长培养基中继续培养 25 30d， 不定芽可长到 3-4cm。(5) 将获得的不 定芽移入生根培养基， 获得再生植株。 通过本发明 的实施， 可以直接获得完整的西瓜再生植株， 为西 瓜的基因工程提供的培养技术。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吴涛 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 一种采用西瓜子叶节。

4、为外植体直接进行西瓜植株再生的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤 ： (1) 无菌苗的培育 ： 挑选成熟饱满的西瓜种子， 用1H2O2浸泡7-8h后， 去除种皮， 先75的酒精消毒60s， 用无菌水冲洗 2-3 次， 再用 15 NaClO 消毒 15min， 无菌水冲洗 4-5 次， 接到萌发培养基上， 萌发培养基为 0.8琼脂 ； 接种后， 置于 282连续黑暗条件下培养 3d， 再置于培养温度 为 262， 16hr、 3000Lux 光照条件下培养 2-3d ； (2) 子叶节的获得 ： 播种后 5-6d， 当无菌苗子叶由黄转呈浅绿色时， 在生长点下 3-4mm 处切去下胚轴， 纵向。

5、 切开胚轴， 刮除顶芽、 然后切除 2/3 子叶， 获得西瓜子叶节 ； (3) 不定芽的诱导 ： 将子叶节接种于不定芽诱导培养基Ms5上， 在温度为262， 16hr、 3000Lux光照条件 下培养14d后可出现不定芽 ； 不定芽出现后， 再经过20-25d的培养， 即可获得0.5-1.0cm不 定芽 ； 每 2 周更换一次培养基 ； 所述的诱导培养基 Ms5 是按照每升 MS 基本培养基加入 30g 蔗糖、 8g 琼脂、 5.0mgAgNO3、 1.0mg 6-BA 和 0.1mg IBA 配制而成， 并用 0.1M 的 KOH 溶液将 pH 调整为 5.8 ； (4) 不定芽的伸长 ： 。

6、将 0.5-1cm 不定芽移入伸长培养基中继续培养 ； 经过 25-30d 培养后， 不定芽可长到 3-4cm ； 每 2 周更换一次培养基 ； 所述的伸长培养基是按照每升 MS 基本培养基加入 30g 蔗糖、 8g 琼脂、 0.2mg KT 配制而 成， 并用 0.1M 的 KOH 溶液将 pH 调整为 5.8 ； (5) 生根培养 ： 将 3-4cm 的不定芽移入生根培养基中 ； 培养 10-14d 即可生根 ； 所述的生根培养基是按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、 8g琼脂和0.5mg NAA配制 而成， 并用 0.1M 的 KOH 溶液将 pH 调整为 5.8 ； (6) 再生植株。

7、的驯化 ： 当再生植株根长至 2cm 左右时， 揭去封口膜， 进行驯化， 2-3d 后， 用镊子将生根苗取出， 移栽于灭菌的营养土中， 并用透明的塑料薄膜覆盖保湿， 放在培养室中。 权 利 要 求 书 CN 102047842 B 2 1/4 页 3 一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域。 是一种以西瓜子叶节为外植体直接进行西瓜植株再生 的方法。 技术背景 0002 西瓜(Citrullus lanatus)是一种重要的蔬菜作物， 其果实汁多味甜， 富含番茄素 和维生素。据联合国粮农组织 (FAO)2002 年统计， 西瓜在世界 10 大果品中居第 。

8、5 位。在 春节早熟栽培时， 西瓜容易遭受冷害、 病害等各种不利因素的影响， 导致其产量和品质的降 低。 随着人民生活水平的提高， 人们对西瓜种类和品质的要求越来越高， 希望一年四季不断 有高品质、 不同品种的西瓜产品上市。 通过离体培养、 遗传转化和体细胞无性系突变体筛选 获得多抗、 高品质的西瓜品种已成为重要的育种手段之一。西瓜离体培养已经有几十年的 历史， 并且从茎尖培养、 不定芽诱导和体细胞胚胎发生等各种途径对西瓜离体培养进行了 研究。 0003 国内外研究人员以西瓜的茎尖、 幼胚、 子叶和胚轴等多种类型的外植体， 采用不同 浓度的植物生长调节物质的配比， 建立了西瓜的器官发生再生系统。

9、。不同的外植体再生频 率差异较大， 其中以子叶的再生频率较高， 是进行西瓜植株再生培养最有效的途径和方法。 目前， 已有很多关于西瓜子叶再生植株的报道， 但以西瓜子叶节为外植体直接诱导不定芽 进行西瓜植株再生的方法还未见报道。同时， 在组织培养过程中， 对种子消毒、 器官发生过 程中各种培养基的应用还比较混乱， 对植株再生频率也产生了很大的影响。无菌苗的获得 离不开有效的种子消毒方法， 常用的消毒剂有次氯酸钠、 过氧化氢和升汞等， 在西瓜组织培 养中以应用升汞和次氯酸钠居多。在组织培养过程中， 尤其重要的是培养基的选择及其激 素的添加， 这对外植体不定芽的诱导、 伸长和生根都有重要的影响， 是。

10、决定外植体器官发生 和植株再生的关键环节。因此， 要建立简便、 高效的西瓜子叶节直接再生系统， 必须在相应 培养基中添加必要的生长激素， 并确定合理添加浓度。 0004 为此， 我们针对上述问题， 提供一种利用西瓜子叶节直接再生植株的方法， 使其建 立一个简便、 高效的繁殖体系， 阵低成本， 达到获得优良种苗的目的， 也为西瓜转基因研究 提供一种新技术手段。 0005 参考文献 0006 1. 京欣一号西瓜子叶组织培养的研究 . 王春霞， 简志英， 刘愚， 邹琦， 园艺学 报 .1996， 23(4) ： 401-403 0007 2. 西瓜组织培养的研究与应用 . 任春梅， 董延瑜 . 长江。

11、蔬菜， 2001， (12) ： 30-32. 0008 3. 西瓜高频再生系统的研究 . 张志忠， 吴著华， 吕柳新 . 中国农学通报， 2004， 20(2) ： 151-153. 0009 4. 西瓜子叶组织培养及植株再生的研究 . 常尚连， 张立宾， 于德花， 徐化凌 . 湖北 农业科学 .2009， 48(3) ： 533-535. 说 明 书 CN 102047842 B 3 2/4 页 4 发明内容 0010 针对现有技术中存在的不足之处， 本发明提供了一种西瓜子叶节直接再生植株的 方法。本发明是通过以下技术方案实现的， 包括以下步骤 ： 0011 (1) 无菌苗的培育。 001。

12、2 挑选成熟饱满的西瓜品种傲龙早蜜龙的种子， 用 1 H2O2浸泡 7-8hr 后， 去除种 皮， 在超净工作台上， 先 75的酒精消毒 60s， 用无菌水冲洗 2-3 次， 再用 15 NaClO 消 毒 15min， 无菌水冲洗 4-5 次， 接到萌发培养基上， 萌发培养基为 0.8琼脂。接种后， 置于 282连续黑暗条件下， 培养 3d， 再置于培养温度为 262， 16hr、 3000Lux 光照条件下 培养 2-3d。 0013 (2) 子叶节的获得。 0014 播种后 5-6d， 当无菌苗子叶由黄转呈浅绿色时， 在生长点下 3-4mm 处切去下胚轴， 然后纵向切开胚轴， 刮除顶芽、。

13、 再切除 2/3 子叶， 获得西瓜子叶节。 0015 (3) 不定芽的诱导。 0016 诱导培养基 Ms5 是按照每升 MS 基本培养基加入 30g 蔗糖、 8g 琼脂、 5.0mgAgNO3、 1.0mg6-BA 和 0.1mg IBA 配制而成， 并用 0.1M 的 KOH 溶液将 pH 调整为 5.8。 0017 将子叶节 ( 子叶的近轴面朝上 ) 接种于不定芽诱导培养基 Ms5 上， 在温度为 262， 16hr、 3000Lux光照条件下培养， 14d后出现不定芽。 不定芽出现后， 再经过20-25d 的培养， 即可获得 0.5-1.0cm 不定芽。每 2 周更换一次培养基。 001。

14、8 (4) 不定芽的伸长 0019 伸长培养基是按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、 8g琼脂、 0.2mg KT配制而成， 并用 0.1M 的 KOH 溶液将 pH 调整为 5.8。 0020 将 0.5-1cm 不定芽移入伸长培养基中继续培养。经过 25-30d 培养后， 不定芽可长 到 3-4cm。每 2 周更换一次培养基。 0021 (5) 生根培养。 0022 将 3-4cm 的不定芽移入生根培养基中。培养 10-14d 即可生根。 0023 生根培养基是按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、 8g琼脂和0.5mg NAA配制而 成， 并用 0.1M 的 KOH 溶液将 pH 调整。

15、为 5.8。 0024 (6) 再生植株的驯化。 0025 当再生植株根长至 2cm 左右时， 揭去封口膜， 使无菌苗适应有菌的外界环境， 2-3d 后向培养瓶中注入清水， 用镊子将生根苗取出， 流动水冲洗净根部培养基， 移栽于灭菌的营 养土中， 并用透明的塑料薄膜覆盖保湿， 放在培养室中。2 周左右揭去薄膜并进行炼苗， 4 周 后即可与实生苗长势相同。 西瓜再生苗在东北农业大学园艺试验站进行种植， 结果表明 ： 西 瓜再生苗与实生苗长势相同。 0026 本发明在研究过程中， 具体考虑了以下几种因素在本发明中所起的作用 ： 0027 (1) 种子处理对西瓜无菌苗的影响 0028 无菌萌发是植物。

16、组织培养中最基础的一环， 对发芽率和以后不定芽的分化有着直 接的影响。用 1 H2O2浸泡西瓜种子 7-8h， 能明显提高发芽率， 而且无菌苗整齐度高， 长势 好， 有利于再生出不定芽 ( 见表 1)。 0029 表 1 不同处理方式对西瓜种子萌发的影响 说 明 书 CN 102047842 B 4 3/4 页 5 0030 0031 (2) 不同激素配比对不定芽的诱导和植株再生的影响 0032 在每升 MS 基本培养基中加入 30g 蔗糖、 8g 琼脂和 5.0mg AgNO3的基础上， 添加不 同配比的激素， 并调节 pH 到 5.8， 制成相应的不定芽诱导培养基。具体见表 2。 0033。

17、 表 2 不同芽诱导培养基的激素配比及诱导效率 0034 0035 将西瓜品种傲龙早蜜龙的子叶节接种于不同激素配比的不定芽诱导培养基上， 在 培养温度为 262， 16hr、 3000Lux 光照条件下， 诱导不定芽。 0036 结果表明 ： 采用Ms5培养基(每升MS基本培养基中加入30g蔗糖、 8g琼脂及5.0mg AgNO3基础上， 再添加 1.0mg 6-BA 和 0.1mg IBA) 诱导西瓜不定芽的效果最好， 不仅诱导效 率高， 而且质量好， 因次， 确定 Ms5 培养基为不定芽诱导的最适培养基。 具体实施方式 0037 结合本发明的内容提供以下实施例， 具体实施如下 ： 0038。

18、 (1) 无菌苗的培育。 0039 挑选成熟饱满的西瓜品种傲龙早蜜龙的种子， 用 1 H2O2浸泡 7-8hr 后， 去除种 皮， 在超净工作台上， 先 75的酒精消毒 60s， 用无菌水冲洗 2-3 次， 再用 15 NaClO 消 毒 15min， 无菌水冲洗 4-5 次， 接到萌发培养基上， 萌发培养基为 0.8琼脂。接种后， 置于 282连续黑暗条件下， 培养 3d， 再置于培养温度为 262， 16hr、 3000Lux 光照条件下 培养 2-3d。 0040 (2) 子叶节的获得。 0041 播种后 5-6d， 当无菌苗子叶由黄转呈浅绿色时， 在生长点下 3-4mm 处切去下胚轴，。

19、 然后纵向切开胚轴， 刮除顶芽、 再切除 2/3 子叶， 获得西瓜子叶节。 0042 (3) 不定芽的诱导。 0043 按每升MS基本培养基中加入30g蔗糖、 8g琼脂、 5.0mg AgNO3、 1.0mg 6-BA和0.1mg 说 明 书 CN 102047842 B 5 4/4 页 6 IBA 配制成不定芽诱导培养基， 并用 0.1M 的 KOH 溶液将 pH 调整为 5.8。 0044 将子叶节 ( 子叶的近轴面朝上 ) 接种于不定芽诱导培养基上， 在温度为 262， 16hr、 3000Lux 光照条件下培养， 14d 后出现不定芽。不定芽出现后， 再经过 20-25d 的培养， 即。

20、可获得 0.5-1.0cm 不定芽。每 2 周更换一次培养基。 0045 (4) 不定芽的伸长 0046 将0.5-1cm不定芽移入伸长培养基(按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、 8g琼 脂、 0.2mg KT配制而成， 并用0.1M的KOH溶液将pH调整为5.8。 )中继续培养。 经过25-30d 培养后， 不定芽可长到 3-4cm。每 2 周更换一次培养基。 0047 (5) 生根培养。 0048 将3-4cm的不定芽移入生根培养基(按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、 8g琼 脂和 0.5mg NAA 配制而成， 并用 0.1M 的 KOH 溶液将 pH 调整为 5.8) 中。培养 10-14d 即可 生根。 0049 (6) 再生植株的驯化。 0050 当再生植株根长至 2cm 左右时， 揭去封口膜， 使无菌苗适应有菌的外界环境， 2-3d 后向培养瓶中注入清水， 用镊子将生根苗取出， 流动水冲洗净根部培养基， 移栽于灭菌的营 养土中， 并用透明的塑料薄膜覆盖保湿， 放在培养室中。2 周左右揭去薄膜并进行炼苗， 4 周 后即可与实生苗长势相同。 西瓜再生苗在东北农业大学园艺试验站进行种植， 结果表明 ： 西 瓜再生苗与实生苗长势相同。 说 明 书 CN 102047842 B 6 。