一种茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白及其编码基因与应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103243108 A (43)申请公布日 2013.08.14 CN 103243108 A *CN103243108A* (21)申请号 201310168965.7 (22)申请日 2013.05.06 C12N 15/29(2006.01) C07K 14/415(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 重庆邮电大学 地址 400065 重庆市南岸区南山街道崇文路 2 号 (72)发明人 向浏欣 蔡应繁 刘吉军 王小艳 付于银 (74)专利代理机构 。

2、北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人 谢殿武 (54) 发明名称 一种茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白及其编码 基因与应用 (57) 摘要 本发明公开了茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白 及其基因与应用。本发明钙离子结合蛋白基因 BjCBP1， 其碱基序列如 SEQ ID NO.1 ； 本发明所构 建的重组原核表达载体 pET32a-BjCBP1 是由 SEQ ID NO.1 序列和原核表达载体 pET-32a(+) 构成， 重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjCBP1是由SEQ ID NO.1序列和植物表达载体pCAMBIA1302构成 ； 所述植物表达载体用于植物遗传转化， B。

3、jCBP1 基 因在 CaMV35S 启动子的启动下超量表达， 大量合 成 BjCBP1 蛋白， 从而提高植物耐逆境特性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103243108 A CN 103243108 A *CN103243108A* 1/1 页 2 1. 茎瘤芥钙离子结合蛋白基因 BjCBP1， 其特征在于， 其基因序列为 SEQ ID NO.1。 2. 茎瘤芥钙离子结合蛋白 BjCBP1， 其特。

4、征在于 ： 其氨基酸序列为 SEQ ID NO.3 所示。 3.茎瘤芥钙离子结合蛋白基因BjCBP1的重组原核表达载体pET32a-BjCBP1， 其特征在 于 ： 由权利要求 1 所述 SEQ ID NO.1 序列与原核表达载体 pET-32a(+) 构成。 4. 茎瘤芥钙离子结合蛋白基因 BjCBP1 的重组植物表达载体 pCAMBIA1302-BjCBP1， 其 特征在于 ： 由权利要求 1 所述 SEQ ID NO.1 序列与植物表达载体 pCAMBIA1302 构成。 5. 茎瘤芥钙离子结合蛋白基因 BjCBP1 在提高植物耐逆境特性的应用。 6. 根据权利要求 5 所述的茎瘤芥钙离。

5、子结合蛋白基因 BjCBP1 在提高植物耐逆境特性 的应用， 其特征在于， 所述耐逆境特性为耐盐特性。 权 利 要 求 书 CN 103243108 A 2 1/9 页 3 一种茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域， 具体涉及茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白及其编码基因 与应用。 背景技术 0002 钙离子信号在许多细胞活动， 如细胞代谢、 基因表达、 细胞骨架动态变化、 细胞周 期、 细胞死亡、 信号传导等过程中有重要作用。 0003 在植物细胞中， 钙离子的作用之一是作为第二信使， 很多外界环境信号， 如光、 生 物胁迫、 非生物胁迫、 植物激。

6、素等都会刺激胞液中 Ca2+浓度的增加， 从而引发钙离子信号传 导。钙离子信号传导途径中首先响应的即是钙离子结合蛋白， 其结合 Ca2+以后会发生构想 变化， 使疏水面外露， 从而激活或抑制其它蛋白的活性， 从而引发信号传导。 0004 高盐、 干旱和低温等非生物胁迫环境对作物的产量及生长发育有很大影响， 因此， 有关植物抗逆性基因的研究一直是植物学研究领域的热点之一。 0005 茎瘤芥 （Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee） ， 又称青菜头， 是十字花科 芸薹属植物， 为榨菜的主要原料， 是我国重庆、 四川、 浙江等地区主要的经济作物之一。 多年 来。

7、， 茎瘤芥的相关研究主要集中在遗传育种、 良种繁育、 栽培技术、 品质安全等领域， 近年才 陆续有生物学方面研究的报道， 包括基因的克隆、 功能研究以及茎瘤芥瘤状茎膨大相关研 究， 企图通过基因工程方法提高茎瘤芥的产量、 质量以及抗病性、 抗逆性等。 0006 对于茎瘤芥， 目前还未见其钙离子结合蛋白的序列以及基因功能的报道， 本发明 克隆了第一个茎瘤芥钙离子结合蛋白， 且经大量实验研究表明， 该蛋白具有提高植物抗逆 性的作用， 为植物抗逆性基因的研究和应用提供了新内容和新基础。 发明内容 0007 鉴于此， 本发明的目的之一是提供茎瘤芥 （英文 ： Brassica juncea var.t。

8、umida Tsen et Lee） 来源的钙离子结合蛋白 （英文 ： calcium-binding protein） 基因， 将其命名为 BjCBP1， 其核苷酸序列为 SEQ ID NO.1 所示， 该基因长 627bp。 0008 本发明的目的之二是提供茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白 BjCBP1， 其氨基酸序列为 SEQ ID NO.3 所示， 有 208 个氨基酸， 且序列通过 NCBI 的保守结构域 （conserved domains） 检测知具有 4 个 EFh 结构域。 0009 本发明的目的之三是提供茎瘤芥钙离子结合蛋白基因 BjCBP1 的重组原核表达载 体 pET32a-。

9、BjCBP1， 其由 SEQ ID NO.1 序列与原核表达载体 pET-32a(+) 构成。 0010 本发明的目的之四是提供茎瘤芥钙离子结合蛋白基因 BjCBP1 的重组植物表达载 体 pCAMBIA1302-BjCBP1， 其由 SEQ ID NO.1 序列与植物表达载体 pCAMBIA1302 构成。 0011 本发明的目的之五是提供茎瘤芥钙离子结合蛋白基因 BjCBP1 在提高植物耐逆境 特性的应用， 尤其是提高植物在高盐条件的耐受力。 0012 本发明通过茎瘤芥转录组测序获得序列片段 SEQ ID NO.4， 然后根据片段 SEQ ID 说 明 书 CN 103243108 A 3。

10、 2/9 页 4 NO.4 设计巢式引物并通过 RACE 方法扩增获得茎瘤芥第一个钙离子结合蛋白基因 BjCBP1， 基因编码 208 个氨基酸， NCBI 比对预测具有 4 个 EF-hand 结构域， 属于钙离子结合蛋白家 族成员 ； 通过构建BjCBP1基因的原核表达载体进行原核表达和蛋白纯化， 发现BjCBP1能够 结合钙离子， 证明是钙离子结合蛋白 ； 通过构建 BjCBP1 基因植物表达载体， 可直接用于农 杆菌介导的遗传转化， 创制耐逆境新种质， 提高植物的逆境耐受力特性， 尤其是耐盐特性， 可进行植物品种改良。 附图说明 0013 图 1 为本发明 BjCBP1 基因编码区序列。

11、 PCR 扩增的琼脂糖凝胶电泳图 ； 0014 图 2 为本发明原核表达纯化后的 BjCBP1 蛋白的 SDS-PAGE 凝胶电泳图 ； 0015 图 3 为本发明重组植物表达载体 pCAMBIA1302-BjCBP1 的构建流程图 ； 0016 图 4 为本发明转基因型拟南芥和野生型的 BjCBP1 基因表达水平检测图 ； 0017 图 5 为本发明 NaCl、 Mannitol 和 ABA 条件下野生型与转基因型拟南芥种子发芽率 结果图 ； 0018 图 6 为本发明 NaCl、 Mannitol 和 ABA 条件下野生型与转基因型拟南芥的生长情况 摄影图 ； 0019 图 7 为本发明 。

12、NaCl 和 ABA 条件下野生型与转基因型拟南芥的抗逆基因的表达水 平检测结果图 0020 图 8 为本发明 NaCl 下野生型与转基因型拟南芥的存活率统计图。 具体实施方式 0021 下面将结合实施例和附图来详细说明本发明， 这些实施例和附图仅起说明性作 用， 并不局限于本发明的应用范围。 本发明不限于下述实施方式或实施例， 凡不违背本发明 精神所做出的修改及变形， 均应包括在本发明范围之内。 0022 实验例 1 ： 茎瘤芥钙离子结合蛋白基因 BjCBP1 的克隆 0023 1主要试剂 ： 柱式小量植物总RNA抽提试剂盒 （W7021） 购自上海华舜生物技术有限 公司 ； DNA 纯化回。

13、收试剂盒购自天根生化科技有限公司 ； 5 -Full RACE Kit 试剂盒、 M-MLV 反转录酶、 Premix Ex Taq、 DL2000DNA Marker、 pMD19-T 载体均购自大连宝生物工程有限公 司。 0024 2 实验方法与步骤 ： 0025 BjCBP1 基因序列片段 SEQ ID NO.4 的获取 ： 采用柱式小量植物总 RNA 抽提试剂盒 方法提取获得茎瘤芥瘤茎的总RNA， 总RNA取小部分通过紫外分光光度计检测OD260/OD280 的比值为1.92， 通过琼脂糖凝胶电泳28S的亮度约是18S的2倍， 说明RNA的纯度高且无降 解， 达到实验要求。将总 RNA。

14、 样品送北京华大基因研究中心进行转录组测序 （RNA-seq） ， 方 法为用带有 Oligo（dT） 的磁珠富集茎瘤芥总 RNA 中的 mRNA， 加入 fragmentation buffer 将 mRNA 打断成短片段， 以 mRNA 为模板， 用六碱基随机引物合成第一条 cDNA 链， 然后加入缓 冲液、 dNTPs、 RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链， 在经过QiaQuick PCR试剂 盒 （Qiagen 公司） 纯化并加 EB 缓冲液洗脱之后做末端修复、 加 poly（A） 并连接测序接头， 然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择， 最后进行 P。

15、CR 扩增， 建好的测序文库 （200bp） 用 说 明 书 CN 103243108 A 4 3/9 页 5 Illumina HiSeqTM2000 进行测序。通过对测序结果进行注释， 选取可能的钙离子结合蛋白 片段序列 SEQ ID NO.4， 然后根据该片段序列进行基因全长的克隆以及功能分析。 0026 2.1BjCBP1 基因 5 端未知序列扩增 0027 2.1.1 总 RNA 提取和反转录 ： 采用柱式小量植物总 RNA 抽提试剂盒方法提取获得 茎瘤芥瘤茎的总 RNA， 然后取约 1g 总 RNA 通过 5 -Full RACE Kit 试剂盒方法去磷酸化、 去帽子、 加接头， 。

16、最后反转录获得 cDNA 第一链。 0028 2.1.2 引物设计 ： 根据转录组测序得到的已知序列 SEQ ID NO.4 设计两个反向巢 式引物 ： 0029 BjCBP1-AOUT ： 5-TCGTCTCCAATAGCCGAGAAAACT-3 0030 BjCBP1-AIN ： 5-TACCGTCTCCGTCGCAGTCCAC-3 0031 2.1.3 巢式 PCR 扩增 ： 0032 首先为 OUT 扩增 ： 以步骤 2.1.1 中 cDNA 第一链为模板， 采用引物 BjCBP1-AOUT 和 5 RACE Outer Primer（此引物为 5 -Full RACE Kit 试剂盒。

17、中的引物） 做 PCR 扩增， 反应 体系为 ： ddH2O7.4L， Premix Ex Taq10L， 模板1L， 上下游引物各0.8L。 PCR程序为 ： 94 3min， 94 30s、 56 30s、 72 1min， 30 个循环 ； 72延伸 10min。 0033 再做 IN 扩增 ： 以 OUT 扩增的 PCR 产物为模板， 采用引物 BjCBP1-AIN 和 5 RACE Inner Primer（此引物也为 5 -Full RACE Kit 试剂盒中的引物） 做 PCR 扩增。20L 反应 体系为 ： ddH2O7.4L， Premix Ex Taq10L， 模板1L， 。

18、上下游引物各0.8L。 PCR程序为 ： 94 3min， 94 30s、 58 30s、 72 1min， 32 个循环 ； 72延伸 10min。 0034 2.1.4 电泳 ： 将 IN 扩增的 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳在 450bp 左右有一特异 条带。 0035 2.1.5TA 克隆 ： 将 IN 扩增做 3 个 20L 反应体系， 电泳后用 DNA 纯化回收试剂盒 回收特异条带并连接至 pMD19-T 载体， 然后转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 经 PCR 筛选， 将重组阳性质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。 0036 2.1.6 测序结果 ： 测序获得的。

19、序列的 3 端序列与 SEQ ID NO.4 的 5 端序列完全 吻合， 两者成功拼接， 说明成功获得 BjCBP1 基因的 5 端序列。 0037 2.2BjCBP1 基因 3 端未知序列扩增 0038 2.2.1 总 RNA 提取和反转录 ： 采用柱式小量植物总 RNA 抽提试剂盒方法提取获得 茎瘤芥瘤茎的总 RNA， 然后取约 1g 总 RNA 为模板， 采用接头引物 5-ATTCTAGAGGCCGAGGC GGCCGACATG-d(T)30MN-3（N=A,G,C 或 T;M=A,G 或 C） （此接头引物来自 Clontech 公司的 SMART RACE cDNA Synthesi。

20、s Kit 试剂盒） 以及 M-MLV 反转录酶反转获得 cDNA 第一链。 0039 2.2.2 引物设计 ： 根据转录组测序得到的已知序列 SEQ ID NO.4 设计两个正向巢 式引物 ： 0040 BjCBP1-SOUT ： 5-ATGCTCAGGGAGGTGGACT-3 0041 BjCBP1-SIN ： 5-GCTATTGGAGACGAGCGGTGC-3 0042 2.2.3 巢式 PCR 扩增 ： 0043 首先为 OUT 扩增 ： 以步骤 2.2.1 中 cDNA 第一链为模板， 采用引物 BjCBP1-SOUT 和 3 RACE Primer （此引物为步骤 2.2.1 中接。

21、头引物的前部分， 即 5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC GACATG-3） 做 PCR 扩增， 20L 反应体系为 ： ddH2O7.4L， Premix Ex Taq10L， 模板 1L， 说 明 书 CN 103243108 A 5 4/9 页 6 上下游引物各 0.8L。PCR 程序为 ： 94 3min， 94 30s、 54 30s、 72 60s， 30 个循环 ； 72延伸 10min。 0044 再做 IN 扩增 ： 以 OUT 扩增的 PCR 产物为模板， 采用引物 BjCBP1-SIN 和 3 RACE Primer 做 PCR 扩增。20L 反应体系为 ： 。

22、ddH2O7.4L， Premix Ex Taq 10L， 模板 1L， 上 下游引物各 0.8L。PCR 程序为 ： 94 3min， 94 30s、 59 30s、 72 50s， 32 个循环 ； 72 延伸 10min。 0045 2.2.4 电泳 ： 将 IN 扩增的 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳在 300bp 左右有一特异 条带。 0046 2.2.5TA 克隆 ： 将 IN 扩增做 3 个 20L 反应体系， 电泳后用 DNA 纯化回收试剂盒 回收特异条带并连接至 pMD19-T 载体， 然后转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 经 PCR 筛选， 将重组阳性质粒送北京六合。

23、华大基因科技股份有限公司测序。 0047 2.2.6 测序结果 ： 测序获得的序列的 5 端序列与 SEQ ID NO.4 的 3 端序列完全 吻合， 两者成功拼接， 说明成功获得 BjCBP1 基因的 3 端序列。 0048 2.3BjCBP1 基因编码区序列扩增 0049 2.3.1 序列拼接 ： 将 2.1.6 获得的 5 端序列、 2.2.6 获得的 3 端序列和已知序列 SEQ ID NO.4 进行拼接， 得到 BjCBP1 基因全长序列 SEQ ID NO.2， 其全长 905bp， 编码区即 SEQ ID NO.1 序列有 627bp， 5 端非编码区有 92bp， 3 端非编码。

24、区有 186bp。为进一步验证 拼接的全长是否为真实的全长序列， 于是从 5 端和 3 端的非编码区设计引物进行 PCR 验 证。 0050 2.3.2 引物设计 ： 根据 2.3.1 的序列 SEQ ID NO.2， 从两端的非编码区设计一对上 下游引物 ： 0051 上游引物 BjCBP1-F ： 5-TTCCCCATCAAAAATAAATCTT-3 0052 下游引物 BjCBP1-R ： 5-CAAACGATACTCATAACCCTCA-3 0053 2.3.3 全长序列的 PCR 扩增 ： 以步骤 2.2.1 中 cDNA 第一链为模板， 采用引物 BjCBP1-F和BjCBP1-R。

25、做PCR扩增。 20L反应体系为 ： ddH2O7.4L， Premix Ex Taq 10L， 模板 1L， 上下游引物各 0.8L。PCR 程序为 ： 94 3min， 94 30s、 60 30s、 72 1min， 32 个循环 ； 72延伸 10min。 0054 2.3.4 电泳 ： 将 2.3.3 扩增的 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳发现特异条带如图 1 所示， M 为 MarkerIII， 1 为扩增条带， 可见在 750bp 左右有一特异条带， 与预期结果相符。 0055 2.3.5TA 克隆 ： 将 2.3.3 中的扩增做 3 个 20L 反应体系， 电泳后用 DN。

26、A 纯化回收 试剂盒回收特异条带并连接至 pMD19-T 载体， 然后转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 经 PCR 筛选， 将重组阳性质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。 0056 2.3.6 测序结果 ： 测序获得的序列与拼接序列的相应片段完全一致， 说明成功获 得 BjCBP1 基因。BjCBP1 基因编码的蛋白含有 208 个氨基酸， 如 SEQ ID NO.3 序列所示， 在 NCBI 上进行保守结构域预测其含有 4 个 EF-hand 基序， EF-hand 基序可能具有结合钙离子 的能力， 因此预测 BjCBP1 蛋白能结合钙离子， 进一步的实验验证见实验例 2。 005。

27、7 实验例 2 ： 茎瘤芥钙离子结合蛋白基因 BjCBP1 在大肠杆菌 BL21(DE3) 中的原核表 达及特性检测 0058 1、 主要试剂 ： His-Tag 蛋白纯化试剂盒购自北京康为试剂生物科技有限公司 ； 说 明 书 CN 103243108 A 6 5/9 页 7 T4DNA 连接酶、 限制性内切酶 BamH I 和 HindII 购自大连宝生物工程有限公司 ； 含原核表 达质粒 pET-32a(+) 的 DH5 菌种、 大肠杆菌菌株由本实验室保存。 0059 2、 重组原核表达载体 pET32a-BjCBP1 的构建 0060 2.1 引物设计 ： 根据 BjCBP1 基因的编码。

28、区序列 SEQ ID NO.3 设计上下游引物， 并 分别引入酶切位点 BamH I（GGATCC） 和 Hind（AAGCTT） 序列， 引物为 ： 0061 上游引物 pET-F ： 5 -CGGATCCATGAAATTCGCAAAACTG-3 0062 下游引物 pET-R ： 5 -CAAGCTTTCATCGCTGGAGATCCA-3 0063 2.2PCR扩增 ： 以实验例1中步骤2.2.1中cDNA第一链为模板， 引物pET-F和pET-R 做 PCR 扩增 ： 体系为 ddH2O7.4L， Premix Ex Taq10L， 模板 1L， 上下游引物各 0.8L。 PCR 程序为。

29、 ： 94 3min， 94 30s、 60 30s、 72 1min， 32 个循环 ； 72延伸 10min。 0064 2.3 电泳 ： 将 2.2 扩增的 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳在 630bp 左右有一特异条 带， 与预期结果相符。 0065 2.4TA 克 隆 获 得 重 组 载 体 pMD-T-BjCBP1 ： 将 2.2 中 的 扩 增 做 3 个 20L 反 应体系， 电泳后用 DNA 纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至 pMD19-T 载体得重组载 体 pMD-T-BjCBP1， 然后转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 经 PCR 筛选， 将含重组载体 pMD-。

30、T-BjCBP1 的阳性 DH5 菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。 0066 2.5 测序结果 ： 与预期结果完全一致。 0067 2.6 重组原核表达载体 pET32a-BjCBP1 的构建 ： 将 2.4 含重组载体 pMD-T-BjCBP1 的阳性 DH5 菌液扩大培养， 并采用普通质粒提取试剂盒的方法提取菌液中的重组质粒 pMD-T-BjCBP1 ； 将实验室保存的含原核表达质粒 pET-32a(+) 的 DH5 菌种扩大培养， 并 用同样的方法提取质粒 pET-32a(+)。用 BamH I 和 Hind 双酶切质粒 pMD-T-BjCBP1 和 pET-32a(+)， 。

31、参照酶的说明书两种质粒各做 2 个 50L 酶切体系。酶切后电泳， 并切下 pMD-T-BjCBP1 质粒的小片段和 pET-32a(+) 质粒的大片段， 利用胶回收试剂盒回收。用 T4DNA 连接酶连接小片段和大片段 （连接体系为 ： 小片段 7L， 大片段 1L， T4DNA 连接 酶 1L， 10T4DNA Ligase Buffer1L） 至少 24 小时， 然后利用热击法转化大肠杆菌感 受态 DH5 ； PCR 筛选阳性克隆， 再进行测序验证， 得到序列完全正确的重组原核表达载体 pET32a-BjCBP1 及含该表达载体的大肠杆菌。 0068 2.7pET32a-BjCBP1 重组。

32、原核表达载体转化大肠杆菌 BL21(DE3) 菌株及进行诱导 表达、 纯化蛋白和蛋白特性检测 ： 从 2.6 中含 pET32a-BjCBP1 载体的菌株中提取重组质粒， 用热激法转化 BL21(DE3) 菌株感受态， PCR 筛选得到阳性克隆。将此阳性克隆在含 50mg/L 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中 37、 180rpm 转速振摇培养至菌液浓度 OD600 为 0.4-0.8， 然后加入 IPTG（中文名 ： 异丙基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷 ； 终浓度为 1mM） 诱导 5 小时使 表达 BjCBP1 蛋白。然后根据 His-Tag 蛋白纯化试剂盒说明书纯化获得 BjCBP1 蛋白。

33、。将获 得的 BjCBP1 蛋白分别于含 10mM 钙离子和 10mM EGTA 金属离子螯合剂条件下进行的 12% 聚 丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 检测， 电泳结果如图 2 所示， BjCBP1 蛋白在含 Ca2+的条件下 电泳的迁移速率更快， 说明 BjCBP1 蛋白能够结合 Ca2+， 是钙离子结合蛋白。 0069 实 验 例 3 ： 茎 瘤 芥 钙 离 子 结 合 蛋 白 基 因 BjCBP1 的 重 组 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA1302-BjCBP1 的构建 0070 1 主要试剂 ： 普通质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司 ； T4DNA 连接酶、 限。

34、 说 明 书 CN 103243108 A 7 6/9 页 8 制性内切酶BamH I、 Bgl II和BstE II购自大连宝生物工程有限公司 ； 含质粒pCAMBIA1302 的菌种由本实验室保存。 0071 2 重组植物表达载体 pCAMBIA1302-BjCBP1 的构建 0072 2.1 引物设计 ： 根据 BjCBP1 基因的编码区序列 SEQ ID NO.3 设计上下游引物， 并 分别引入酶切位点 BamH I（GGATCC） 和 BstE II（GGTCACC） 序列， 引物为 ： 0073 上游引物 BjCBP1-Bam ： 5 -GGATCCATGAAATTCGCAAAAC。

35、TG-3 0074 下游引物 BjCBP1-Bst ： 5 -GGTCACCTCATCGCTGGAGATCCA-3 0075 2.2PCR 扩增 ： 以实验例 1 中步骤 2.2.1 中 cDNA 第一链为模板， 引物 BjCBP1-Bam 和 BjCBP1-Bst 做 PCR 扩增 ： 体系为 ddH2O7.4L， Premix Ex Taq10L， 模板 1L， 上下游 引物各 0.8L。PCR 程序为 ： 94 3min， 94 30s、 60 30s、 72 1min， 32 个循环 ； 72延 伸 10min。 0076 2.3 电泳 ： 将 2.2 扩增的 PCR 产物经 1% 琼。

36、脂糖凝胶电泳在 630bp 左右有一特异条 带， 与预期结果相符。 0077 2.4TA 克隆获得重组载体 pMD19-T-BjCBP1 ： 将 2.2 中的扩增做 3 个 20L 反 应体系， 电泳后用 DNA 纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至 pMD19-T 载体得重组载 体 pMD19-T-BjCBP1， 然后转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 经 PCR 筛选， 将含重组载体 pMD19-T-BjCBP1 的阳性 DH5 菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。 0078 2.5 测序结果 ： 与预期结果完全一致。 0079 2.6 重组植物表达载体 pCAMBIA1302-Bj。

37、CBP1 的构建 ： 构建方法如图 3 所示， 将 2.4 含重组载体 pMD19-T-BjCBP1 的阳性 DH5 菌液扩大培养， 并采用普通质粒提取试剂 盒的方法提取菌液中的重组质粒 pMD19-T-BjCBP1 ； 将实验室保存的含有植物表达质粒 pCAMBIA1302 的 DH5 菌种扩大培养， 并用同样的方法提取质粒 pCAMBIA1302。用 BamH I 和 BstE II 双酶切质粒 pMD19-T-BjCBP1、 用 Bgl II（Bgl II 与 BamH I 为同尾酶） 和 BstE II 双酶切质粒 pCAMBIA1302， 参照酶的说明书两种质粒各做 2 个 50L 。

38、酶切体系。酶切后 电泳， 并切下 pMD19-T-BjCBP1 质粒的小片段和 pCAMBIA1302 质粒的大片段， 利用胶回收试 剂盒回收。用 T4DNA 连接酶连接小片段和大片段 （连接体系为 ： 小片段 7L， 大片段 1L， T4DNA 连接酶 1L， 10T4DNA Ligase Buffer1L） 至少 24 小时， 然后利用热击法转化大 肠杆菌感受态 DH5 ； PCR 筛选阳性克隆， 再进行测序验证， 得到序列完全正确的重组表达 载体 pCAMBIA1302-BjCBP1 及含该重组表达载体的大肠杆菌。 0080 2.7pCAMBIA1302-BjCBP1 重组质粒转化农杆菌。

39、 ： 从 2.6 中含 pCAMBIA1302-BjCBP1 载体的菌株中提取重组质粒， 用液氮冷激法转化根瘤农杆菌 GV3101， 方法为 ： 200 根 瘤农杆菌 GV3101 感受态细胞中加入 2g（5-10 ） 重组质粒 DNA， 冰浴 5min， 然后转至 液氮中冷冻 8min ； 迅速与 37水浴中温浴 5min 后， 加入 800 LB 液体培养基 28 250rpm 预培养 4-5h， 然后涂布于含有 Kan(50mg/l) Gent(50mg/l) 的 LB 平板， 28培 育 24-28 小时后可出现菌落 ； 挑取菌体做菌体 PCR 鉴定， 确定正确后保存于 -70， 即为。

40、 植物遗传转化的工程菌株。 0081 实施例 3 ： 拟南芥的遗传转化 0082 1 主要试剂 ： 荧光定量 PCR 试剂盒 SYBR Premix Ex TaqTMKit 购自大连宝生物工程 有限公司 ； 柱式小量植物总 RNA 抽提试剂盒 W7021， 购自上海华舜生物技术有限公司 ； DNA 说 明 书 CN 103243108 A 8 7/9 页 9 酶购自 Promega 公司。 0083 2 拟南芥的培养及农杆菌侵染实验 0084 取野生型拟南芥种子， 用 75% 乙醇消毒 1min 后无菌水清洗 ； 再用 5%NaClO 灭菌 10min， 无菌水清洗 5 次， 去尽 NaClO。

41、 残留液。加一定量无菌水， 于 4条件下春化 3-4 天 ； 0085 将春化 3-4 天的拟南芥种子在 MS 空白培养基上光照培养 7 天， 待长出幼苗， 移 栽至蛭石培养基 （蛭石 ： 营养土 ： 珍珠岩 =3 ： 1 ： 1） ， 1/2MS 液体培养基浇灌 ； 0086 待植物培养至初生花序 10-15cm， 次生花序刚刚形成花芽状时， 去除初生花序 ； 培养至可进行侵染实验 ； 0087 将实验例 2 步骤 2.7 中制备好的已转化 pCAMBIA1302-BjCBP1 质粒的农杆菌菌 液扩大培养， 即在转化前1天晚上转入大瓶过夜培养 ； 至菌液浓度为OD600=2.0 ； 离心， 。

42、弃上 清， 将农杆菌沉淀悬浮于约 3 倍体积的渗透培养液中， 使 OD600 在 0.8 左右 ； 0088 将植物的地上部分浸入农杆菌悬浮液中侵染 5 分钟 ； 用保鲜膜将侵染过的植物 （T0 代植物） 罩起来以保持湿度， 置培养箱中黑暗培养 12 小时后正常条件培养 ； 2-3 天揭去 保鲜膜， 7 天后可浇水 ； 并定期侵染几次 ； 0089 继续培养至植物成熟， 收种子 （T1 代种子） 。 0090 MS 培养基由大量元素、 微量元素、 铁盐、 有机物质、 激素等按一定比例组成。MS 培 养基作为目前使用最广的离体细胞培养基， 由于其中无机盐浓度较高， 为外植体的生长提 供了足够的矿。

43、质营养并能使愈伤组织加速生长。为便于溶液配制及减小误差， 先按大量元 素、 微量元素、 铁盐、 有机物质配制一定体积的母液。待用时再按一定比例稀释混合。 0091 3 拟南芥转基因纯合体的筛选 0092 T1 代种子经消毒、 灭菌和春化处理后均匀地涂布在含有潮霉素 （25mg/L） 抗生素 的 MS 培养基上， 至人工气候培养箱中培养， 观察幼苗 （T1 代植物） 的生长状况。10-12 天后 明显可以观察到非转基因拟南芥只能长出 2 片子叶、 没有真叶、 根非常短， 而转基因拟南芥 长出 2-4 片真叶、 根长， 于是将转基因苗移栽至蛭石培养基中， 成熟后分别收取各个转基因 苗种子 （T2代。

44、种子） 。 T2代种子经消毒、 灭菌和春化处理后均匀地涂布在含有潮霉素 （25mg/ L） 抗生素的 MS 培养基上， 抗性苗与非抗性苗的数量比约为 3:1 的， 再将抗性苗 （T2 代植物） 移栽至蛭石培养基中， 成熟后分别收取各个转基因苗种子 （T3 代种子） 。取各个 T2 代植物 的小部分 T3 代种子， 经消毒、 灭菌和春化处理后均匀地涂布在含有潮霉素 （25mg/L） 抗生素 的 MS 培养基上， 若全为抗性苗的即为纯合体， 则相应的 T3 代种子可以用于后续实验， 相应 的 T2 代植物为纯合体。 0093 随机选取纯合体 T2 代植物 6 株， 分别命名为 TL1、 TL2、 。

45、TL3、 TL4、 TL5 和 TL6， 采用 柱式小量植物总 RNA 抽提试剂盒方法提取各株植物叶片的总 RNA， 经 DNA 酶去除 DNA， 根据 定量 PCR 试剂盒 SYBR Premix Ex TaqTMKit 说明书操作检测各个转基因拟南芥中的 BjCBP1 基因的表达量， BjCBP1 基因的引物为 ： 0094 上游引物 ： 5 -CGTTAGAGGAGTGCGAGCGTATG-3 0095 下游引物 ： 5 -CGAGAACTCAGTGAAGCACACGAAT-3 ， 0096 内参基因为拟南芥 18S 基因， 其引物为 ： 0097 上游引物 ： 5 -CGTCCCTGC。

46、CCTTTGTACAC-3 0098 下游引物 ： 5 -CGAACACTTCACCGGATCATT-3 ， 说 明 书 CN 103243108 A 9 8/9 页 10 0099 定量 PCR 结果如图 4 所示， 横坐标 WT 表示野生型拟南芥， TL1 至 TL6 表示随机选 取的 6 株转基因拟南芥植株， 纵坐标表示 BjCBP1 基因的相对表达量， 知 TL3 和 TL4 表达量 较高， 于是选取 TL3 和 TL4 的 T3 代种子用于后续实验， TL3 和 TL4 的 T3 代种子及其发芽后 生长的植株均简称为转基因 TL3 和转基因 TL4。 0100 实验例 4 ： 转 B。

47、jCBP1 基因拟南芥的逆境反应实验 0101 将转基因 TL3 和 TL4 种子和野生型种子经消毒、 灭菌和春化处理后均匀地涂布在 MS 培养基上， 至人工气候培养箱中培养， 观察发芽率情况和植物生长情况， 转基因型和野生 型没有明显差异。将转基因 TL3 和 TL4 种子和野生型种子经消毒、 灭菌和春化处理后分别 均匀地涂布在含 100mM NaCl、 250mM 甘露醇 （英文 mannitol） 或 0.5M 脱落酸 （简称 ABA） 的 MS 培养基上， 观察发芽率情况和植物生长情况。发芽率情况如图 5 所示， A 为在 0.5M ABA 条件下的从 0-9 天发芽率统计， B 为在。

48、 0.5M ABA 条件下的第 5 天的发芽率图片， C 为 在 100mM NaCl 条件下的从 0-9 天发芽率统计， C 为在 250mM mannitol 条件下的从 0-9 天 发芽率统计， A、 C、 D 中黑方块、 黑圆、 白圆分别代表野生型、 转基因 TL3、 转基因 TL4。发芽率 实验图 5 显示转基因型种子在 2-6 天比野生型发芽率明显低， 即转基因型种子发芽率对逆 境条件 （NaCl、 mannitol 和 ABA） 具有超过敏现象， 说明 BjCBP1 基因在植物逆境条件生长时 起重要作用。 0102 另外， 当转基因 TL3 和 TL4 种子和野生型种子在 MS 培养基上发芽 3 天后取部分转 移至含 100mM NaCl、 250mM 甘露醇 （英文 mannitol） 或 0.5M 脱落酸 （简称 ABA） 的 MS 培养 基上继续生长， 10 天后观察植物生长情况， 如图 6 所示， 转基因型 TL3、 TL4 和野生型在正常 的 MS 培养基上生长无明显区别， 但转基因型在逆境条件下生长比野生型明显受抑制， 即转 基因型种子发芽后生长对逆境条件 （NaCl。