氟取代的3,5-二氰基-4-(1H-吲唑-5-基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶衍生物和其使用方法本发明涉及具有蛋白质酪氨酸激酶抑制活性的新的氟取代的3,5-二氰基-4-(1H-吲唑-5-基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶衍生物、其制备方法和其用于治疗c-Met-介导的疾病或c-Met-介导的病症的用途，尤其是癌症及其它增殖病症。
癌症是流传最广的疾病之一。在世界范围内，在2002年，超过四百四十万人诊断患有乳房、结肠、卵巢、肺或前列腺癌，超过二百五十万人死于这些破坏性疾病(Globocan 2002 Report, http://www-dep.iarc.fr/globocan/down-loads.htm)。单独在美国，在2005年，预计有一百二十五万以上新的病例，并且五十万人因癌症而死去。预计这些新的病例的大部分是结肠癌(～100000)、肺癌(～170000)、乳房癌(～210000)和前列腺癌(～230000)。在下一个十年，预计癌症的发病率和流行率增加大约15%，反映了1.4%的平均增长率(American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2005; http://www.cancer.org/docroot/STT/content/STT_1x_Cancer_Facts_Figures_2007.asp)。
癌症的产生有许多途径，这也是它们难以治疗的理由之一。一个途径是由癌基因蛋白(oncoproteins)将细胞转化，这种癌基因蛋白(oncoproteins)是通过遗传突变由正常细胞蛋白产生的，遗传突变导致这些蛋白的非生理性激活。能够衍生许多癌基因蛋白(oncoproteins)的一个蛋白家族是酪氨酸激酶(例如src激酶)，尤其是受体酪氨酸激酶(RTKs)。在过去的二十年，许多研究方法已经说明了受体酪氨酸激酶(RTK)介导的信号在调节哺乳动物细胞生长方面的重要性。近来，临床上使用酪氨酸激酶的选择性小分子抑制剂作为抗肿瘤发生药剂已经取得了效果。
c-Met受体还是受体酪氨酸激酶。在1980年代初，当从化学诱导的人骨肉瘤细胞系(其含有Met基因的激酶域，其中的激酶域在它的N-末端融合成为二聚域)中分离出突变Met时，确定了它的致癌潜力[C.S. Cooper等人，Nature 311: 29-33(1984)]。
细胞Met蛋白是以单链190 kd前体物形式合成的杂二聚体跨膜蛋白[G.A. Rodrigues等人，Mol. Cell Biol. 11: 2962-70(1991)]。该前体物在氨基酸残基307之后进行细胞内裂解，形成通过二硫桥连接的50 kd α-链和145 kd β-链。α-链完全存在于胞外，而β-链跨(span)质膜。β-链由N端sema域组成，其与α-链一起介导配体结合。β-链的胞外域的其余部分由半胱氨酸富集域和四个免疫球蛋白域组成，并且继之以跨膜区(transmembrane region)和胞内域(intracellular domain)。胞内域包括近膜区(juxtamembrane region)、激酶域和C端域，其介导下游信号。配体结合时，诱导受体的二聚化，并且激酶域在近膜区(juxtamembrane region)(Y1003)、激酶的激活环(Y1234和Y1235)和羧基终端域(Y1349和Y1356)被酪氨酸自磷酸化步骤的级联激活。磷酸化的Y1349和Y1356包含多个底物引入位点，用于结合下游c-Met信号所必需的衔接蛋白[C. Ponzetto等人，Cell 77: 261-71(1994)]。c-Met信号的一种最重要的底物是衔接蛋白（scaffolding adaptor protein）Gab1，其通过特殊的磷酸酪氨酸结合位点(称为mbs∶met结合位点)与Y1349或Y1356结合，导致独特的、延长的胞内信号。另一个重要的底物是衔接蛋白Grb2。根据细胞环境，这些衔接子介导各种胞内信号途径的激活，如同通过ERK/MAPK、PI3K/Akt、Ras、JNK、STAT、NFκB和β-连环蛋白（β-catenin）的信号途径。
c-Met唯一地被肝细胞生长因子(HGF)(亦称扩散因子(scatter factor))和它的剪接变体(这是它的唯一已知的生物学活性配体)激活[L. Naldini等人，Oncogene 6: 501-4(1991)]。HGF具有独特的结构，其显示了与纤溶酶原(plasminogen)家族的蛋白酶的相似性。它由氨基-终端域、继之以四个kringle域和丝氨酸蛋白酶同源域组成，其没有酶催活性。与c-Met相似，HGF是以非活性的单链前体物(pro-HGF)形式合成的，其在细胞外被丝氨酸蛋白酶(例如纤溶酶原激活物和凝血因子)分解，并且转变为二硫化物连接的活性α-和β-链杂二聚体。HGF高度亲合性地结合硫酸乙酰肝素粘蛋白，这会使它主要与胞外基质结合，并限制它的扩散。晶体结构分析表明，HGF形成二聚体，当其与c-Met结合时，可以诱导受体的二聚化。
HGF被间质细胞（mesenchymal cells）表达，并且它与c-Met的结合(这种结合尤其是在上皮细胞中广泛地表达)在各种组织(包括上皮、内皮、神经元和造血细胞)中导致多向性效应。这种效应一般包括一种或所有下列现象∶i)促有丝分裂的刺激作用；通过HGF对肝细胞的促有丝分裂活性来鉴定HGF；ii)侵入和迁移的刺激作用；在独立的实验方法中，基于HGF对细胞运动性(“扩散”)的诱导，将HGF确定为扩散因子；和iii)形态发生(小管发生)的刺激作用。在胶原基质中，HGF诱导犬肾脏细胞的支管的形成。此外，源自于遗传改变的小鼠和细胞培养实验的证据表明，c-Met起存活受体的作用，并且保护细胞免于细胞凋亡[N. Tomita等人，Circulation 107: 1411-1417(2003); S. Ding等人，Blood 101: 4816-4822(2003); Q. Zeng等人，J. Biol. Chem. 277: 25203-25208(2002); N. Horiguchi等人，Oncogene 21: 1791-1799(2002); A. Bardelli等人，Embo J. 15: 6205-6212(1996); P. Longati等人，Cell Death Differ. 3: 23-28(1996); E.M. Rosen, Symp. Soc.Exp. Biol. 47: 227-234(1993)]。由于HGF协调这些生物过程的实施，导致特异性遗传程序，被称为“侵袭性生长（invasive growth）”。
在正常情况下，c-Met和HGF对小鼠的胚胎发育是不可缺少的，尤其是胎盘和肝的形成和四肢体节的成肌细胞的方向性迁移。c-Met或HGF基因的遗传性破环产生相同的表型，这显示了它们的独特相互作用。还没有充分了解c-Met/HGF在成年有机体中的生理作用，但实验证据说明，它们与创伤愈合、组织再生、红细胞生成和组织动态平衡有关。
癌基因蛋白(oncoproteins)TPR-MET的鉴别首先表明了c-Met可以在致肿瘤性中起一定作用。其它确实证据源自于许多不同的实验方法。在人和鼠的细胞系中，c-Met或HGF的超表达诱导致肿瘤性和转移性的表型(当在裸鼠中表达时)。在小鼠中，c-Met或HGF的转基因超表达诱导致肿瘤性。
最使人感兴趣的是，已经在偶发和遗传性乳头状肾癌(HPRC)以及在其它癌症类型(例如肺、胃、肝、头和颈、卵巢和脑癌)中确定了c-Met的歧义突变或激活了受体的突变。显著的是，HPRC家族中的特异性c-Met突变与疾病分离，在c-Met激活和人癌症之间形成因果联系[L. Schmidt等人，Nat. Genet. 16: 68-73(1997); B. Zbar等人，Adv. Cancer Res. 75: 163-201(1998)]。具有最强转变活性的激活突变位于激活环(D1228N/H和Y1230H/D/C)和相邻的P+1环(M1250T)中。在催化环附近和在激酶域的A叶（lobe）之内已经发现了其它的较弱的突变。此外，在肺肿瘤中，已经在c-Met的近膜区(juxtamembrane region)观察到一些突变，其不直接激活激酶，而是通过使得蛋白抵抗泛素化作用和随后的降解[M. Kong-Beltran等人，Cancer Res. 66: 283-9(2006); T.E. Taher等人，J. Immunol. 169: 3793-800(2002); P. Peschard等人，Mol. Cell 8: 995-1004(2001)]。有趣的是，在各种癌症中，c-Met的体细胞突变与侵入性提高和大范围的转移病变有关。尽管种系和体细胞突变的频率很低(低于5%)，但在没有突变的情况下，已经观察到通过旁分泌或自分泌机理导致c-Met信号失调的其它主要机理。在源自于间质细胞的肿瘤中，例如骨肉瘤或横纹肌肉瘤，已经观察到旁分泌激活，其生理性地产生HGF，并且在恶性胶质瘤和乳房癌中发现，其是外胚层起源的。
然而，最常见的病例其中是c-Met过度表达的癌，这种过度表达在结肠、胰腺、胃、乳房、前列腺、卵巢和肝癌中可以观察到。正如在胃和肺肿瘤细胞系中所观察到的那样，超表达可以例如通过基因增强产生。最近，在对EGF受体抑制获得抗性的肺肿瘤细胞系中检测到了c-Met的超表达[J.A. Engelmann等人，Science 316: 1039-1043(2007)]。超表达c-Met的一些上皮肿瘤还共同表达HGF，产生自分泌c-Met/HGF刺激环，并由此防止对基质细胞衍生的HGF的需要。
总之，已经发现c-Met在人癌症中的异常激活典型地与预后差有关，而与特定机理无关[J.G. Christensen等人，Cancer Lett. 225: 1-26(2005)]。
总之，已经进行了许多体外和体内研究，验证c-Met作为重要的癌症靶向，详细一览表可以在http∶//www.vai.org/met中看到[C. Birchmeier等人，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 915-25(2003)]。为了衰减人肿瘤中的异常Met信号，已经采取了一些策略，包括HGF拮抗剂和小分子抑制剂，还有其它的策略。目前临床上开发了许多小分子抑制剂，例如ARQ-197(Arqule)，foretinib(XL-880，Exelixis/GSK)和PH-2341066(Pfizer)；近来已经对它们进行了评述[J.J. Cui, Expert Opin. Ther. Patents 17: 1035-45(2007)]。
在WO 2006/066011-A2中，已经描述了卤代烷基取代的3-氰基-1,4-二氢吡啶衍生物(在4位具有芳基或杂芳基)作为甾体受体和钙通道活性的调节剂，由此特别可用于治疗心血管疾病。在WO 2006/074419-A2中，已经主张了使用4-苯基-1,4-二氢吡啶衍生物来治疗阿尔茨海默氏病的方法。
近来已经在WO 2008/071451-A1中公开了具有c-Met激酶抑制活性的各种取代的3-氰基-4-杂芳基-1,4-二氢吡啶。然而，在这种新结构类别的c-Met抑制剂的进一步调查期间，候选化合物常常受到不能令人满意的口服生物利用率的连累，由大鼠中的血液清除率测定数据可知，这种口服生物利用率显著地低于最初期望的口服生物利用率。因为口服生物利用率还取决于化合物被吸收的好坏程度，和这些化合物的药物动力学和物理化学特性，因此假定低溶解度和/或经胃肠道的不充分的渗透性可能导致吸收中的这种限制。
因此，按照本发明解决的技术问题可以在对c-Met激酶具有有效抑制活性的另一种化合物的鉴定过程中看到，这些化合物显示了溶解度和/或渗透性提高，随后导致口服给予这些化合物之后所吸收的部分增加。
意外地，现在已经发现，某些3,5-二氰基-4-(1H-吲唑-5-基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶衍生物，其中2位和6位的至少一个甲基被二氟甲基或取代的二氟甲基取代，显示出显著提高的体外渗透性能，而且还转变为这种化合物的提高的口服生物利用率(被在大鼠中进行的药物动力学体内试验所证实)。
由此，在一方面，本发明涉及通式(I)的氟取代的3,5-二氰基-4-(1H-吲唑-5-基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶衍生物
（I）,
其中
R1是氢，氟，甲基或乙基，
R2是甲基，二氟甲基或三氟甲基，
R3是氢或氟，
R4是氢，甲基或乙基，
和
R5是氢或甲基。
在优选实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中
R5是氢。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中
R1是氢或氟。
在进一步优选实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中
R1是氢或氟，
R2是甲基或二氟甲基，
R3是氢或氟，
R4是氢或甲基，
和
R5是氢。
在特别优选实施方案中，本发明涉及按照式(I)的化合物，其选自下列化合物
rac-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈；
(4R)-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈；
(4S)-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈；
rac-2-(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈；
(4R)-2-(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈；
(4S)-2-(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈；
2,6-二(二氟甲基)-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈；
2,6-二(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈；
和
rac-4-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈。
此外，意想不到地发现，在适度碱性条件下，含有未取代的二氢吡啶氮原子的本发明的化合物[在式(I)中，R5=H]可以转变为稳定的盐形式，得到含有去质子化氮原子的明确的1,4-二氢吡啶。这些前所未有的发现提供了能够提高溶解度和有利地影响吸收性能的其它选择。
由此，在第二个方面，本发明涉及具有通式(I-A)的氟取代的3,5-二氰基-4-(1H-吲唑-5-基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶的盐
(I-A),
其中
R1、R2、R3和R4具有如上所述的含义，
和
Q+是碱金属阳离子或季铵阳离子。
在优选实施方案中，本发明涉及式(I-A)的二氢吡啶盐，其中
Q+是钠或钾阳离子或2-羟基乙基三甲基铵(胆碱)阳离子。
在特别优选实施方案中，本发明涉及式(I-A)的二氢吡啶盐，其中
Q+是2-羟基乙基三甲基铵(胆碱)阳离子。
按照本发明的化合物和盐还可以以水合物或溶剂化物形式存在。
本发明目的的盐优选是按照本发明化合物的可药用盐(例如，参见S. M. Berge等人， "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19)。
本发明的化合物或盐的水合物是该化合物或盐与水的化学计量组合物，例如，半、一或二水合物。
本发明化合物或盐的溶剂化物是该化合物或盐与溶剂的化学计量组合物。
在本发明背景下，季铵阳离子是指具有与氮原子连接的四个相同或不同的直链或支链烷基的四烷基铵阳离子，其中每个烷基具有1至6个碳原子，其中每个烷基可以进一步被羟基取代。可以优选提及的实例是∶四甲基铵，四乙基铵，四正丁基铵，和2-羟乙基三甲基铵(胆碱)。
本发明的化合物和盐可以由于不对称中心的性质或阻旋作用而存在异构体形式(对映体，非对映体)。可以存在任何异构体，其中不对称中心是(R)-、(S)-或(R,S)-构型。
本发明化合物的所有异构体(无论是否分离、纯化、部分纯化或非对映体或外消旋混合物形式)包括在本发明范围内。应理解，纯的非对映体和纯的对映体代表优选实施方案。所述异构体的纯化和所述异构体混合物的分离可以利用本领域已知的标准技术来实现。例如，可以利用色谱方法或结晶方法将非对映体混合物分离为单一异构体，并且可以利用色谱方法(在手性相上)或拆分方法将外消旋体分离为相应的对映体。
另外，按照本发明，包括上述化合物和盐的所有可能的互变异构形式。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备通式(I)化合物和/或通式(I-A)的二氢吡啶盐的方法，其特征在于：首先使式(II)的吲唑基醛
(II),
其中R3和R4具有上述含义，
在酸、酸/碱组合和/或脱水剂的存在下，与式(III)的酮腈或其烯醇钠盐反应，其中R2具有如上所述的含义，得到式(IV)的化合物
(III)
(IV),
其中R2、R3和R4具有如上所述的含义，
然后，在氨源(例如乙酸铵)的存在下，后者与式(V)的烯胺腈(其中R1具有如上所述的含义)或与式(VI)的酮腈(其中R1具有如上所述的含义)缩合，得到式(I-B)的化合物
(V),
(VI),
(I-B),
其中R1、R2、R3和R4具有如上所述的含义，
而后任选地
[A] 在碱的存在下，使用式(VII)的化合物(其中X代表离去基团，例如卤素、甲磺酸基、三氟甲磺酸基、甲苯磺酸基或硫酸基)将二氢吡啶N-甲基化，得到式(I-C)的化合物
CH3－X (VII),
(I-C),
其中R1、R2、R3和R4具有如上所述的含义，
或
[B] 用式(VIII)的试剂处理二氢吡啶盐形式，
Q+ Z－ (VIII),
其中Q+具有上述含义，
和
Z－代表碱性阴离子，例如氢氧根，碳酸根或碳酸氢根，
得到式(I-A)的1,4-二氢吡啶盐
(I-A),
其中R1、R2、R3、R4和Q+具有如上所述的含义，
如果合适的话，随后任选：(i)将化合物(I-B)和(I-C)分离为它们的相应的对映体，优选使用色谱方法，和/或(ii)通过用相应的溶剂处理，将化合物(I-B)和(I-C)或盐(I-A)转化为它们的相应的水合物或溶剂化物。
可以在上述两个独立步骤中进行方法顺序(II)+(III)→(IV)、(IV)+(V)→(I-B)，或使用一锅法，即，不用明确的分离中间体化合物(IV)；在某些情况下，根据个体反应物的反应性，还可以进行化合物(II)、(III)和(V)的一个烧瓶/三组分的缩合反应[对于1,4-二氢吡啶的合成，通常参见，例如D.M. Stout, A.I. Meyers, Chem. Rev. 1982, 82, 223-243; H. Meier等人，Liebigs Ann. Chem. 1977, 1888; H. Meier等人，ibid. 1977, 1895; H. Meier等人，ibid. 1976, 1762; F. Bossert等人，Angew. Chem. 1981, 93, 755]。
方法步骤(II)+(III)→(IV)和(IV)+(V)/(VI)→(I-B)一般在惰性溶剂中、在+20℃至溶剂沸点的温度范围内、在常压下进行。
适合于此目的的溶剂是，例如，醇，例如甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，叔丁醇或正戊醇，烃，例如己烷，环己烷，苯，甲苯或二甲苯，卤代烃，例如二氯甲烷，三氯甲烷，四氯甲烷，三氯乙烷，1,2-二氯乙烷，氯苯或氯甲苯，醚，例如四氢呋喃，1,4-二噁烷或1,2-二甲氧基乙烷，或其它溶剂，例如乙腈或乙酸。使用这些溶剂的混合物也是可行的。反应(II)+(III)→(IV)优选在二氯甲烷、甲苯、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或正戊醇中、在相应的回流温度下、在常压下进行，反应(IV)+(V)/(VI)→(I-B)优选在乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇、二甲苯或乙酸中、也在回流温度下、在常压下进行。
反应(II)+(III)→(IV)可以优选在酸或酸/碱组合和任选的脱水剂(例如分子筛)的存在下进行。合适的酸催化剂的例子是乙酸，三氟乙酸，甲磺酸或对甲苯磺酸；合适的碱尤其是哌啶或吡啶。根据组分的反应性，转化(IV)+(V)→(I-B)可以不用其它辅助试剂就可以进行，或可以利用酸(例如乙酸)或叔胺碱(例如三乙胺或吡啶)来促进该反应。反应(IV)+(VI)→(I-B)通常在酸的存在下进行；优选，使用乙酸同时作为酸催化剂和溶剂或共溶剂
反应(IV)+(VI)→(I-B)的合适的氨源是，例如，甲酸铵，乙酸铵，氯化铵或硫酸氢铵；优选乙酸铵。
对于甲基化反应(I-B)+(VII)→(I-C)的惰性溶剂是，例如，醚，例如二乙醚，甲基叔丁基醚，四氢呋喃，1,4-二噁烷或1,2-二甲氧基乙烷，烃，例如苯，甲苯，二甲苯，己烷或环己烷，卤代烃，例如二氯甲烷，三氯甲烷，四氯甲烷，1,2-二氯乙烷，三氯乙烷，四氯乙烷，氯苯或氯甲苯，或其它溶剂，例如乙腈，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，N,N'-二甲基亚丙基脲(N,N'-dimethylpropylene urea, DMPU)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)或吡啶。使用这些溶剂的混合物也是可行的。优选，使用二氯甲烷，四氢呋喃，N,N-二甲基甲酰胺或其混合物。
适合于方法步骤(I-B)+(VII)→(I-C)的碱尤其是碱金属或碱土金属碳酸盐，例如碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙或碳酸铯，碱金属氢化物，例如氢化钠或氢化钾，空间位阻的碱金属醇化物，例如叔丁醇钠或叔丁醇钾，空间位阻的碱金属胺化物，例如二(三甲基甲硅烷基)胺化锂、二(三甲基甲硅烷基)胺化钠或二(三甲基甲硅烷基)胺化钾或二异丙基胺化锂，或有机胺，例如三乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、N,N-二异丙基乙胺或吡啶。优选使用碳酸钾、碳酸铯或氢化钠。
反应(I-B)+(VII)→(I-C)一般在常压下、在-20℃至+100℃的温度范围内进行，优选0℃至+50℃。
在形成盐的反应(I-B)+(VIII)→(I-A)中，试剂(VIII)通常使用其水溶液形式，并且该转化优选在水可混溶溶剂(例如乙醇或四氢呋喃)中、在+20℃至该溶剂的沸点的温度范围内、在常压下进行。
式(I)的化合物，其中R1是氢，R2是二氟甲基，或其中R1是氟，R2是三氟甲基[即，具有对称二氢吡啶2,6-二取代的式(I)的化合物]，和相应的式(I-A)的盐，也可以如下制备：在酸和任选脱水剂的存在下，式(II)的吲唑基醛(其中R3和R4具有如上所述的含义)与两个当量的式(V-A)的烯胺腈(其中R1A代表氢或氟)缩合，得到式(I-D)的化合物
(II),
(V-A),
(I-D),
其中R1A、R3和R4具有如上所述的含义，
然后分别按照类似于上述转化[A]和[B]，其可以转变为式(I-E)的N-甲基化的衍生物(其中R1A、R3和R4具有如上所述的含义)或式(I-F)的1,4-二氢吡啶盐(其中R1A、R3、R4和Q+具有如上所述的含义),
(I-E),
(I-F)。
方法步骤(II)+(V-A)→(I-D)通常在质子有机溶剂中进行，例如醇，例如甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，叔丁醇或正戊醇，或例如乙酸。使用这些溶剂的混合物也是可行的。优选，在酸催化剂(例如乙酸，三氟乙酸，甲磺酸或对甲苯磺酸)的存在下进行该反应，任选使用脱水剂(例如分子筛)作为进一步的添加剂。优选，乙酸同时用作溶剂和酸催化剂。
反应(II)+(V-A)→(I-D)一般在+20℃至相应溶剂的沸点的温度范围内、在常压下进行，优选在+60℃至+120℃的范围。
对于转化(I-D)→(I-E)和(I-D)→(I-F)，类似的反应条件，例如溶剂、碱和温度，分别适用上述用于类似转化(I-B)→(I-C)和(I-B)→(I-A)的方式。
式(II)、(III)、(V)、(V-A)、(VI)、(VII)和(VIII)的化合物是商购的化合物、文献已知的化合物或可以利用文献中所描述标准方法的修改方法、由容易获得的起始原料来制备(对于其它参考，参见下面的实验部分)。
本发明化合物的制备可以利用下列合成反应路线来举例说明。更详细方法提供于下面描述实施例的实验部分中。
反应路线1
反应路线2
反应路线3
在下文中，为了简洁起见，表述“本发明的化合物”、“式(I)的化合物”等等一般是指还包括由其衍生的式(I-A)的二氢吡啶盐。
使用方法
本发明的化合物是受体酪氨酸激酶(特别是c-Met受体酪氨酸激酶)的活性或表达的有效抑制剂。此外，本发明化合物的特点在于：口服给予之后，这些化合物在肠内上皮细胞中的高渗透率，导致显著提高的生物利用率(即，吸收部分提高)。因此，预计式(I)的化合物可作为高度有价值的治疗剂。
相应地，在另一个实施方案中，本发明提供了在需要这种治疗的患者中治疗与c-Met激酶活性有关或由其介导的病症的方法，该方法包括：给予患者有效量的上述式(I)的化合物。在某些实施方案中，与c-Met激酶活性有关的病症是细胞增殖病症，尤其是癌症。
贯穿本文件陈述的术语“治疗”是通常使用的术语，例如，为了抵御、减轻、降低、解除、改善疾病或病症(例如癌)的症状的目的而管理或照料患者。
术语“患者”或“病员”包括能够患有细胞增殖病症或另外可以从给予本发明化合物而受益的有机体，例如人和非人动物。优选的人包括：患有或倾向于患有本文所描述的细胞增殖病症或相关状态的人。术语“非人动物”包括脊椎动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类，羊，牛，狗，猫和啮齿类，例如，小鼠，和非哺乳动物，例如鸡，两栖动物，爬行动物，等等。
术语“与c-Met有关或由其介导的病症”包括与c-Met活性相关或涉及c-Met活性(例如，c-Met的活性过强)的疾病和伴随这些疾病的病症。“与c-Met有关或由其介导的病症”的例子包括：由c-Met的刺激过度(由于异常高数量的c-Met或c-Met的突变造成)引起的病症或由异常高数量的c-Met活性(由于异常高数量的c-Met或c-Met的突变造成)引起的病症。
术语“c-Met的活性过强”是指c-Met在通常不表达c-Met的细胞中的表达，或由于通常不具有活性c-Met或提高的c-Met表达的细胞引起的c-Met活性，导致不必要的细胞增殖或突变，造成c-Met的组成性激活。
术语“细胞增殖病症”包括涉及不希望的或无控的细胞增殖的病症。可以使用本发明的化合物来预防、抑制、阻滞、减少、降低、控制等等细胞增殖和/或细胞分裂，和/或产生细胞凋亡。该方法包括：给予需要其的患者(包括哺乳动物，包括人)有效治疗或预防病症数量的本发明的化合物或其可药用盐、异构体、多晶型物、代谢物、水合物或溶剂化物。
在本发明的背景下，细胞增殖或高增殖病症包括但不局限于：例如，牛皮癣，瘢痕瘤及影响皮肤的其它增生，骨胳病症，生成血管或血管增殖性病症，肺高血压症，纤维化病症，系膜细胞增殖病症，结肠息肉，多囊肾疾病，良性前列腺增生(BPH)和实体肿瘤，例如乳房、呼吸道、脑、生殖器官、消化道、尿路、眼睛、肝、皮肤、头和颈、甲状腺、甲状旁腺的癌症和它们的远端转移病变。那些病症还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。
乳腺癌的例子包括但不局限于：侵入性导管癌，侵入性小叶癌，导管原位癌和小叶原位癌。
呼吸道癌症的例子包括但不局限于：小细胞和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺的胚细胞瘤。
脑癌的例子包括但不局限于：脑干和下丘脑胶质瘤，小脑和大脑星形细胞瘤，恶性胶质瘤，成髓细胞瘤，室管膜瘤，以及神经外胚层和松果状瘤。
男性生殖器官肿瘤包括但不局限于前列腺和睾丸癌症。女性生殖器官肿瘤包括但不局限于：子宫内膜、子宫颈、卵巢、阴道和外阴癌症，以及子宫的肉瘤。
消化道肿瘤包括但不局限于：肛门、结肠、结肠直肠、食道、胆囊、胃、胰腺、直肠、小肠和唾腺癌。
尿路肿瘤包括但不局限于：膀胱、阴茎、肾脏、肾盂、输尿管、尿道和遗传性和偶发性乳突状的肾癌。
眼癌包括但不局限于眼内黑素瘤和成视网膜细胞瘤。
肝癌的例子包括但不局限于：肝细胞癌(有或者没有纤维板层变体的肝细胞癌)，胆管细胞癌(肝内胆管癌)和混合的肝细胞胆管细胞癌。
皮肤癌包括但不局限于：鳞状细胞癌，皮肤多发性出血性肉瘤，恶性黑色素瘤，Merkel细胞皮肤癌和非黑素瘤皮肤癌。
头和颈癌包括但不局限于：喉、下咽、鼻咽、口咽癌、唇和口腔癌和鳞状细胞癌。
淋巴瘤包括但不局限于：AIDS相关的淋巴瘤，非Hodgkin's淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，淋巴肉芽肿病和中枢神经系统的淋巴瘤。
肉瘤包括但不局限于：软组织的肉瘤，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。
白血病包括但不局限于：急性骨髓性白血病，急性淋巴母细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，慢性粒性白血病和毛细胞白血病。
可以用本发明的化合物和方法治疗个纤维化的增殖病症(即胞外基质的异常形成)包括：肺纤维化，动脉粥样硬化，再狭窄，肝硬化和系膜细胞增殖病症，包括肾疾病，例如肾小球肾炎，糖尿病性肾病，恶性肾硬变，血栓性微血管病综合征，移植物排斥和肾小球病。
可以通过给予本发明的化合物来治疗的人或其它哺乳动物的其它病症包括：肿瘤生长，视网膜病(包括糖尿病性视网膜病，缺血性视网膜静脉堵塞，早期视网膜病和年龄相关的黄斑变性)，类风湿性关节炎，牛皮癣和与表皮下起泡相关的大疱病症，包括大疱类天疱疮，多形性红斑和疱疹样皮炎。
本发明的化合物还可以用于预防和治疗呼吸道和肺疾病、胃肠道疾病以及膀胱和胆管疾病。
已经在人中较好地表征了上述病症，在其它动物(包括哺乳动物)中也存在类似的病源，并且可以通过给予本发明的药物组合物来治疗。
可以以单一药物试剂形式给予式(I)的化合物，或在组合药不会导致无法接受的副作用的情况下，与一或多种其它治疗剂组合给予。这种组合治疗包括：给予含有式(I)化合物和一或多种其它治疗剂的单一药物剂量制剂，以及以它们本身单独的药物剂量制剂形式给予式(I)的化合物和每个其它治疗剂。例如，可以在单一口服剂量组合物(例如片剂或胶囊剂)中一起给予患者式(I)的化合物和治疗剂，或可以以单独的剂量制剂形式给予每个药剂。
如果使用单独的剂量制剂，可以基本上同时(例如，并行)或在分开交错的时间（例如，依次地）给予式(I)的化合物和一或多种其它治疗剂。
尤其是，本发明的化合物可以在与其它下列药物的固定或分开的组合药中使用：抗肿瘤药剂，例如烷基化剂，抗代谢物，植物衍生的抗肿瘤药剂，激素治疗药剂，拓扑异构酶抑制剂，喜树碱衍生物，激酶抑制剂，靶向药物，抗体，干扰素和/或生物反应调节剂，抗生成血管的化合物及其它抗肿瘤药物。在这方面，下列是可以与本发明化合物组合使用的第二药剂的例子的非限制性列表∶
· 烷基化剂包括但不局限于：氮芥N-氧化物，环磷酰胺，异环磷酰胺，硫替派，雷莫司汀(ranimustine)，嘧啶亚硝脲，替莫唑胺，六甲蜜胺，apaziquone，brostallicin，苯达莫司汀，卡莫司汀，雌莫司汀，福莫司汀，葡膦酰胺，马磷酰胺(mafosfamide)，苯达莫司汀(bendamustin)和二溴卫矛醇；铂配位的烷基化化合物，包括但不局限于：顺铂，卡铂，依他铂，乐铂，奈达铂，奥沙利铂和沙铂(satraplatin)；
· 抗代谢物包括但不局限于：氨甲喋呤，6-巯基嘌呤核糖核苷，巯基嘌呤，5-氟尿嘧啶(单独或与亚叶酸组合)，替加氟，去氧氟尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，阿糖胞苷十八烷基磷酸钠，依诺他滨，吉西他滨，氟达拉宾，5-阿扎胞苷，卡培他滨，克拉屈滨，氯法拉滨(clofarabine)，地西他滨，依氟鸟氨酸，乙炔基胞嘧啶核苷，阿糖胞苷，羟基脲，苯丙氨酸氮芥，奈拉滨(nelarabine)，诺拉曲特(nolatrexed)，ocfosfite，培美曲塞二钠，喷司他丁，吡利曲索(pelitrexol)，雷替曲塞(raltitrexed)，triapine，三甲曲沙，阿糖腺苷，长春花新碱和长春瑞宾；
· 激素治疗药剂包括但不局限于：依西美坦，lupron，阿那曲唑，度骨化醇(doxercalciferol)，法屈唑，福美坦，11-β羟甾醇脱氢酶1抑制剂，17-α羟化酶/17,20裂解酶抑制剂，例如乙酸阿比特龙，5-α还原酶抑制剂，例如非那雄胺和依立雄胺，抗雌激素，例如枸橼酸它莫西芬和氟维司群，Trelstar，枸橼酸托瑞米芬，雷诺昔酚，拉索昔芬，来曲唑，抗雄激素例如比卡鲁胺，氟他胺，美服培酮，尼鲁米特，Casodex和抗黄体酮和其组合物；
· 植物衍生的抗肿瘤物质，包括，例如，选自有丝分裂抑制剂的那些抗肿瘤物质，例如埃坡霉素，例如沙戈匹隆(sagopilone)，伊沙匹隆(ixabepilone)和埃坡霉素B，长春花碱，长春氟宁，多西他赛和太平洋紫杉醇；
· 细胞毒素拓扑异构酶抑制剂包括但不局限于：阿柔比星，多柔比星，氨萘非特，贝洛替康(belotecan)，喜树碱，10-羟基喜树碱，9-氨基喜树碱，二氟替康(diflomotecan)，依立替康，托泊替康，伊朵堤卡林(edotecarin)，表柔吡星(epimbicin)，依托泊苷，依沙替康(exatecan)，吉马替康，勒托替康，米托蒽醌，吡柔比星(pirambicin)，匹杉琼(pixantrone)，鲁比替康，索布佐生，tafluposide和其组合物；
· 免疫包括干扰素，例如干扰素α，干扰素α-2a，干扰素α-2b，干扰素β，干扰素γ-1a和干扰素γ-n1，及其它免疫提高药剂，例如L19-IL2及其它 IL2衍生物，非格司亭，蘑菇多糖，sizofilan， TheraCys，乌苯美司，阿地白介素，阿仑单抗(alemtuzumab)， BAM-002，达卡巴嗪，达(克)珠单抗，地尼白介素(denileukin)，吉妥单抗(gemtuzumab)，奥佐米星，替伊莫单抗(ibritumomab)，咪喹莫特，来格司亭，蘑菇多糖，黑素瘤疫苗(Corixa)，莫拉司亭，沙格司亭，他索纳明(tasonermin)，tecleukin，thymalasin，托西莫单抗，vimlizin，依帕珠单抗，米妥莫单抗(mitumomab)，oregovomab，pemtumomab和provenge；
· 生物反应调节剂是调节生物机体的防卫机制或生物反应(例如，组织细胞的存活、生长或分化)、从而使它们具有抗肿瘤活性的药剂；这种药剂包括，例如云芝多糖K(krestin)，蘑菇多糖，西佐喃，溶链菌制剂(picibanil)，ProMune和乌苯美司；
· 抗生成血管的化合物包括但不局限于：阿维A，阿柏西普(aflibercept)，血管抑素，aplidine，asentar，阿西替尼(axitinib)，贝伐单抗，brivanib alaninat，cilengtide，康普瑞汀，血管内皮抑素，芬维A胺(fenretinide)，卤夫酮(halofuginone)，帕唑帕尼(pazopanib)，ranibizumab，瑞马司他(rebimastat)，recentin，regorafenib，removab，revlimid，索拉非尼(sorafenib)，角鲨胺(squalamine)，舒尼替尼(Sunitinib)，telatinib，反应停，ukrain，瓦他拉尼(vatalanib)和vitaxin；
· 抗体包括但不局限于：曲妥珠单抗，西妥昔单抗，贝伐单抗，美罗华，ticilimumab，ipilimumab，lumiliximab，catumaxomab，atacicept，oregovomab和阿仑单抗(alemtuzumab)；
· VEGF抑制剂，例如，索拉非尼(sorafenib)，regorafenib，贝伐单抗，舒尼替尼(Sunitinib)，recentin，阿西替尼(axitinib)，阿柏西普(aflibercept)，telatinib，brivanib alaninate，瓦他拉尼(vatalanib)，帕唑帕尼(pazopanib)和ranibizumab；
· EGFR(HER1)抑制剂，例如，西妥昔单抗，帕尼单抗(panitumumab)，vectibix，吉非替尼，埃洛替尼和zactima；
· HER2抑制剂，例如，拉帕替尼(lapatinib)，物曲妥珠单抗(tratuzumab)和帕妥珠单抗(Pertuzumab)；
· mTOR抑制剂，例如，西罗莫司(temsirolimus)，西罗莫司(Sirolimus)/雷帕霉素和依维莫司；
· c-Met抑制剂；
· PI3K和AKT抑制剂；
· CDK抑制剂，例如，roscovitine和夫拉平度(flavopiridol)；
· 纺缍体组装检测点抑制剂和靶向的抗有丝分裂药剂，例如，PLK抑制剂，极光抑制剂(例如Hesperadin)，检测点激酶抑制剂和KSP抑制剂；
· HDAC抑制剂，例如，帕比司他(panobinostat)，伏立诺他(vorinostat)，MS275，belinostat和LBH589；
· HSP90和HSP70抑制剂；
· 蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米(Bortezomib)和carfilzomib；
· 丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，包括MEK抑制剂和Raf抑制剂，例如索拉非尼(sorafenib)；
· 法尼基转移酶抑制剂，例如，替吡法尼(tipifarnib)；
· 酪氨酸激酶抑制剂，包括，例如，达沙替尼，nilotibib，regorafenib，博舒替尼(bosutinib)，sora-fenib，贝伐单抗，舒尼替尼(Sunitinib)，cediranib，阿西替尼(axitinib)，阿柏西普(aflibercept)，telatinib，甲磺酸伊马替尼，brivanib alaninate，帕唑帕尼(pazopanib)，ranibizumab，瓦他拉尼(vatalanib)，西妥昔单抗，帕尼单抗(panitumumab)，vectibix，吉非替尼，埃洛替尼，拉帕替尼(lapatinib)，物曲妥珠单抗(tratuzumab)，帕妥珠单抗(Pertuzumab)和c-Kit抑制剂；
· 维生素D受体激动剂；
· Bcl-2蛋白抑制剂，例如obatoclax，奥利默森(oblimersen)钠和棉子酚；
· 分化抗原簇20受体拮抗剂，例如，美罗华；
· 核糖核苷酸还原酶抑制剂，例如，吉西他滨；
· 肿瘤坏疽细胞凋亡诱导配体受体1激动剂，例如，mapatumumab；
· 5-羟色胺受体拮抗剂，例如，rEV598，xaliprode，盐酸帕洛诺司琼(Palonosetron)，格拉司琼，Zindol和AB-1001；
· 整联蛋白抑制剂，包括alpha5-beta1整联蛋白抑制剂，例如，E7820，JSM 6425，volociximab和血管内皮抑素；
· 雄激素受体拮抗剂，包括，例如，癸酸诺龙，氟甲睾酮，Android，Prost-aid，andromustine，比卡鲁胺，氟他胺，apo-环丙孕酮，apo-氟他胺，氯地孕酮，环丙氯地孕酮，Tabi，乙酸赛普龙和尼鲁米特；
· 芳香酶抑制剂，例如，阿那曲唑，来曲唑，睾内酯，依西美坦，氨鲁米特和福美坦；
· 基质金属蛋白酶抑制剂；
· 其它抗癌药剂，包括，例如，alitretinoin，ampligen，阿曲生坦(atrasentan)，贝沙罗汀(bexarotene)，borte-zomib，波生坦，骨化三醇，依昔舒林(exisulind)，福莫司汀，依班膦酸，米特福辛，米托蒽醌，I门冬酰胺酶，普鲁苄肼，达卡巴嗪，羟基脲，培加帕酶，喷司他丁，tazaroten，velcade，硝酸镓，canfosfamide，darinaparsin和维甲酸。
在一个优选实施方案中，本发明的化合物可以与化学疗法(即细胞毒素药剂)、抗激素疗法和/或靶向治疗(例如，其它激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂)，mTOR抑制剂和血管生成抑制剂)组合使用。
本发明的化合物也可以与放射治疗和/或外科手术结合，用于癌症治疗。
此外，式(I)的化合物可以原样或在组合物中用于研究和诊断，或作为分析比照标准，等等，这在本领域是众所周知的。
药物组合物和治疗方法
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含上述式(I)的化合物以及可药用载体。
在又另一个方面，本发明提供了制备药物组合物的方法。该方法包括下列步骤：将至少一种上述式(I)的化合物与至少一种可药用载体组合，并将所得到的组合物变成合适的给药形式。
式(I)的活性组分可以系统地和/或局部地起作用。为了这种目的，可以使用合适的方式，例如口服，胃肠外，肺部，鼻部，舌下，向舌，口腔内，直肠，透皮，结膜，耳部或植入物或支架形式。
对于这些使用途径，可以以合适的使用形式来给予式(I)的活性组分。
使用的口服形式包括：快速释放活性组分的应用形式和/或改良型，例如，片剂(没有包衣和包衣片剂，例如，用肠溶衣包衣)，胶囊剂，糖衣片剂，颗粒剂，小药丸，粉剂，乳剂，混悬剂，溶液剂和气雾剂。
肠胃外给药可以在避免吸收步骤下进行(静脉内，动脉内，心内，脊柱内或管腔内)，或同时包括吸收步骤(肌内注射，皮下，皮内，经皮或腹膜内)。使用的肠胃外给药形式包括：溶液剂、混悬剂、乳剂、冷冻干燥剂和无菌粉剂形式的注射剂和输溶液剂。
适合于其它给药途径的形式包括，例如，吸入药物形式(包括粉剂吸入器、雾化器)，滴鼻剂，溶液剂或喷雾剂，向舌、舌下或口腔内给药的片剂或胶囊剂，栓剂，耳用和眼用制剂，阴道胶囊剂，水悬剂(洗剂，摇动混合物)，亲脂性的混悬剂，软膏剂，乳膏剂，乳剂，膏剂，扑粉，植入物或支架。
在一个优选实施方案中，提供了适合于口服形式的包含上述式(I)化合物的药物组合物。在另一个优选实施方案中，提供了适合于静脉内给药形式的包含上述式(I)化合物的药物组合物。
用本身已知的方式，式(I)的活性组分可以转变为所列举的用药形式。这使用惰性无毒的、药学合适的赋形剂来进行。这些尤其包括载体(例如微晶纤维素)，溶剂(例如液体聚乙二醇)，乳化剂(例如十二烷基硫酸钠)，分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)，合成和天然生物聚合物(例如白蛋白)，稳定剂(例如抗氧化剂，例如抗环血酸)，着色剂(例如无机颜料，例如铁氧化物或味道和/或气味矫正剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了在需要这种治疗的患者中治疗细胞增殖病症的方法，该方法包括：给予患者有效量的上述式(I)的化合物。在某些实施方案中，细胞增殖病症是癌症。
在又另一个方面，本发明提供了上述式(I)化合物用于制备药物组合物的用途，该药物组合物用于治疗或预防细胞增殖病症。在某些实施方案中，细胞增殖病症是癌症。
当本发明的化合物作为药物给予人和动物时，可以给予本发明化合物本身或以药物组合物形式给予，药物组合物含有例如0.1至99.5%(更优选，0.5至90%)活性组分,其与可药用载体组合。
无论所选择的给药途径如何，利用本领域技术人员已知的常规方法，将本发明的化合物(可以使用合适的水合物形式)和/或本发明的药物组合物配制为可药用剂型。
给予活性组分(在本发明的药物组合物中)的实际剂量水平和时程可以变化，以便获得可有效实现对具体患者的目标治疗响应的活性组分数量、组合物和给药模式，同时对患者不产生毒性。示范性的剂量范围是每天0.01至100 mg/kg，或每天0.1至150 mg/kg。
在某些实施方案中，本发明的化合物可以使用于与常规癌症化疗的组合治疗中。白血病和其它肿瘤的常规治疗方案包括辐射、药物或两者相结合的方法。
作为本领域技术人员，医生或兽医(“护理临床医师”)通过利用已知的技术和通过在类似情况下观察到的效果，可以容易地确定本发明化合物的治疗有效抗增殖数量或预防有效抗增殖数量。在护理临床医师的判断下，剂量可以根据患者的要求、所治疗病症的严重程度和所使用的具体化合物而变化。在确定治疗有效抗增殖数量或剂量和预防有效抗增殖数量或剂量的过程中，护理临床医师会考虑许多因素，包括但不限于∶所涉及的具体细胞增殖病症；具体药剂的药效特征和其给药模式和给药途径；治疗的目标时程；哺乳动物的种类；其大小、年龄和常规健康情况；所涉及的具体疾病；疾病的程度或疾病的涉及因素或严重程度；个体患者的响应；给予的具体化合物；给药模式；所给予制剂的生物利用率特性；选择的剂量方案；并行治疗的类型(即，本发明化合物与其它共同给予的治疗的相互作用)；及其它相关的情况。
可以用较小剂量开始治疗，这种剂量小于化合物的最佳剂量。而后，可以通过少量增加来提高剂量，直到在这种情况下达到最佳效果为止。如果需要的话，为方便起见，可以将总的日剂量分开，并在一天期间内分为几份给予。可以预计，本发明化合物的治疗有效抗增殖数量和预防有效抗增殖数量在大约每天每千克体重0.01毫克(mg/kg/天)至大约100 mg/kg/天之间变化。
对于本发明来说，本发明化合物的优选剂量是患者能够忍受并且不形成严重副作用的最大剂量。举例说明，本发明化合物的给药剂量为大约0.01 mg/kg体重至大约100 mg/kg体重，大约0.01 mg/kg体重至大约10 mg/kg体重，或大约0.1 mg/kg体重至大约10 mg/kg体重。上面所列举数值的中间范围也是本发明的一部分。
在后面的试验和实施例中，百分比按重量计算，除非另作说明;份数按重量计算。报道液体/液体溶液的溶剂比例、稀释率和浓度各自基于体积计算。
A. 实施例
缩写和简称∶
LC-MS和GC-MS方法∶
方法1(LC-MS)∶
仪器∶Micromass ZQ-HPLC Waters Alliance 2795；柱∶Phenomenex Synergi 2.5μ MAX-RP 100A Mercury，20 mm x 4 mm；洗脱液A∶1 L水 + 0.5mL 50%甲酸，洗脱液B∶1 L乙腈+0.5mL 50%甲酸；梯度∶0.0 min 90% A→0.1 min 90% A→3.0 min 5% A→4.0 min 5% A→4.01 min 90% A；流速∶2 mL/min；炉温∶50℃；UV检测∶210 nm。
方法2(LC-MS)∶
仪器∶Micromass Quattro Premier-HPLC Waters UPLC Acquity；柱∶Thermo Hyper-sil GOLD 1.9μ，50 mm x 1 mm；洗脱液A∶1 L水 + 0.5 mL 50%甲酸，洗脱液B∶1 L乙腈+0.5 mL 50%甲酸；梯度∶0.0 min 90% A→0.1 min 90% A→1.5 min 10% A→2.2 min 10% A；炉温∶50℃；流速∶0.33 mL/min；UV检测∶210 nm。
方法3(LC-MS)∶
仪器∶Micromass Quattro Micro-HPLC Agilent 1100 Series；柱∶Thermo Hyper-sil GOLD 3μ，20 mm x 4 mm；洗脱液A∶1 L水 + 0.5 mL 50%甲酸，洗脱液B∶1 L乙腈 + 0.5 mL 50%甲酸；梯度∶0.0 min 100% A→3.0 min 10% A→4.0 min 10% A→4.01 min 100% A(流速2.5 mL/min)→5.00 min 100% A；炉温∶50℃；流速∶2 mL/min；UV检测∶210 nm。
方法4(LC-MS)∶
仪器∶Waters Acquity SQD UPLC System；柱∶Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ，50 mm x 1 mm；洗脱液A∶1 L水 + 0.25 mL 99%甲酸，洗脱液B∶1 L乙腈 + 0.25 mL 99%甲酸；梯度∶0.0 min 90% A→1.2 min 5% A→2.0 min 5% A；炉温∶50℃；流速∶0.40 mL/min；UV检测∶210-400 nm。
方法5(GC-MS)∶
仪器∶Micromass GCT，GC 6890；柱∶Restek RTX-35，15 m x 200 μm x 0.33 μm；氦气恒定流速∶0.88 mL/min；炉温∶70℃；入口∶250℃；梯度∶70℃，30℃/min→310℃(保持3 min)。
起始原料和中间体∶
实施例1A
3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛
在氩气氛中，将四氢呋喃(600 mL)冷却至-78℃。在此温度下，逐滴加入1.7 M叔丁基锂的正戊烷溶液(200 mL)。在-78℃经过15分钟之后，逐滴加入22.4 g(106.1 mmol)5-溴-3-甲基-1H-吲唑的THF(300 mL)溶液，加入速率应该使溶液的温度不超过-70℃。搅拌该混合物30分钟，而后逐滴加入N,N-二甲基甲酰胺(24.5 mL)。20分钟之后，除去冷却浴，继续搅拌1小时，而后小心地加入水(250 ml)。将该混合物用乙酸乙酯(500 ml)提取若干次。将合并的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，减压浓缩，得到18.5 g粗品3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛，其不用进一步纯化就在下一步中使用。
1H-NMR(DMSO-d6): δ=13.13(br. s, 1H), 10.01(s, 1H), 8.40(s, 1H), 7.81(d, 1H), 7.58(d, 1H), 2.56(s, 3H)ppm。
实施例2A
(2E)-2-[(3-甲基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈
将5.0 g(31.2 mmol)3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例1A)、3.61 g(34.3 mmol)(1Z)-1-氰基丙-1-烯-2-醇化钠、2.23 ml(39 mmol)乙酸和0.31 ml(3.12 mmol)哌啶在含有4?分子筛的无水二氯甲烷(250 ml)中的混合物回流搅拌12小时。冷却时，形成沉淀，过滤收集沉淀，并用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤。将固体溶于乙醇中，并将分子筛滤出。减压浓缩滤液，并将残余物用乙酸乙酯和饱和碳酸钠水溶液处理。用水洗涤有机层，干燥，减压浓缩，得到标题化合物(3.5 g，理论值的50%)浅黄色固体，其不用进一步纯化就在下一步中使用。
LC-MS(方法1): Rt=1.32 min; MS(ESIpos): m/z=226(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=13.18(br. s, 1H), 8.52(s, 1H), 8.49(s, 1H), 8.19(d, 1H), 7.69(d, 1H), 2.55(br. m, 6H)ppm。
实施例3A
6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛
将30 g(131 mmol)5-溴-6-氟-3-甲基-1H-吲唑[WO 2005/085227-A1中的实施例104 c所描述制备)；也可商购CAS Reg.-No.864773-66-0]的THF(525 ml)溶液冷却至-45℃。在-45℃，逐滴加入甲基氯化镁的THF溶液(3 M；50.2 ml，151 mmol)，并将得到的溶液在此温度下搅拌40分钟。使用计量泵，加入253 ml(354 mmol)2-丁基锂溶液(1.4 M，在环己烷中)，使得温度不超过-40℃。将得到的混合物在-40℃搅拌30分钟，而后逐滴加入30.2 ml(393 mmol)N,N-二甲基甲酰胺，并使温度保持在-40℃。将得到的混合物在-40℃搅拌30分钟，然后加热至室温，并慢慢地倒入冷却至5℃(冰-水浴)的2.8L体积的2N盐酸中。将该混合物用乙酸乙酯提取若干次。将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。将残余物溶于二氯甲烷中，用硅胶色谱纯化(洗脱液∶戊烷/乙酸乙酯6:4 v/v)，得到19.6 g(理论值的78%)标题化合物浅黄色固体。
MS(ESIpos): m/z=179(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=13.14(s, 1H), 10.17(s, 1H), 8.33(d, 1H), 7.37(d, 1H), 2.54(s, 3H)ppm。
实施例4A
(2E)-2-[(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈
按照实施例2A所描述的方法，使用2.74 g(15.5 mmol)6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例3A)和2.6 g(24.8 mmol)(1Z)-1-氰基丙-1-烯-2-醇化钠，制备标题化合物,得到1.6 g(理论值的42%)粗品，其不用进一步纯化就在下一步中使用。
LC-MS(方法4): Rt=0.83 min; MS(ESIpos): m/z=244(M+H)+。
实施例5A
6-氟-1H-吲唑-5-甲醛
将4.8 g(30 mmol)6-氟-1H-吲唑-5-腈[商购；EP 1 510 516-A1(制备实施例82)给出制备]的无水甲苯(150 ml)浆液冷却至-40℃。在惰性气氛中，用30分钟加入48 ml(72 mmol)二异丁基氢化铝溶液(1.5 M，在甲苯中)，并将得到的混合物在-40℃下搅拌3小时。然后，加入乙酸乙酯(30 ml)，并将该混合物在-40℃进一步搅拌20分钟，而后逐滴加入酒石酸水溶液(1 M，30 ml)。将该混合物升温至0℃，并在此温度下过滤。用乙酸乙酯提取滤液若干次，并随后用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤合并的有机相，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。由此获得的粗品(2.60 g，理论值的53%)不用进一步纯化就在下一步中使用。
LC-MS(方法4): Rt=0.59 min; MS(ESIpos): m/z=165(M+H)+。
实施例6A
(2E)-2-[(6-氟-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈
按照类似于实施例2A所描述的方法，由3.7 g(80%纯度，18.0 mmol)6-氟-1H-吲唑-5-甲醛(实施例5A)和2.08 g(19.84 mmol)(1Z)-1-氰基丙-1-烯-2-醇化钠制备标题化合物，得到2.5 g(理论值的61%)产物，其不用进一步纯化就可在后面的步骤中使用。
LC-MS(方法2): Rt=0.71 min; MS(ESIpos): m/z=230(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=13.90(s, 1H), 8.59(s, 1H), 8.46(s, 1H), 8.23(d, 1H), 7.80(d, 1H), 2.5(br. s, 3H)ppm。
实施例7A
1-(5-溴-2-氟苯基)-1-丙醇
在0℃，向15 g(73.9 mmol)5-溴-2-氟苯甲醛的二乙醚(100 ml)溶液中慢慢地加入27.1 ml(81.3 mmol)乙基溴化镁溶液(3M，在二乙醚中)。在0℃下搅拌3小时之后，小心地加入水(20 ml)，接着形成白色沉淀。滤出固体，并用甲基叔丁基醚洗涤。将合并的滤液用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，减压浓缩。由此获得的粗品标题化合物(16.1 g，理论值的93%)不用进一步纯化就在下一步中使用。
GC-MS(方法5): Rt=4.54 min; MS(EIpos): m/z=232(M)+。
实施例8A
1-(5-溴-2-氟苯基)-1-丙酮
将10 g(42.9 mmol)1-(5-溴-2-氟苯基)-1-丙醇(实施例7A)、8.75 g(85.8 mmol)中性氧化铝和18.5 g(85.8 mmol)氯铬酸吡啶在二氯甲烷(100 ml)中的混合物、在室温下搅拌4小时。然后通过硅胶(0.06-0.2 mm，200 g)过滤该混合物，用二氯甲烷(1000 ml)彻底地洗涤硅胶。将合并的滤液用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，减压浓缩。由此获得的粗品标题化合物(8.6 g，理论值的87%)不用进一步纯化就在下一步中使用。
GC-MS(方法5): Rt=4.30 min; MS(EIpos): m/z=230(M)+。
实施例9A
5-溴-3-乙基-1H-吲唑
将7.50 g(32.5 mmol)1-(5-溴-2-氟苯基)-1-丙酮(实施例8a)的1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP；100 ml)溶液用3.25 g(3.16 ml，64.9 mmol)水合肼处理，并在回流温度下搅拌16小时。一旦冷却，将该混合物倒入冰和水的混合物中。过滤收集沉淀，用水彻底地洗涤，得到4.56 g(理论值的62%)标题化合物米色固体。
LC-MS(方法4): Rt=1.00 min; MS(ESIpos): m/z=225(M+H)+。
实施例10A
3-乙基-1H-吲唑-5-甲醛
将6.90 g(30.7 mmol)5-溴-3-乙基-1H-吲唑(实施例9A)的THF(300 ml)溶液冷却至-78℃。在此温度下，慢慢地加入63.1 ml(107 mmol)叔丁基锂溶液(1.7 M，在正戊烷中)。在-78℃下搅拌该混合物30分钟，而后慢慢地加入N,N-二甲基甲酰胺(80.0 ml)。除去冷却浴，继续搅拌，直到达到室温为止。然后，小心地加入水(250 ml)。将该混合物用乙酸乙酯(500 ml)提取若干次。用饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，而后减压浓缩，得到4.5 g(理论值的84%)粗品标题化合物，其不用进一步纯化就在下一步中使用。
LC-MS(方法4): Rt=0.73 min; MS(ESIpos): m/z=175(M+H)+。
实施例11A
(2E)-2-[(3-乙基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈
将0.50 g(2.87 mmol)3-乙基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例10A)、0.33 g(3.16 mmol)(1Z)-1-氰基丙-1-烯-2-醇化钠、0.21 ml(3.6 mmol)乙酸和0.028 ml(0.29 mmol)哌啶在含有4?分子筛的无水二氯甲烷(25 ml)中的混合物回流搅拌16小时。冷却时，形成沉淀，过滤收集沉淀，并用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤。将固体溶于乙醇中，并将分子筛滤出。减压浓缩滤液，并将残余物用乙酸乙酯和饱和碳酸钠水溶液处理。用水洗涤有机层，干燥，减压浓缩，得到标题化合物(0.60 g，理论值的88%)浅黄色固体，其不用进一步纯化就在后面的步骤中使用。
LC-MS(方法1): Rt=1.50 min; MS(ESIpos): m/z=240(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=13.17(br. s, 1H), 8.59(s, 1H), 8.51(s, 1H), 8.17(d, 1H), 7.67(d, 1H), 2.97(q, 2H), 2.55(br. m, 3H), 1.36(t, 3H)ppm。
实施例12A
(2E)-2-(1H-吲唑-5-基亚甲基)-3-氧代丁腈
使用逆流式分水器(inverse water separator)，将10 g(68.4 mmol)1H-吲唑-5-甲醛[US 2005/0227968-A1(中间体1)中所述制备]、7.91 g(75.2 mmol)(1Z)-1-氰基丙-1-烯-2-醇化钠、4.89 ml(85.5 mmol)乙酸和0.68 ml(6.84 mmol)哌啶在无水二氯甲烷(500 ml)中、在回流温度下搅拌7小时。一旦冷却，形成沉淀，过滤收集沉淀，并用二氯甲烷洗涤。真空干燥固体，得到粗品标题化合物(19 g，LC-MS纯度75%，理论值的96%)，其不用进一步纯化就可在后面的步骤中使用。
LC-MS(方法2): Rt=0.82 min; MS(ESIpos): m/z=212(M+H)+。
实施例13A
4,4-二氟-3-氧代己腈
在无水THF(14 ml)中，在惰性气氛下，向直火烘干的烧瓶中加入2.9 ml(4.6 mmol)正丁基锂溶液(1.6 M，在己烷中)，并冷却至-78℃。紧接着，慢慢地加入0.213 ml(4.06 mmol)乙腈，并将得到的混合物在-70℃搅拌1小时。然后，用5分钟慢慢地加入0.40 g(2.9 mmol)2,2-二氟丁酸甲酯，并保持温度低于-69℃。在-45℃搅拌该反应混合物2小时，而后通过加入2 N盐酸(4.8 ml)来猝灭，同时保持温度低于-20℃。将得到的澄清溶液升温至室温，而后减压浓缩。将由此获得的粗品(2.5 g，17%纯度，理论值的98%)在-21℃储存，并且不用进一步纯化就在下一步中使用。
GC-MS(方法5): Rt=1.94 min; MS(EIpos): m/z=147(M)+。
实施例14A
4,4-二氟-3-氧代丁腈
在无水THF(19 ml)中，在惰性气氛下，向直火烘干的烧瓶中加入3.8 ml(6.1 mmol)正丁基锂溶液(1.6 M，在己烷中)，并冷却至-78℃。紧接着，慢慢地加入0.28 ml(5.3 mmol)乙腈，并将得到的混合物在-70℃搅拌1小时。然后，用5分钟慢慢地加入0.40 ml(3.8 mmol)二氟乙酸乙酯，并保持温度低于-69℃。在-45℃搅拌该反应混合物2小时，而后通过加入盐酸(2 M，4.8 ml)来猝灭，同时保持温度低于-20℃。将得到的澄清溶液升温至室温，而后减压浓缩。将由此获得的粗品(1.0 g，46%纯度，理论值的99%)在-21℃储存，并且不用进一步纯化就在下一步中使用。
GC-MS(方法5): Rt=1.49 min; MS(EIpos): m/z=119(M)+。
制备实施例∶
实施例1
rac-2-(二氟甲基)-6-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将3.42 g(15.2 mmol)(2E)-2-[(3-甲基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈(实施例2A)和7.27 g(60.7 mmol)3-氨基-4,4-二氟丁-2-烯腈[可通过乙腈与2,2-二氟乙腈的Thorpe反应获得，cf. Org. React. 15，1(1967)，ibid. 31，1(1984)]的2-丙醇(20 ml)和三乙胺(0.21 ml)悬浮液在回流温度下搅拌过夜。冷却后，过滤收集沉淀，并用冷的2-丙醇洗涤两次。用硅胶色谱纯化粗品(甲基叔丁基醚/乙醇梯度，最终混合物94:6 v/v)，得到0.36 g(理论值的7%)外消旋标题化合物浅黄色固体。
LC-MS(方法2): Rt=0.91 min; MS(ESIpos): m/z=326(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.73(s, 1H), 10.07(s, 1H), 7.58(s, 1H), 7.53(d, 1H), 7.29(d, 1H), 6.81(t, 1H, 2JHF=52.09 Hz), 4.70(s, 1H), 2.54(s, 3H), 2.12(s, 3H)ppm。
实施例2和实施例3
2-(二氟甲基)-6-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(对映体1和2)
用HPLC色谱在手性相上将实施例1的外消旋化合物分离为对映体[柱∶Daicel Chiralpak IB-H，5 μm，250 mm x 20 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚/乙腈 + 0.2%二乙胺 90:10 v/v；流速∶15 ml/min；温度∶30℃；UV检测∶220 nm]∶
实施例2(对映体1)∶
>99% ee
Rt=4.78 min[柱∶Daicel Chiralpak IB-H，5 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚/乙腈 90:10；流速∶1 ml/min；温度∶40℃；UV检测∶220 nm]。
DSC∶熔点305℃，ΔH 57 J/g
FT-IR (固体)∶3345, 3194, 3095, 2201(CN), 1665, 1630, 1530, 1512, 1388, 1328, 1291, 1279, 1134, 1095, 1065, 1050, 1022, 995, 844, 770, 737, 666 cm-1。
实施例3(对映体2)∶
>98% ee
Rt=5.78 min[柱∶Daicel Chiralpak IB-H，5 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚/乙腈 90:10；流速∶1 ml/min；温度∶40℃；UV检测∶220 nm]。
DSC∶熔点307℃，ΔH 48 J/g
FT-IR(固体)∶3344, 3193, 3094, 2202(CN), 1666, 1630, 1530, 1512, 1383, 1329, 1291, 1279, 1134, 1095, 1065, 1050, 1022, 995, 844, 771, 737, 666 cm-1。
实施例4
rac-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将5.4 g(24.0 mmol)(2E)-2-[(3-甲基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈(实施例2A)和13.05 g(95.9 mmol)3-氨基-4,4,4-三氟丁-2-烯腈[制备∶A.W. Lutz，US专利3,635,977；C.G. Krespan，J. Org. Chem. 34，42(1969)]的2-丙醇(27 ml)和三乙胺(0.33 ml)悬浮液在回流温度下搅拌15小时。冷却后，过滤收集沉淀，用冷的2-丙醇洗涤两次，高真空干燥，得到5.98 g(理论值的72%)外消旋标题化合物褐色固体。
LC-MS(方法4): Rt=0.87 min; MS(ESIpos): m/z=344(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.75(s, 1H), 10.27(s, 1H), 7.62(s, 1H), 7.54(d, 1H), 7.31(d, 1H), 4.79(s, 1H), 2.49(s, 3H), 2.13(s, 3H)ppm。
实施例5和实施例6
2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(对映体1和2)
用HPLC色谱在手性相上将实施例4的外消旋化合物分离为对映体[柱∶基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)的手性硅胶相(cf. EP 0 379 917, EP 0 780 408)，10 μm，600 mm x 40 mm；将1 g外消旋体溶于40 ml乙腈(含有2.5 ml二乙胺)中；洗脱液∶乙酸乙酯；流速∶90 ml/min；温度∶20℃；UV检测∶265 nm]∶
实施例5(对映体1)∶
>99% ee
Rt=4.81 min[柱∶基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)的手性硅胶相，10 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶乙酸乙酯；流速∶1.5 ml/min；温度∶25℃；UV检测∶260 nm]。
DSC∶熔点298℃，ΔH 43 J/g (而后放热分解宽峰)
FT-IR(固体)∶3306, 3105, 2210(CN), 1669, 1547, 1364, 1328, 1285, 1203, 1181, 1150, 1099, 992, 880, 786, 674 cm-1。
实施例6(对映体2)∶
>99% ee
Rt=7.57 min[柱∶基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)的手性硅胶相，10 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶乙酸乙酯；流速∶1.5 ml/min；温度∶25℃；UV检测∶260 nm]。
DSC∶熔点315℃，ΔH 130 J/g (而后放热分解宽峰)
FT-IR(固体)∶3304, 3105, 2210(CN), 1669, 1546, 1364, 1328, 1285, 1203, 1181, 1149, 1099, 992, 880, 786, 674 cm-1。
单晶X-射线结构分析显示了该对映体的C*-原子的S-构型。
实施例7
rac-2-(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
按照实施例1所描述的方法，用3-氨基-4,4-二氟丁-2-烯腈处理100 mg(0.411 mmol)(2E)-2-[(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈(实施例4A)。用制备RP-HPLC纯化粗品(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度，最终混合物90:10 v/v)，得到50 mg(理论值的35%)外消旋的标题化合物。
LC-MS(方法4): Rt=0.83 min; MS(ESIpos): m/z=344(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.82(br. s, 1H), 10.10(s, 1H), 7.69(d, 1H), 7.32(d, 1H), 6.81(t, 1H, 2JHF=52.09 Hz), 4.93(s, 1H), 2.54(s, 3H), 2.10(s, 3H)ppm。
实施例8和实施例9
2-(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(对映体1和2)
用HPLC色谱在手性相上将实施例7的外消旋化合物分离为对映体[柱∶基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-[(+)-3S-蒎烷基甲基]酰胺)的手性硅胶相(参见EP 0 379 917，EP 0 780 408)，10 μm，250 mm x 20 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚 + 0.2%二乙胺/甲醇 95:5 v/v；流速∶15 ml/min；温度∶30℃；UV检测∶220 nm]∶
实施例8(对映体1)∶
>99% ee
Rt=5.33 min[柱∶基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-[(+)-3S-蒎烷基甲基]酰胺)的手性硅胶相，10 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚 + 0.2%二乙胺/甲醇 95:5；流速∶1 ml/min；温度∶25℃；UV检测∶235 nm]。
实施例9(对映体2)∶
>98% ee
Rt=7.02 min[柱∶基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-[(+)-3S-蒎烷基甲基]酰胺)的手性硅胶相，10 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚 + 0.2%二乙胺/甲醇 95:5；流速∶1 ml/min；温度∶25℃；UV检测∶235 nm]。
实施例10
rac-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
按照实施例4所描述的方法，用3-氨基-4,4,4-三氟丁-2-烯腈处理250 mg(0.411 mmol)(2E)-2-[(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈(实施例4A)。用制备RP-HPLC纯化粗品(乙腈/水梯度，最终混合物90:10 v/v)，得到159 mg(理论值的42%)外消旋的标题化合物。
LC-MS(方法2): Rt=0.98 min; MS(ESIpos): m/z=362(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.34(br. s, 1H), 10.31(s, 1H), 7.74(d, 1H), 7.35(d, 1H), 5.01(s, 1H), 2.54(s, 3H), 2.11(s, 3H)ppm。
实施例11和实施例12
4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(对映体1和2)
用HPLC色谱在手性相上将实施例10的外消旋化合物分离为对映体[柱∶Daicel Chiralpak IB-H，5 μm，250 mm x 20 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚/乙腈 + 0.2%二乙胺 90:10 v/v；流速∶15 ml/min；温度∶30℃；UV检测∶220 nm]∶
实施例11(对映体1)∶
>99% ee
Rt=3.90 min[柱∶基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-[(+)-3S-蒎烷基甲基]酰胺)的手性硅胶相，10 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚 + 0.2%二乙胺/甲醇 95:5；流速∶1 ml/min；温度∶25℃；UV检测∶235 nm]。
实施例12(对映体2)∶
>98% ee
Rt=6.35 min[柱∶基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-[(+)-3S-蒎烷基甲基]酰胺)的手性硅胶相，10 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚 + 0.2%二乙胺/甲醇 95:5；流速∶1 ml/min；温度∶25℃；UV检测∶235 nm]。
实施例13
2,6-双(二氟甲基)-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将80 mg(0.50 mmol)3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例1A)和130 mg(1.10 mmol)3-氨基-4,4-二氟丁-2-烯腈[可通过乙腈与2,2-二氟乙腈的Thorpe反应获得，cf. Org. React. 15，1(1967)，ibid. 31，1(1984)]的乙酸(0.5 ml)溶液(含有粉末4?分子筛)加热至回流温度，保持3.5小时。冷却后，将该反应混合物用甲醇/二氯甲烷稀释，过滤。蒸发滤液，用制备RP-HPLC纯化残余物(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度)，得到61 mg(理论值的34%)标题化合物。
LC-MS(方法2): Rt=0.94 min; MS(ESIpos): m/z=362(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.80(br. s, 1H), 10.70(s, 1H), 7.62(s, 1H), 7.58(d, 1H), 7.30(d, 1H), 6.84(t, 2H), 4.89(s, 1H), 2.49(s, 3H)ppm。
FT-IR(固体)∶3348, 3116, 2805, 2209(CN), 1668, 1630, 1548, 1513, 1417, 1339, 1275, 1259, 1131, 1058, 1043, 996, 890, 856, 776, 666 cm-1.
DSC∶熔点289℃，ΔH 27 J/g (而后放热分解宽峰)。
实施例14
2,6-双(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将100 mg(0.56 mmol)6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例3A)和146 mg(1.24 mmol)3-氨基-4,4-二氟丁-2-烯腈[可通过乙腈与2,2-二氟乙腈的Thorpe反应获得，cf. Org. React.15，1(1967)，ibid.31，1(1984)]的乙酸(0.54 ml)溶液(含有粉末4?分子筛)加热至回流温度，保持5小时。冷却后，将该反应混合物用THF稀释，过滤。用制备RP-HPLC直接纯化滤液(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度)，得到136 mg(理论值的64%)标题化合物。
LC-MS(方法4): Rt=0.86 min; MS(ESIpos): m/z=380(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.89(br. s, 1H), 10.73(s, 1H), 7.76(d, 1H), 7.38(d, 1H), 6.82(t, 2H), 5.12(s, 1H), 2.49(s, 3H)ppm。
FT-IR(固体)∶3140, 2360, 2216(CN), 1634, 1515, 1393, 1266, 1144, 1052, 1009, 893, 837, 742 cm-1.
DSC∶熔点282℃，ΔH 138 J/g。
实施例15
2,6-双(二氟甲基)-4-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将150 mg(0.55 mmol)6-氟-1H-吲唑-5-甲醛(实施例5A)和142 mg(1.21 mmol)3-氨基-4,4-二氟丁-2-烯腈[可通过乙腈与2,2-二氟乙腈的Thorpe反应获得，cf. Org. React.15，1(1967)，ibid.31，1(1984)]的乙酸(0.5 ml)溶液(含有粉末4?分子筛)加热至回流温度，保持5小时。冷却后，将该反应混合物用THF稀释，过滤。用制备RP-HPLC直接纯化滤液(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度)，得到147 mg(理论值的72%)标题化合物。
LC-MS(方法4): Rt=0.83 min; MS(ESIpos): m/z=366(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.80(br. s, 1H), 10.76(s, 1H), 8.20(s, 1H), 7.83(d, 1H), 7.48(d, 1H), 6.82(t, 2H), 5.15(s, 1H)ppm。
实施例16
rac-2-(二氟甲基)-4-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将200 mg(0.87 mmol)(2E)-2-[(6-氟-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈(实施例6A)和419 mg(3.49 mmol)3-氨基-4,4-二氟丁-2-烯腈[可通过乙腈与2,2-二氟乙腈的Thorpe反应获得，cf. Org. React.15，1(1967)，ibid.31，1(1984)]的2-丙醇(1 ml)悬浮液在回流温度下搅拌过夜。冷却后，减压浓缩该混合物，并将残余物悬浮在对二甲苯(3 ml)中。加入少量的对甲苯磺酸和粉末4?分子筛，并将该混合物在回流温度下搅拌16小时。一旦冷却，将该混合物用乙腈稀释，过滤。减压浓缩滤液，并将粗品用制备RP-HPLC纯化(乙腈/水梯度，最终混合物9:1 v/v)，得到81 mg(理论值的28%)外消旋的标题化合物浅黄色固体。
LC-MS(方法2): Rt=0.89 min; MS(ESIpos): m/z=330(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=13.24(s, 1H), 10.14(s, 1H), 8.15(s, 1H), 7.79(d, 1H), 7.42(d, 1H), 6.82(t, 1H, 2JHF=51.84 Hz), 4.95(s, 1H), 2.11(s, 3H)ppm。
实施例17和实施例18
2-(二氟甲基)-4-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(对映体1和2)
用HPLC色谱在手性相上将实施例16的外消旋化合物分离为对映体[柱∶Daicel Chiralpak IB-H，5 μm，250 mm x 20 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚/乙腈，90:10 v/v；流速∶15 ml/min；温度∶30℃；UV检测∶220 nm]∶
实施例17(对映体1)∶
>99% ee
Rt=6.15 min[柱∶Daicel Chiralpak IB-H，5 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚/乙腈 90:10；流速∶1 ml/min；温度∶40℃；UV检测∶220 nm]。
实施例18(对映体2)∶
>98.5% ee
Rt=7.88 min[柱∶Daicel Chiralpak IB-H，5 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶甲基叔丁基醚/乙腈 90:10；流速∶1 ml/min；温度∶40℃；UV检测∶220 nm]。
实施例19
rac-4-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
按照实施例4所描述的方法，用3-氨基-4,4,4-三氟丁-2-烯腈处理200 mg(0.87 mmol)(2E)-2-[(6-氟-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈(实施例6A)。用制备RP-HPLC纯化粗品(乙腈/水梯度，最终混合物90:10 v/v)，得到115 mg(理论值的40%)外消旋的标题化合物。
LC-MS(方法3): Rt=1.83 min; MS(ESIpos): m/z=348(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=13.27(s, 1H), 10.34(s, 1H), 8.16(s, 1H), 7.84(d, 1H), 7.44(d, 1H), 5.03(s, 1H), 2.12(s, 3H)ppm。
实施例20
rac-4-(1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将250 mg(1.71 mmol)1H-吲唑-5-甲醛、180 mg(1.71 mmol)1-氰基丙-1-烯-2-醇化钠和931 mg(6.84 mmol)3-氨基-4,4,4-三氟丁-2-烯腈[制备∶A.W. Lutz，US专利3,635,977；C.G. Krespan，J. Org.Chem. 34，42(1969)]的混合物在1-戊醇(2.5 ml)和乙酸(0.15 ml)中加热至105℃过夜。冷却后，用THF稀释该反应混合物，用制备RP-HPLC直接纯化(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度)，得到131 mg(理论值的23%)外消旋的标题化合物。
LC-MS(方法2): Rt=0.93 min; MS(ESIpos): m/z=330(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=13.19(br. s, 1H), 10.30(s, 1H), 8.12(s, 1H), 7.71(s, 1H), 7.63(d, 1H), 7.32(d, 1H), 4.79(s, 1H), 2.12(s, 3H)ppm。
实施例21和实施例22
4-(1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(对映体1和2)
用HPLC色谱在手性相上将实施例20的外消旋化合物(90 mg)分离为对映体[柱∶基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)的手性硅胶相(cf. EP 0 379 917, EP 0 780 408)，10 μm，240 mm x 20 mm；洗脱液∶异己烷/乙酸乙酯，10:90 v/v；流速∶40 ml/min；温度∶25℃；UV检测∶260 nm]∶
实施例21(对映体1)∶
产率∶24 mg(99.5% ee)
Rt=5.54 min[柱∶基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)的手性硅胶相，250 mm x 4 mm；洗脱液∶异己烷/乙酸乙酯，20:80 v/v；流速∶2 ml/min；UV检测∶260 nm]。
实施例22(对映体2)∶
产率∶21 mg(99% ee)
Rt=8.67 min[柱∶基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)的手性硅胶相，250 mm x 4 mm；洗脱液∶异己烷/乙酸乙酯，20:80 v/v；流速∶2 ml/min；UV检测∶260 nm]。
实施例23
rac-4-(3-乙基-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将300 mg(1.25 mmol)(2E)-2-[(3-乙基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈(实施例11A)和853 mg(6.27 mmol)3-氨基-4,4,4-三氟丁-2-烯腈[制备∶A.W. Lutz，US专利3,635,977；C.G. Krespan，J. Org.Chem. 34，42(1969)]的乙醇/2-丙醇(8:1 v/v，1.0 ml)悬浮液在回流温度下搅拌24小时。冷却后，减压浓缩该反应混合物，用制备RP-HPLC纯化残余物(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度)，得到59 mg(理论值的13%)外消旋的标题化合物。
LC-MS(方法4): Rt=0.91 min; MS(ESIpos): m/z=358(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.74(s, 1H), 10.25(s, 1H), 7.62(s, 1H), 7.55(d, 1H), 7.30(d, 1H), 4.78(s, 1H), 2.93(q, 2H), 2.13(s, 3H), 1.32(t, 3H)ppm。
实施例24
2,6-双(二氟甲基)-4-(1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将80 mg(0.55 mmol)1H-吲唑-5-甲醛、142 mg(1.21 mmol)3-氨基-4,4-二氟丁-2-烯腈[可通过乙腈与2,2-二氟乙腈的Thorpe反应获得，cf. Org. React.15，1(1967)，ibid.31，1(1984)]和痕量粉末4?分子筛在乙酸(0.53 ml)中的混合物加热至回流温度，保持5小时。冷却后，将该反应混合物用THF稀释，过滤。用制备RP-HPLC直接纯化滤液(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度)，得到95 mg(理论值的48%)标题化合物。
LC-MS(方法4): Rt=0.81 min; MS(ESIpos): m/z=348(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=13.21(br. s, 1H), 10.70(s, 1H), 8.16(s, 1H), 7.72(s, 1H), 7.66(d, 1H), 7.32(d, 1H), 6.82(t, 2H), 4.90(s, 1H)ppm。
实施例25
2,6-双(二氟甲基)-4-(3-乙基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将80 mg(0.46 mmol)3-乙基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例10A)、119 mg(1.21 mmol)3-氨基-4,4-二氟丁-2-烯腈[可通过乙腈与2,2-二氟乙腈的Thorpe反应获得，cf. Org. React.15，1(1967)，ibid.31，1(1984)]和痕量粉末4?分子筛在乙酸(0.44 ml)中的混合物加热至回流温度，保持4小时。冷却后，将该反应混合物用THF/甲醇稀释，过滤。用制备RP-HPLC纯化滤液两次(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度)，得到99 mg(理论值的57%)标题化合物。
LC-MS(方法4): Rt=0.88 min; MS(ESIpos): m/z=376(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.79(br. s, 1H), 10.69(s, 1H), 7.68(s, 1H), 7.59(d, 1H), 7.30(d, 1H), 6.84(t, 2H), 4.88(s, 1H), 2.93(q, 2H), 1.32(t, 3H)ppm。
实施例26
4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-2,6-双(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将50 mg(0.31 mmol)3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例1A)、106 mg(0.78 mmol)3-氨基-4,4,4-三氟丁-2-烯腈[制备∶A.W. Lutz，US专利3,635,977；C.G. Krespan，J. Org.Chem. 34，42(1969)]和痕量粉末4?分子筛在乙酸(0.30 ml)中的混合物加热至回流温度，保持2小时。冷却后，将该反应混合物用甲醇/二氯甲烷稀释，过滤。蒸发滤液，用制备RP-HPLC纯化残余物(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度)，得到19 mg(理论值的15%)标题化合物。
LC-MS(方法4): Rt=0.92 min; MS(ESIpos): m/z=398(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.80(br. s, 1H), 7.62(s, 1H), 7.59(d, 1H), 7.31(d, 1H), 4.87(s, 1H), 2.49(s, 3H)ppm。
按照类似于实施例26中所描述的方法制备下列化合物；通过制备RP-HPLC进行纯化，使用甲醇/水+ 0.1% TFA梯度∶
实施例30
rac-2-(1,1-二氟丙基)-6-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将113 mg(0.50 mmol)(2E)-2-[(3-甲基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈(实施例2A)和432 mg(0.50 mmol，基于17%纯度)4,4-二氟-3-氧代己腈(实施例13A)的2-丙醇(334μl)和乙酸(170μl)溶液用116 mg(1.5 mmol)乙酸铵处理，并在微波条件下、在90℃搅拌20分钟。冷却后，减压浓缩该混合物，并将残余物悬浮在对二甲苯(1.5 ml)中。加入少量的对甲苯磺酸和粉末4?分子筛，并将该混合物在回流温度下搅拌48小时。一旦冷却，将该混合物用乙腈稀释，过滤，减压浓缩。用制备RP-HPLC纯化粗品(乙腈/水梯度，最终混合物9:1 v/v)，而后进行制备薄层硅胶色谱(甲苯/乙醇5:1 v/v)，得到7.2 mg(理论值的4%)外消旋的标题化合物浅黄色固体。
LC-MS(方法2): Rt=1.00 min; MS(ESIpos): m/z=354(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.73(s, 1H), 9.68(s, 1H), 7.57(s, 1H), 7.53(d, 1H), 7.28(d, 1H), 4.64(s, 1H), 2.54(s, 3H), 2.24(m, 2H), 2.13(s, 3H), 1.00(t, 3H)ppm。
实施例31
2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵3,5-二氰基-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(二氟甲基)-4H-吡啶-1-化物(对映体1)
在氩气氛下，向75 mg(0.23 mmol)2-(二氟甲基)-6-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(对映体1；实施例2)的乙醇(1.6 ml)悬浮液中加入32.6μl(0.23 mmol)2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵碳酸氢盐溶液(胆碱碳酸氢盐，80%，在水中)，并将该混合物在回流温度下搅拌1小时。随后，蒸发溶液，并将残余物真空干燥。将沉淀在1.5 ml THF中搅拌3天，而后离心，得到56 mg(理论值的56%)标题化合物黄色固体。
LC-MS(方法4): Rt=0.82 min; MS(ESIpos): m/z=326(M-C5H14NO+2H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.55(s, 1H), 7.43(d, 1H), 7.32(s, 1H), 7.27(d, 1H), 6.12(t, 1H, 2JHF=55.0 Hz), 5.30(s, 1H), 4.42(s, 1H), 3.82(m, 2H), 3.38(m, 2H), 3.10(s, 9H), 2.46(s, 3H), 1.88(s, 3H)ppm。
FT-IR(固体)∶3329, 3012, 2169(CN), 1583, 1513, 1378, 1350, 1281, 1238, 1130, 1089, 1030, 1002, 952, 936, 884, 870, 853, 764, 735 cm-1.
DSC∶182℃(放热分解宽峰)，ΔH-884 J/g。
实施例32
2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵3,5-二氰基-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(二氟甲基)-4H-吡啶-1-化物(对映体2)
在氩气氛下，向67 mg(0.21 mmol)2-(二氟甲基)-6-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(对映体2；实施例3)的乙醇(1.4 ml)悬浮液中加入28.9 μl(0.21 mmol)2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵碳酸氢盐溶液(胆碱碳酸氢盐，80%，在水中)，并将该混合物在回流温度下搅拌1小时。随后，蒸发溶液，并将残余物真空干燥。将沉淀在1.5 ml THF中搅拌3天，而后离心，得到48 mg(理论值的54%)标题化合物黄色固体。
LC-MS(方法4): Rt=0.82 min; MS(ESIpos): m/z=326(M-C5H14NO+2H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.55(s, 1H), 7.43(d, 1H), 7.32(s, 1H), 7.27(d, 1H), 6.12(t, 1H, 2JHF=55.0 Hz), 5.30(s, 1H), 4.42(s, 1H), 3.82(m, 2H), 3.38(m, 2H), 3.10(s, 9H), 2.46(s, 3H), 1.88(s, 3H)ppm。
FT-IR(solid): 3328, 2861, 2169 (CN), 1591, 1512, 1378, 1350, 1280, 1238, 1129, 1089, 1031, 1002, 952, 936, 884, 869, 853, 764, 735 cm-1.
DSC∶176℃(放热分解宽峰)，ΔH-747 J/g。
实施例33
2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵(4S)-3,5-二氰基-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-4H-吡啶-1-化物
在氩气氛下，向101 mg(0.30 mmol)(4S)-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(实施例6)的乙醇(2.43 ml)悬浮液中加入52 μl(0.30 mmol)2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵碳酸氢盐溶液(胆碱碳酸氢盐，80%，在水中)，并将该混合物在回流温度下搅拌40分钟。随后，蒸发溶液，并将残余物真空干燥。将沉淀在1.5 ml THF/戊烷(9:1 v/v)中搅拌7天，而后离心，得到70 mg(理论值的51%)标题化合物固体。
LC-MS(方法3): Rt=1.81 min; MS(ESIpos): m/z=344(M-C5H14NO+2H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.58(s, 1H), 7.44(d, 1H), 7.32(s, 1H), 7.25(d, 1H), 5.29(s, 1H), 4.42(s, 1H), 3.85-3.80(m, 2H), 3.39-3.35(m, 2H), 3.10(s, 9H), 2.46(s, 3H), 1.90(s, 3H)ppm。
FT-IR(固体)∶3418, 3097, 3021, 2865, 2175 (CN), 1592, 1516, 1486, 1376, 1330, 1283, 1210, 1170, 1150, 1120, 1088, 998, 956, 935, 888, 864, 844, 819, 764, 732, 710, 685 cm-1.
DSC∶182℃(放热分解宽峰)，ΔH-814 J/g。
实施例34
(4S)-3,5-二氰基-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-4H-吡啶-1-化钠
在氩气氛下，向200 mg(0.583 mmol)(4S)-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(实施例6)的THF(6 ml)悬浮液中加入612 μl(0.612 mmol)1N氢氧化钠水溶液，并将该混合物在弱氩气流中、在室温下搅拌3天。在轻微的氩气流中，将得到的固体在水中另外搅拌3天至干燥，使产物结晶，得到212 mg(理论值的100%)标题化合物固体。
LC-MS(方法4): Rt=0.86 min; MS(ESIpos): m/z=344(M-Na+2H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.58(s, 1H), 7.44(d, 1H), 7.32(s, 1H), 7.25(d, 1H), 4.42(s, 1H), 2.46(s, 3H), 1.90(s, 3H)ppm。
FT-IR(固体)∶3302, 2870, 2183(CN), 1631, 1587, 1508, 1438, 1378, 1329, 1284, 1205, 1180, 1150, 1125, 1055, 995, 880, 821, 786, 764, 729, 675, 657 cm-1.
DSC∶227℃(放热分解)，ΔH-150 J/g。
实施例35
(4S)-3,5-二氰基-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-4H-吡啶-1-化钾
在氩气氛下，向60 mg(0.175 mmol)(4S)-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(实施例6)的THF(6 ml)悬浮液中加入175 μl(0.175 mmol)1N氢氧化钾水溶液，并将该混合物在弱氩气流中、在室温下搅拌5天。将得到的沉淀真空干燥，得到66 mg(理论值的100%)标题化合物固体。
LC-MS(方法4): Rt=0.87 min; MS(ESIpos): m/z=344(M-K+2H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.58(s, 1H), 7.44(d, 1H), 7.32(s, 1H), 7.25(d, 1H), 4.42(s, 1H), 2.46(s, 3H), 1.90(s, 3H)ppm。
FT-IR(固体)∶3296, 2876, 2173(CN), 1631, 1588, 1510, 1436, 1379, 1330, 1285, 1205, 1180, 1149, 1124, 1054, 996, 882, 821, 786, 764, 729, 704, 665 cm-1.
DSC∶199℃(放热分解)，ΔH-93 J/g。
实施例36
2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵(4R)-3,5-二氰基-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-4H-吡啶-1-化物
在氩气氛下，向100 mg(0.29 mmol)(4R)-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(实施例5)的乙醇(2.1 ml)悬浮液中加入41 μl(0.29 mmol)2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵碳酸氢盐溶液(胆碱碳酸氢盐，80%，在水中)，并将该混合物在回流温度下搅拌40分钟。随后，蒸发溶液，并将残余物真空干燥。将沉淀在1.5 ml THF/戊烷(9:1 v/v)中搅拌3天，而后离心，得到84 mg(理论值的64%)标题化合物固体。
LC-MS(方法4): Rt=0.88 min; MS(ESIpos): m/z=344(M-C5H14NO+2H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.56(s, 1H), 7.44(d, 1H), 7.34(s, 1H), 7.26(d, 1H), 5.29(s, 1H), 4.42(s, 1H), 3.85-3.80(m, 2H), 3.39-3.35(m, 2H), 3.10(s, 9H), 2.46(s, 3H), 1.90(s, 3H)ppm。
FT-IR(固体)∶3419, 2867, 2175 (CN), 1592, 1517, 1487, 1377, 1330, 1285, 1212, 1171, 1150, 1122, 1095, 999, 956, 935, 864, 819, 764, 732, 710, 688 cm-1.
DSC∶197℃(放热分解宽峰)，ΔH-744 J/g。
实施例37
(4R)-3,5-二氰基-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-4H-吡啶-1-化钠
在氩气氛下，向41 mg(0.12 mmol)(4R)-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(实施例5)的THF(1 ml)悬浮液中加入131 μl(0.13 mmol)1N氢氧化钠水溶液，并将该混合物在弱氩气流下、在室温下搅拌5天。将得到的沉淀真空干燥，得到44 mg(理论值的100%)标题化合物固体。
LC-MS(方法4): Rt=0.86 min; MS(ESIpos): m/z=344(M-Na+2H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.58(s, 1H), 7.44(d, 1H), 7.32(s, 1H), 7.25(d, 1H), 4.42(s, 1H), 2.46(s, 3H), 1.90(s, 3H)ppm。
实施例38
(4R)-3,5-二氰基-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-4H-吡啶-1-化钾
在氩气氛中，向39 mg(0.11 mmol)(4R)-2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(实施例5)的THF(2 ml)悬浮液中加入126 μl(0.12 mmol)1N氢氧化钾水溶液，并将该混合物在弱氩气流中、在室温下搅拌5天。将得到的沉淀真空干燥，得到44 mg(理论值的100%)标题化合物固体。
LC-MS(方法4): Rt=0.87 min; MS(ESIpos): m/z=344(M-K+2H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.58(s, 1H), 7.44(d, 1H), 7.32(s, 1H), 7.25(d, 1H), 4.42(s, 1H), 2.46(s, 3H), 1.90(s, 3H)ppm。
实施例39
3,5-二氰基-2,6-二(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-4H-吡啶-1-化钠
在氩气氛中，向100 mg(0.28 mmol)2,6-二(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(实施例14)的乙醇(0.25 ml)悬浮液中加入290 μl(0.29 mmol)1N氢氧化钠水溶液，并将该混合物在弱氩气流中、在室温下搅拌4天。将得到的沉淀真空干燥，得到110 mg(理论值的100%)标题化合物固体。
LC-MS(方法3): Rt=1.82 min; MS(ESIpos): m/z=380(M-Na+2H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.69(s, 1H), 7.46(d, 1H), 7.21(d, 1H), 6.22(t, 2H), 4.82(s, 1H), 2.44(s, 3H)ppm。
实施例40
2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵3,5-二氰基-2,6-二(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-4H-吡啶-1-化物
在氩气氛中，向100 mg(0.26 mmol)2,6-二(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(实施例14)的乙醇(1.52 ml)悬浮液中加入47 μl(0.26 mmol)2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵碳酸氢盐溶液(胆碱碳酸氢盐，80%，在水中)，并将该混合物在回流温度下搅拌1小时。随后，将弱氩气流从该溶液混合物上通过。将得到的沉淀真空干燥，得到130 mg(理论值的100%)标题化合物固体。
LC-MS(方法4): Rt=0.86 min; MS(ESIpos): m/z=380(M-C5H14NO+2H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.69(br. s, 1H), 7.46(d, 1H), 7.21(d, 1H), 6.22(t, 2H), 5.82(br. s, 1H), 4.82(s, 1H), 3.82(br. s, 2H), 3.40(br. s, 2H), 3.11(s, 9H), 2.44(s, 3H)ppm。
FT-IR(固体)∶3388, 2870, 2183 (CN), 1633, 1595, 1525, 1487, 1390, 1360, 1285, 1270, 1123, 1030, 952, 822, 703 cm-1.
DSC∶171℃(放热分解宽峰)，ΔH-573 J/g。
实施例41
2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵3,5-二氰基-2,6-二(二氟甲基)-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-4H-吡啶-1-化物
在氩气氛中，向80 mg(0.22 mmol)2,6-二(二氟甲基)-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(实施例13)的乙醇(1.52 ml)悬浮液中加入31 μl(0.22 mmol)2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵碳酸氢盐溶液(胆碱碳酸氢盐，80%，在水中)，并将该混合物在回流温度下搅拌1小时。随后，引导弱氩气流从该溶液混合物上通过。用THF(1.5 ml)处理粗品，并在氩气氛围中搅拌2天。离心收集得到的沉淀，真空干燥，得到57 mg(理论值的54%)标题化合物黄色固体。
LC-MS(方法4): Rt=0.85 min; MS(ESIpos): m/z=361(M-C5H14NO+2H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.6(s, 1H), 7.47(d, 1H), 7.39(s, 1H), 7.26(d, 1H), 6.22(t, 2H), 5.26(t, 1H), 4.52(s, 1H), 3.82(br. m, 2H), 3.40(m, 2H), 3.11(s, 9H), 2.46(s, 3H)ppm。
FT-IR(固体)∶3422, 2360, 2183 (CN), 1601, 1524, 1387, 1364, 1275, 1270, 1131, 1032, 1009, 958, 893, 866, 769 cm-1.
DSC∶161℃(放热分解宽峰)，ΔH-779 J/g。
实施例42
rac-1,2-二甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将375 mg(1.09 mmol)2-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(实施例4)的DMF(11.5 ml)溶液冷却至0℃。在此温度下加入534 mg(1.64 mmol)碳酸铯，15分钟之后，在室温下逐滴加入48μl(0.77 mmol)甲基碘。在室温下搅拌过夜之后，加入额外的甲基碘(20μl)和少量的碳酸铯，并将该反应混合物在室温下进一步搅拌3小时，而后加入水和甲醇。将得到的溶液用制备RP-HPLC直接纯化(乙腈/水 + 0.1% TFA梯度)，得到75 mg(理论值的19%)外消旋的标题化合物。
LC-MS(方法4): Rt=0.94 min; MS(ESIpos): m/z=358(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.77(br. s, 1H), 7.58(s, 1H), 7.54(d, 1H), 7.28(d, 1H), 4.69(s, 1H), 3.30(s, 3H), 2.49(s, 3H), 2.32(s, 3H)ppm。
实施例43和实施例44
1,2-二甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(对映体1和2)
用HPLC色谱在手性相上将实施例42的外消旋化合物(74 mg)分离为对映体[柱∶Daicel Chiralpak AD-H，5 μm，250 mm x 20 mm；洗脱液∶异己烷/乙醇，75:25 v/v；流速∶15 ml/min；温度∶30℃；UV检测∶220 nm]∶
实施例43(对映体1)∶
产率∶21 mg(化学纯度>99%，>99% ee)
Rt=6.09 min[柱∶Daicel Chiralpak AD-H，5 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶异己烷/乙醇，70:30 + 0.2% TFA + 1%水；流速∶1 ml/min；温度∶35℃；UV检测∶220 nm]。
实施例44(对映体2)∶
产率∶20 mg(化学纯度>99%，>95% ee)
Rt=6.65 min[柱∶Daicel Chiralpak AD-H，5 μm，250 mm x 4.6 mm；洗脱液∶异己烷/乙醇，70:30 + 0.2% TFA + 1%水；流速∶1 ml/min；温度∶35℃；UV检测∶220 nm]。
实施例45
2,6-二(二氟甲基)-1-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将100 mg(0.277 mmol)2,6-二(二氟甲基)-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈(实施例13)的DMF(1.5 ml)溶液冷却至0℃，并在此温度下加入108 mg(0.33 mmol)碳酸铯。搅拌30分钟之后，在室温下逐滴加入21μl(0.33 mmol)甲基碘，并将混合物在室温下搅拌过夜。此后，加入额外的甲基碘(20μl)，并在室温下进一步搅拌48小时。然后过滤该反应混合物，并将滤液直接用制备RP-HPLC纯化(乙腈/水 + 0.1% TFA，等度40:60 v/v)，得到12 mg(理论值的11%)标题化合物。
LC-MS(方法4): Rt=0.96 min; MS(ESIpos): m/z=376(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.8(br. s, 1H), 7.62(s, 1H), 7.57(d, 1H), 7.30(d, 1H), 7.11(t, 2H), 4.83(s, 1H), 3.40(s, 3H), 2.50(s, 3H)ppm。
实施例46
rac-2-(二氟甲基)-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二腈
将150 mg(0.936 mmol)3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例1A)、273 mg(1.03 mmol)4,4-二氟-3-氧代丁腈(实施例14A)、0.067 ml(1.17 mmol)乙酸和9.3μl(0.094 mmol)哌啶的混合物在无水二氯甲烷(4 ml)(含有4?分子筛)中回流搅拌12小时。然后，过滤该混合物，并将滤液减压浓缩。在氩气中，将残余物是溶于2-丙醇(2 ml)和乙酸(1 ml)中，并加入510 mg(3.75 mmol)3-氨基-4,4,4-三氟丁-2-烯腈[制剂∶A.W. Lutz，US专利3,635,977；C.G. Krespan，J. Org.Chem. 34，42(1969)]。将该溶液回流搅拌6小时。一旦冷却，蒸干该混合物，并将残余物用含有少量对甲苯磺酸的甲苯(4 ml)处理。将该混合物进一步回流搅拌12小时。一旦冷却，将该混合物再次蒸发至干，并将残余物溶于乙酸乙酯中。用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤有机相，用硫酸钠干燥，减压浓缩。将残余物用制备RP-HPLC纯化(甲醇/水 + 0.1% TFA梯度)，得到39 mg(理论值的11%)外消旋的标题化合物。
LC-MS(方法3): Rt=1.90 min; MS(ESIpos): m/z=380(M+H)+
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ=12.82(br. s, 1H), 10.93(br. s, 1H), 7.68(s, 1H), 7.58(d, 1H), 7.33(d, 1H), 6.81(t, 1H, 2JHF=52 Hz), 4.96(s, 1H), 2.50(s, 3H)ppm。
B. 生物活性评价
证明本发明化合物的活性可以通过本领域众所周知的体外、活体外和体内试验来完成。例如，为了说明本发明化合物的活性，可以使用下列试验∶
c-Met受体酪氨酸激酶活性试验(NADH读出（read - out）)∶
使用重组体人c-Met蛋白(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)。使用肽KKKSPGEYVNIEFG(JPT，Germany)作为激酶反应的底物。对于该试验，将1μL试验化合物的51倍浓缩液(在DMSO中)吸到白色384孔微孔板(Greiner Bio-One，Frickenhausen，Germany)中。加入25μL c-Met(最后浓度30 nM)和丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(Roche Diagnostics，Mann-heim，Germany；最后浓度8 mg/L)在试验缓冲剂[3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)，50 mM，pH7；MgCl2，10 mM；牛血清白蛋白(BSA)，0.01%；Triton X 100，0.01%；DTT，2 mM]中的溶液，并在室温下培养5分钟。然后，通过加入25μL三磷酸腺苷(ATP，最后浓度30μM)、底物(最后浓度100μM)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH，最后浓度50μM)和二硫苏糖醇(DTT，最后浓度2 mM)在试验缓冲剂中的溶液来起始激酶反应，并将得到的混合物在32℃培养100分钟的反应时间。
随后，通过测定NADH荧光的降低来评估磷酸化底物的量。为此，用荧光读数器(例如Tecan Ultra(Tecan，M?nnedorf，Switzerland))测定在340 nm激发之后的荧光发射(465 nm)。使数据标准化(没有抑制剂的酶反应=0%抑制；所有其它试验组分(但没有酶)=100%抑制)。通常，对9个不同浓度(在10μM至1 nM范围内(10μM，3.1μM，1.0μM，0.3μM，0.1μM，0.03μM，0.01μM，0.003μM，0.001μM；在试验之前，用51倍水平的浓缩储备溶液通过连续1:3稀释来制备稀释系列))的试验化合物在相同微孔板上进行试验，每个浓度试验两次，使用内部软件来计算IC50值。
下面表1中列出了一些代表性的IC50值以及结构上相关的、源于现有技术(cf. WO 2008/071451)的非氟化化合物的相应数据：
表1
c-Met受体酪氨酸激酶均相时间分辨荧光试验(替代形式)∶
使用人c-Met(氨基酸960-1390)(用昆虫细胞(SF21)表达，并用Ni-NTA亲和色谱和连续筛析色谱(consecotive size exclusion，Superdex 200)纯化)的N-末端His6-标记的重组体激酶域。或者，可以使用商购的c-Met(Millipore)。使用生物素化的聚Glu,Tyr(4:1)共聚物(# 61GT0BLC，Cis Biointernational，Marcoule，France)作为该激酶反应的底物。
对于该试验，将50 nL试验化合物的100倍浓缩液(在DMSO中)吸到黑色小体积384孔微孔板(Greiner Bio-One，Frickenhausen，Germany)中。加入2μL c-Met在试验缓冲剂[25 mM Hepes/NaOH，pH7.5；5 mM MgCl2；5 mM MnCl2；2 mM二硫苏糖醇；0.1%(v/v)Tween 20(Sigma)；0.1%(w/v)牛血清白蛋白]中的溶液，并将该混合物在22℃培养15分钟，使得试验化合物与酶预先结合，而后开始激酶反应。然后，通过加入3μL三磷酸腺苷(ATP，16.7μM；在5μL试验体积中的最后浓度是10μM)和底物(2.27μg/mL，在5μL试验体积中的最后浓度是1.36μg/mL～30 nM)在试验缓冲剂中的溶液来起始激酶反应，并将得到的混合物在22℃培养30分钟的反应时间。根据酶批量的活性来调节c-Met在该试验中的浓度，并且恰当地选择，使该试验在线性范围内；典型的酶浓度在大约0.03 nM范围之内(在5μL试验体积中的最后浓度)。通过加入5μL HTRF检测试剂[40 nM链霉亲和素(streptavidine)-XLent和2.4 nM PT66-Eu-螯合物，铕-螯合物示踪的抗磷酸酪氨酸抗体(Perkin-Elmer)]在EDTA水溶液[100 mM EDTA，0.2%(w/v)牛血清白蛋白(在50 mM HEPES/NaOH中，pH7.5)]中的溶液来终止该反应。
将得到的混合物在22℃培养1小时，使生物素化的磷酸化肽与链霉亲和素(streptavidine)-XLent和PT66-Eu-螯合物结合。随后，通过测定从PT66-Eu-螯合物至链霉亲和素(streptavidine)-XLent的共振能量转移，评估磷酸化底物的量。为此，用HTRF读数器(例如，Rubystar(BMG Labtechnologies，Offenburg，Germany)或Viewlux(Perkin-Elmer))测定在350 nm激发之后的荧光发射(620 nm和665 nm)。使用在665 nm和622 nm处的发射的比例来作为磷酸化底物的量度。使数据标准化(没有抑制剂的酶反应=0%抑制；所有其它试验组分(但没有酶)=100%抑制)。通常，对10个不同浓度(在20μM至1 nM范围内(20μM，6.7μM，2.2μM，0.74μM，0.25μM，82 nM，27 nM，9.2 nM，3.1 nM和1 nM；在试验之前，用100倍水平的浓缩储备溶液通过连续1:3稀释来制备稀释系列))的试验化合物在相同微孔板上进行试验，每个浓度试验两次，使用内部软件、通过4参数拟合来计算IC50值。
下面表2中列出了一些代表性的IC50值以及结构上相关的、源于现有技术(cf. WO 2008/071451)的非氟化的化合物的相应数据：
表2
磷酸(phospho)-c-Met试验∶
这是没有生长因子刺激作用的、使用MKN-45肿瘤细胞(胃癌，购买于ATCC)的、基于细胞的ELISA类试验[Meso Scale Discovery(MSD)，Gaithersburg，MD，USA]。在第一天，在96孔板中，将细胞涂覆在完全生长培养基中(10000个细胞/孔)。第二天，在无血清培养基中用药物处理两小时之后，将细胞洗涤，而后溶解(60μl/孔，使用MSD推荐的溶解缓冲剂)，并在-80℃冷冻。还在第二天，在4℃，将MSD磷酸(phospho)-Met板上的非特异性抗体结合位点用MSD封闭液A封闭过夜。在第3天，将冷冻的溶胞产物在冰上解冻，用Tris-缓冲盐水 + 0.05% Tween 20(TBST)洗涤一次之后，将25μl溶胞产物转入MSD磷酸（phospho）-Met板中，同时摇动，进行1小时。除去未结合的蛋白之后，向板中加入Sulfa-TAG抗Met抗体(得自于MSD，最后浓度为5 nM，在抗体稀释缓冲剂中)(按照MSD的方案)，同时摇动，进行1小时。然后用TBST缓冲剂洗涤该板三次，而后加入1xMSD读数缓冲剂。然后在MSD Discovery Workstation仪器上将该板读数。将原始数据(包括含有10μM参考化合物的孔(最小信号)和没有任何药物处理的DMSO孔(最大信号))输入Analyze 5程序，进行IC50值测定。
细胞磷酸(phospho)-c-Met试验∶
在37℃，在5% CO2存在下，将播种在384孔微孔板上的人胃腺癌细胞(MKN45，购买于ATCC)(9000个细胞/孔)在25μl 完全生长培养基中培养24小时。在第2天，在含有0.1% FCS的低血清培养基中用药物处理两小时之后，将细胞洗涤并溶解。用Tris-缓冲盐水 + 0.05% Tween 20(TBST)洗涤一次之后，将溶胞产物转入BSA封闭板中，板中含有预先结合的c-Met捕获抗体[购买于Mesoscale Discovery(MSD)，Gaithersburg，MD，USA]，同时摇动，进行1小时。按照MSD方案，在室温，向板中加入Sulfa-TAG抗磷酸(phospho)-c-Met检测抗体(最后浓度为5 nM，在抗体稀释缓冲剂中)，同时摇动，进行1小时。用Tris缓冲剂洗涤孔之后，加入1x读数缓冲剂，并在Sector Imager 6000(购买于Mesoscale)上测定该板。使用Marquardt-Levenberg-拟合法，由剂量反应曲线来计算IC50值。
体外肿瘤细胞增殖试验∶
用于测试本发明化合物的贴壁（adherent）肿瘤细胞增殖试验涉及由Promega开发的、称为Cell Titre-Glo的读出（read - out）[B.A. Cunningham, "A Growing Issue: Cell Proliferation Assays. Modern kits ease quantification of cell growth", The Scientist 2001, 15(13), 26; S.P. Crouch等人， "The use of ATP bioluminescence as a measure of cell pro-liferation and cytotoxicity", Journal of Immunological Methods 1993, 160, 81-88]。荧光信号的产生与所存在的ATP数量对应，其直接与代谢活性(增殖)细胞的数目成正比。
将H460细胞(肺癌，购买于ATCC)涂覆在96孔板(3000个细胞/孔，在完全培养基(含有10%胎牛血清))中，并在37℃培养24小时。涂覆之后二十四小时，加入试验化合物，最后浓度范围是10 nM至20μM(系列稀释，DMSO的最终浓度为0.2%)。加入试验化合物之后，在37℃，将细胞在完全生长培养基中培养72小时。第4天，使用Promega Cell Titre-Glo Luminescent?试验试剂盒，将细胞溶解，并将100μl底物/缓冲剂混合物加入到每个孔中，混合，在室温下培养8分钟。在光度计上将样品读数，测定每个孔的细胞溶胞产物之中所存在的ATP数量，其与该孔中的活细胞数目对应。将24小时培养的读数值减去作为第0天的数值。为了测定IC50值，可使用线性回归分析来测定使用该试验形式能够抑制50%细胞增殖时的药物浓度。该方案可用于使人感兴趣的各种细胞系，包括但不限于：CAKI-1，MNK-45，GTL-16，HCC2998，K562，H441，K812，MEG01，SUP15和HCT116。
C. 药物动力学性能的评价
为了评价本发明化合物的药物动力学(PK)特性，可以使用下列试验∶
静脉内给予试验化合物之后的药物动力学∶
使雄性Wistar大鼠(Harlan Laboratories)麻醉，并将导管插入大鼠的颈静脉中。第二天，将限定剂量的试验化合物溶液注射到尾静脉中。在接下来的24小时期间，通过颈静脉导管收集血样(8-11个时点)。将血液在肝素管中离心，用乙腈处理每个血浆样品，使蛋白沉淀。离心之后，使用LC-MS/MS方法，测定上清液中的试验化合物。测定的血浆浓度用于计算药物动力学参数，例如AUC(血浆浓度对时间曲线下的面积)，Vss(在稳态条件下的分布体积)，Cmax(给药之后在血浆中所观察到的最高试验化合物浓度)，t1/2(半衰期)和CL(血浆中试验化合物的总的廓清率)。为了计算血液廓清率，通过培养大鼠血液中的试验化合物来测定血液-血浆分布。离心分离血浆之后，通过LC-MS/MS方法测定血浆中的浓度。假设试验化合物被完全吸收，用方程式Fmax,calc=[1-CL血液/Qh]*100来计算理论上可达到的最大生物利用率Fmax,calc，其中CL血液是总的血液廓清率，Qh是大鼠的肝血流量(4.2 L/h/kg)。
口服给予试验化合物之后的药物动力学∶
使雄性Wistar大鼠(Harlan Laboratories)麻醉，并将导管插入大鼠的颈静脉中。第二天，经口给予限定剂量的试验化合物。在接下来的24小时期间，通过颈静脉导管收集血样(8-11个时点)。将血液在肝素管中离心，用乙腈处理每个血浆样品，使蛋白沉淀。离心之后，使用LC-MS/MS方法，测定上清液中的试验化合物。测定的血浆浓度用于测定药物动力学参数，例如AUC(血浆浓度对时间曲线下的面积)，Cmax(给药之后在血浆中所观察到的最高试验化合物浓度)，t1/2(半衰期)和F(生物利用率)。利用方程式fabs,calc=[F/Fmax,calc]*100来计算吸收的剂量部分(fabs,calc)，其中F是口服给药之后测定的生物利用率，Fmax,calc是理论上可达到的最大生物利用率(考虑测定的血液廓清率，并假定试验化合物被完全吸收)。
Caco-2渗透性试验∶
试验化合物经Caco-2细胞单层的体外渗透作用是已完善建立的预测胃肠道渗透性的试验系统[cf. P. Artursson and J. Karlsson: Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permea-bility coefficients in human intestinal epithelial(Caco-2)cells, Biochem. Biophys. 175(3), 880-885(1991)]。如下所述，测定本发明化合物在这种Caco-2细胞中的渗透性∶
将人caco-2细胞(ACC No. 169，DSMZ，German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，Braun-schweig，Germany)播种在24孔嵌入板上，并使其生长14-16天。为了渗透性研究，将试验化合物溶于DMSO中，并用转运缓冲液[Hanks'缓冲盐溶液，Gibco/Invitrogen，进一步补充有葡萄糖(最后浓度19.9 mM)和HEPES(最后浓度9.8 mM)]稀释至2μM的最后试验浓度。为了测定顶端至基底外侧的渗透性(PappA-B)，将试验化合物溶液加入到细胞单层的顶面，转运缓冲液加入到单层的基底外侧面；为了测定基底外侧至顶端的渗透性(PappB-A)，将试验化合物溶液加入到细胞单层的基底外侧面，转移缓冲剂加入到单层的顶面。在实验开始时，从供体部分获取样品，以便证明质量平衡。在37℃培养2小时之后，从两个部分获取样品。通过LC-MS/MS分析样品，并计算表观渗透系数。试验每个细胞单层的萤光黄渗透性，以便保证细胞单层的完整性，作为质量控制，测定每个批量的阿替洛尔(低渗透标志物)和柳氮磺吡啶(活性分泌标志物)的渗透性。
下面表3中列出了这些试验的代表性结果以及结构上相关的、源于现有技术(cf. WO 2008/071451)的非氟化的化合物的相应数据：
表3
[对于含义（meaning）和(如果合适的话)PK参数的计算，参见上面试验说明；AUCnorm=剂量和体重-归一化的AUC数值(AUC除以每kg体重的剂量)]。
本发明化合物的进一步的渗透性数据列于下面表4中∶
表4
虽然已经参考具体实施方案公开了本发明，但很明显，在不背离本发明的正确精神和范围的条件下，本领域其它技术人员可以设计本发明的其它实施方案和变体。应该将权利要求视为包括所有这种实施方案和同等变体。
D. 与药物组合物有关的实施例
按照本发明的药物组合物可以举例说明如下∶
无菌i.v.溶液剂∶
可以使用无菌的注射用水来制备本发明目标化合物的5 mg/ml溶液，如有必要，调节pH值。用无菌5%葡萄糖稀释该溶液，达到给药浓度1-2 mg/ml，并用大约60分钟进行i.v.输液给药。
用于i.v.给药的冷冻干燥粉剂∶
可以用下列来制备无菌制剂：(i)100-1000 mg冷冻干燥粉剂形式的本发明的目标化合物，(ii)32-327 mg/ml枸橼酸钠，和(iii)300-3000 mg葡聚糖40。用无菌注射用盐水或5%葡萄糖将该制剂重组至10至20 mg/ml的浓度，将其用盐水或5%葡萄糖进一步稀释至0.2至0.4 mg/ml，以i.v.推注或i.v.输液(15-60分钟)形式给药。
肌内混悬剂∶
可以制备下列肌内注射用的溶液剂或混悬剂∶
50 mg/ml不溶于水的本发明目标化合物；5 mg/ml羧甲基纤维素钠；4 mg/ml TWEEN 80；9 mg/ml氯化钠；9 mg/ml苯甲醇。
硬壳胶囊剂∶
如下制备大量单位胶囊剂：装填标准两段硬明胶胶囊，每个胶囊装填100 mg粉末活性组分、150 mg乳糖、50 mg纤维素和6 mg硬脂酸镁。
软明胶胶囊∶
在可消化的油例如大豆油、棉子油或橄榄油中制备活性组分的混合物，并利用正排量泵注射到熔融明胶中，形成含有100 mg活性组分的软明胶胶囊。将胶囊洗涤并干燥。可以将活性组分溶于聚乙二醇、丙三醇和山梨糖醇的混合物中，制备水可互溶的药物混合物。
片剂∶
利用常规方法制备大量片剂，使得剂量单位是100 mg活性组分、0.2 mg胶体二氧化硅、5 mg硬脂酸镁、275 mg微晶纤维素、11 mg淀粉和98.8 mg乳糖。为了提高适口性、提高精致性和稳定性或延迟吸收，可以使用合适的水和非水包衣。