利用水体沉积物中微生物多样性指标评价水质的方法.pdf

本发明涉及一种利用水体沉积物中微生物多样性指标评价水质的方法。该方法通过利用Miseq高通量测序确定沉积物中微生物群落结构，结合相关水体理化指标，运用主成分分析和非度量多维度尺度分析等统计学方法研究微生物与其生境之间的关系，并计算PA和BGN:β评价微生物指标，确定水质富营养水平和污染水平。本发明利用高通量测序技术客观全面地获得不同污染类型水体沉积物中微生物的群落特征，综合评价水体水质，所选的微生物评价指标能灵敏地反映水质变化，适应性较广，对各类水体沉积物都可以准确测定。

权利要求书
1.  一种水体沉积物中微生物多样性指标评价水质的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.    提取沉积物中微生物基因组DNA；
b.    以步骤a提取的DNA作为模板，针对16S rRNA基因的V4可变区，合成带有barcode的融合引物如下：
F：5’- Index+AYTGGGYDTAAAGNG-3’，
R：5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3），并进行PCR扩增；
c.    将步骤b得到的PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带切胶纯化，在经切胶纯化后的 DNA 片段的3’端引入单碱基“A”，连接“Y”字形接头，该“Y”字形接头的3’末端含有单碱基“T”，使所述的DNA 片段和接头能够通过“A”“T”互补配对连接，后利用PCR 选择性地富集两端连有接头的DNA片段，同时扩增DNA文库，测序；
d.    对经步骤c测序后的序列进行过滤和去除嵌合体，进行OTU的聚类和注释，各分类水平上进行群落结构的统计分析和物种丰度差异分析，利用微生物指标评价因子PA，BGN：β进行评价。

说明书利用水体沉积物中微生物多样性指标评价水质的方法
技术领域
本发明涉及一种利用水体沉积物中微生物多样性指标评价水质的方法。
背景技术
在淡水生态系统中，由于沉积物和上层水体频繁地进行营养物质和污染物质的交换，沉积物中代谢过程极大地影响了水体的水质。水体的大部分微生物栖息于沉积物中，不断进行各种有机物质的分解和转化，是食物链中的重要生产者。因此，微生物具有对环境条件变化的敏感性，微生物群落对水质变化的生态效应主要是某些指标种（对某种污染有耐性或敏感的种类）的出现或消失、个别种群的变化、微生物群落中种类或类群的增减及改变等，而这些生态效应都集中体现在沉积物微生物群落结构和多样性方面的变化，可以利用微生物组成与多样性变动评价水质。
由于微生物监测具有传统理化监测所不可替代的优越性，不仅能反映环境污染对生物产生的综合效应和积累效应，还可以对仪器无法检测出的一些低浓度甚至是痕量的污染物，生物可迅速呈现相应症状。总之，生物学法具有直观、准确的优点，不仅反映水质的瞬时变化，而且能连续监测水质污染，反映低浓度污染物对生物体的潜在危害。
目前我国的河流水质的微生物检测主要以纯培养技术为主，但是水体细菌的种类较多，传统的分离培养方法只能获得少数细菌种类，随着高通量测序技术的飞速发展与完善，克服了传统分子生物学方法通量低、准确率低等缺点，可以更加全面、准确、快速地反映环境微生物群落结构，从而可以更加客观地认识环境中微生物原位的生态状况。因此，为了更好地促进河流水质管理，今后我国应采用理化指标和微生物指标全面评价河流水质。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种利用水体沉积物中微生物多样性指标评价水质的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种水体沉积物中微生物多样性指标评价水质的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
1）    提取沉积物中微生物基因组DNA；
2）    以步骤a提取的DNA作为模板，针对16S rRNA基因的V4可变区，合成带有barcode的融合引物如下：
F：5’- Index+AYTGGGYDTAAAGNG-3’，
R：5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3），并进行PCR扩增；
3）              将步骤b得到的PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带切胶纯化，在经切胶纯化后的 DNA 片段的3’端引入单碱基“A”，连接“Y”字形接头，该“Y”字形接头的3’末端含有单碱基“T”，使所述的DNA 片段和接头能够通过“A”“T”互补配对连接，后利用PCR 选择性地富集两端连有接头的DNA片段，同时扩增DNA文库，测序；
4). 对经步骤c测序后的序列进行过滤和去除嵌合体，进行OTU的聚类和注释，各分类水平上进行群落结构的统计分析和物种丰度差异分析，利用微生物指标评价因子PA，BGN：β进行评价。
计算微生物指标评价因子：
根据Simt et al.（Applied Environmental Microbiology, 2001, 67:2284-2291）计算                                                ；
PA值>0.8为富营养，>0.46时为营养丰富，<0.34为寡营养水平。
根据Garrido et al.（Science of The Total Environment, 2014, 468–469: 1154–1161）计算 ；
其中Bac是拟杆菌门丰度，GmP是γ变形菌门丰度，Nit是硝化螺菌门丰度，BtP是β变形菌门丰度。
BGN:β指数越高，说明水体污染越严重。BGN:β<0.85，水体水质尚清洁，BGN:β>1.3，水体污染较严重。
本发明有如下优点：
1.本发明运用微生物群落结构相关指标能综合评价水体水质，具有很强的敏感性，能更全面地反映水质的变化。
2.本发明应用MiSeq Illumina测序技术可以获得高通量的基因序列（>3万条优质序列/样品），能获得客观全面的微生物群落结构，更直接全面地反映水环境污染程度。
3.对各类水体的沉积物都可以准确测定，在时间和空间动态都能进行长期和短期的监测，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1 本发明实施例一种沉积物基因组DNA。
图2 沉积物中微生物物种丰度分布曲线：每条折线代表一个样品的 OTU 丰度分布，物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线跨度越大表示物种的组成越丰富；物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。
图3 沉积物微生物群落结构与理化性质非度量多维度尺度分析。
图4 沉积物微生物PA评价因子。
图5 沉积物微生物BGN:β评价因子。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于次。
实施例1、
1、选取浙江某城市内两条II级航道河流，采集不同断面的共11个样点底泥沉积物，取样深度为10 cm。测定pH、COD、TN、TP、氨氮浓度等多项理化指标，如表1所示。采集好的底泥样品置于离心管中并在-20℃保存。
表1 采样点主要理化性质指标值

2、取0.5g各采样点沉积物样品提取DNA（PowerSoil? DNA Isolation Kit, 按说明书步骤提取），见图1。并用微量分光光度计测定采样点DNA浓度和纯度。
3、针对16S rRNA基因的V4可变区合成融合引物（F：5’- Index+AYTGGGYDTAAAGNG-3’，R：5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3）并进行扩增。PCR反应体系选取12.5uL标准体系：1.25 μL 10×buffer、25 mM MgCl2、2.5 mM dNTP、0.5 U Taq DNA 聚合酶、3.0 pmol前引物和后引物、50ng DNA模板进行如下程序PCR扩增：95℃5min，94℃下30s进行35个循环，52–64°C下30s, 72°C下40s, 72°C下伸展7min。
4、利用MiSeq Illumina测序平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司，上海）结果用QIIME和Mothur等软件进行生物信息分析，对得到的优质序列进行OTU的聚类和注释，各分类水平上进行群落结构的统计分析和物种丰度差异分析。见图2
5、运用SPSS和R-2.1.1等软件结合沉积物理化性质和微生物群落结构进行主成分分析和非度量多维度尺度分析。见图3。非度量多维度尺度分析结果良好，重要值达到0.12。如图1 所示，影响微生物种群分布和群落结构的主要污染物为COD、挥发酚和氨，而它们所影响的样点分布也和污染物有一定的关系：主要受挥发酚影响的东山大桥、湿地和联合桥都属于农业区，公铁立交桥除外；这些点的放线菌、绿弯菌门和厚壁菌门相对比例较高，这些菌门均和挥发酚的转化有关。主要受COD影响的样点长水塘河和公铁立交桥点的绿菌门和绿弯菌门相对比例较高，这两类菌门均和有机物的转化相关。污染物质对微生物群落结构具有一定程度地选择作用。
6、计算微生物群落PA和BGN:β评价因子，评价所监测的河流水体水质生态状况，见图4、图5。在本案例中，11个样点的PA评价因子分布在0.79-0.89范围内，由此可知调查河流水质均达到富营养水平（PA值>0.8为富营养，>0.46时为营养丰富，<0.34为寡营养水平），与理化性质指标一致。同时，在不同功能区比值特征也存在一定区别，农业区高于工业区和生活区，因为农业区有着较多有机污染物的排入，其次是生活区，工业区最低。另一方面，根据BGN: β评价指标，工业区高于另外两个功能区，生活区次之，农业区最低。而BGN: β的比值越低则说明水体受污染程度越小，但是本案例中11个样点的BGN: β值分布在1.55-3.51，均大于1.3，说明水体受污染较严重。
<110>  上海大学
<120>  利用水体沉积物中微生物多样性指标评价水质的方法
<160>  2
 
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<211>  15
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
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<213>  人工序列
 
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