一种草酸青霉菌NJDL-03菌株及其应用技术领域
本发明属于环境生物技术领域，涉及一种草酸青霉菌NJDL-03菌株及其应用，利用该草酸青霉菌NJDL-03菌株提高羟基磷灰石溶解度，修复铅污染水体及土壤，利用该NJDL-03菌株制备的溶磷草酸青霉固体菌肥提高石灰性土壤中磷素利用效率并修复铅污染土壤。
背景技术：
人类对自然界各种矿产资源的无限制开采、使用以及对含重金属(铅)的废渣、废水、废气的任意排放，导致重金属(铅)以多种形式进入环境，尤其公路两边土壤因铅汽车尾气沉降，矿区周围土壤由于铅锌采炼其含铅量高达10000mg/kg，造成严重污染。重金属(铅)进入水体或土壤后，大部分在植物体内积累，影响植物生长发育，降低作物产量，并在作物内积累经食物链进入人体，对人体造成极大威胁，铅污染已日益显现为我国环境健康的突出问题。
目前，铅污染修复措施主要包括物理化学修复以及植物修复等方面，物理化学修复，虽见效快，但有的改良剂可能会带来二次污染，并且还有活化的风险；植物修复费用低，可清除污染物，但是生物量小，修复时间较长。因此为了实现降低铅的作物吸收，提高粮食生产安全，寻找一种降低重金属铅有效性的经济有效措施和技术显得尤为重要。利用微生物代谢产酸溶解羟基磷灰石，释放其中的磷酸根离子，与铅离子反应生成更难溶性的羟基磷酸铅，进而降低铅在水体及土壤环境中的有效性。此为一项治理铅污染水体或土壤的重要修复技术。
另一方面，在农业生态系统中土壤有效磷是植物生长及作物高产的限制因子。据全国土壤普查估算我国2/3的耕地缺磷，土壤有效磷约占全磷量的2％～3％，而我国北方石灰性土壤有效磷含量仅占全磷量的1％，石灰性土壤以Ca-P磷为主，占全磷量的80％左右。施用磷肥可提高供肥能力，但肥料中70％以上的水溶性磷易与土壤中的Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+等离子结合，转化为难溶性磷酸盐，使得磷肥当季利用率普遍较低，一般在10％～20％。农业生产需要持续不断地磷投入与现有磷储量存在矛盾，2009年Gilbert曾在Nature杂志撰文论述磷的可持续利用，形容磷为一种正在消失的元素。全球磷矿储量约470亿t，仅有150亿t是可以开采的，按照现在的开采速度，现有磷矿资源将在300～400年后消失殆尽。2011年鄢正华报道我国目前用于开发生产磷肥的磷资源仅够用50年左右，因此活化土壤中大量难溶性磷是解决我国磷素危机的重要途径。土壤中溶磷微生物可提高土壤难溶性磷素的活化效率。因此，充分利用溶磷微生物活化土壤磷素的功能，提高植物磷素吸收效率及减少化学磷肥投入具有重要意义，也符合我国当前提出“减肥、减药”的重大战略目标(中央一号文件，2015)及可持续农业的发展方向。
微生物扩大培养，常规生产多以黄豆粉、麸皮、酵母粉等价格较高的农副产品为原料，生产成本较高，限制了微生物菌肥的进一步推广应用，据报道微生物菌肥生产原料占整个生产成本的30％～40％，因此，选择低成本的原料是微生物菌肥商业化生产及推广的关键。农业生产中产生的作物秸秆就地焚烧或者养殖过程中产生的禽畜粪便如果处置不当，不仅污染环境，也极大地浪费资源。因此，利用溶磷微生物提高土壤难溶性磷素的活化效率；利用农业废弃物生产溶磷微生物菌肥降低肥料成本，提高石灰性土壤中磷素利用效率，促进作物生长，提高作物产量是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能提高羟基磷灰石溶解度、修复铅污染环境的草酸青霉菌NJDL-03菌株，该菌株NJDL-03属于草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)，于2015年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.11061，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该NJDL-03菌株除了具有显著提高羟基磷灰石溶解度、修复铅污染环境的作用外，还具有活化土壤磷素、降解秸秆木质纤维素、拮抗植物病原真菌的作用。
本发明的另一目的在于提供上述NJDL-03菌株在提高羟基磷灰石溶解度、修复铅污染环境中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述NJDL-03菌株在溶磷草酸青霉菌肥中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种溶磷草酸青霉菌肥。该高效溶磷草酸青霉固体发酵菌肥能够提高羟基磷灰石溶解度，修复铅污染土壤；提高石灰性土壤中磷素利用效率，促进作物生长，提高作物产量。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种草酸青霉菌NJDL-03菌株，该菌株NJDL-03属于草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)，于2015年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.11061。
该菌株的主要生物学特性为在PDA培养基上最佳的生长温度28℃，培养4～5天，形成直径3～5cm的菌落，分生孢子梗呈扫帚状，分生孢子椭圆形。
该NJDL-03菌株除了具有显著提高羟基磷灰石溶解度、修复铅污染环境的作用外，还具有活化土壤磷素、降解秸秆木质纤维素、拮抗植物病原真菌的作用外。
所述的NJDL-03菌株在提高羟基磷灰石溶解度、修复铅污染环境中的应用。
所述的NJDL-03菌株在溶磷草酸青霉菌肥中的应用。该溶磷草酸青霉菌肥为活化土壤磷素、修复铅污染土壤的微生物菌肥。
一种溶磷草酸青霉菌肥，采用以下步骤制备：
(1)将NJDL-03菌株扩大培养获得NJDL-03液体种子；
(2)将NJDL-03液体种子接种到含有秸秆粉、蚯蚓粪、麦麸和稻壳的混合基质中进行固体发酵至孢子总数≥1010个/g。
上述的溶磷草酸青霉菌肥，其所述的混合基质中秸秆粉、蚯蚓粪、麦麸和稻壳的干物质重量比为6～9:6～9:3～1:1(w/w)，所述混合基质的含水率为50％～60％。优选的所述的混合基质中秸秆粉、蚯蚓粪、麦麸和稻壳的干物质重量比为8:8:2:1。
上述的溶磷草酸青霉菌肥，其所述的混合基质中有机质的重量百分含量为30％～40％，其中C：N＝25～30:1。
上述的溶磷草酸青霉菌肥，其所述混合基质的pH值为6.0～6.5。
上述的溶磷草酸青霉菌肥，步骤(1)中NJDL-03菌株扩大培养的过程为：将NJDL-03菌株接种到液体种子培养基中，在28～30℃条件下，摇床上培养40～48h；所述的液体种子培养基为PDA培养基。
上述的溶磷草酸青霉菌肥，其所述NJDL-03液体种子的接种比例为10％～20％(w/w)。
上述的溶磷草酸青霉菌肥，其所述固体发酵的条件为：发酵温度28～30℃，通气量1～3m3/h，压强0.01～0.05Mpa，间隔6h搅拌一次，转速50～70rpm，搅拌10～15min，发酵5～6天。
上述溶磷草酸青霉菌肥的详细制备过程为：
(1)将菌株NJDL-03扩大培养获得NJDL-03液体种子：从斜面上取2-3环真菌菌株NJDL-03的分生孢子，接种到200mL灭菌的液体种子培养基(g/L)中(以配制1L培养基为例：马铃薯200g，葡萄糖20g，pH自然，121℃灭菌20min)，置28～30℃，转速180r/m的摇床上培养40～48h，做NJDL-03液体种子。
(2)用包含秸秆粉、蚯蚓粪、麦麸和稻壳废弃物的混合基质生产溶磷微生物菌肥：将NJDL-03液体种子接种到包含秸秆粉、蚯蚓粪、麦麸和稻壳的混合基质中进行固体发酵，混合基质中秸秆粉、蚯蚓粪、麦麸和稻壳按6～9:6～9:3～1:1(w/w)的比例混合均匀，调节含水率50％～60％，装入50升不锈钢固体发酵罐中，调节pH至6.0～6.5，经121℃，30min灭菌后，冷却至30℃，按10％-20％(w/w)的比例接入NJDL-03液体种子，控制罐温28～30℃，通气量1～3m3/h，罐压0.01～0.05Mpa，间隔6h搅拌一次，转速50～70rpm，搅拌10～15min，发酵5～6天结束。经活菌计数，生产出的溶磷菌NJDL-03菌肥孢子总数≥1010个/g，获得NJDL-03的固体发酵微生物菌肥。
所述的混合基质中有机质的重量百分含量为30％～40％，其中C：N＝25～30:1。
本发明用秸秆粉：蚯蚓粪：麦麸：稻壳(6～9:6～9:3～1:1(w/w))作为混合基质固体发酵草酸青霉菌，孢子数量达到1010个/g，并且生产成本仅及常规发酵的1/3～1/2。因此，用农业废弃物生产溶磷草酸青霉菌肥是一种低成本高效的生产方法，所制备的溶磷微生物菌肥应用于石灰性土壤，将会有很好的应用前景。
本发明提供的草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)NJDL-03菌株及其利用秸秆粉、蚯蚓粪、麦麸、稻壳等废弃物原料固体发酵生产的微生物菌肥，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的溶磷NJDL-03菌株，分离自玉米根际，具有较高的溶磷效率，在以Ca3(PO4)2为唯一磷源的液体培养基中，该溶磷真菌能使Ca3(PO4)2溶液中可溶性磷浓度达到1200mg/L。该溶磷真菌能分泌草酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸。
(2)本发明提供的NJDL-03菌株在50mLPDA培养基中，培养4天对羟基磷灰石(Sigma-Aldrich标准羟基磷灰石样品，纯度大于99.9％)的最大溶解量为0.11g，即2.2g/L，而水中标准羟基磷灰石的溶解度为0.4ppm，即0.4mg/L，可显著提高羟基磷灰石的溶解度，释放出的磷酸根离子(PO43-)与环境中Pb2+反应，生成极易沉淀且十分稳定的羟基磷灰石铅[化学式Pb10(PO4)6(OH)2]，其溶解常数Ksp＝10-76.8，用于降低铅在环境中的有效性，修复铅污染环境。
(3)本发明提供的NJDL-03菌株，具有一定的拮抗植物病原真菌的作用，如对枯萎病的病原菌(尖孢镰刀菌)的拮抗作用达30％。
(4)本发明提供的NJDL-03菌株，具有较强的分解木质纤维素能力，在曼德尔液体培养基中培养5天，其纤维素滤纸酶活达到0.92U/mL。
(5)本发明提供的溶磷草酸青霉菌肥的主要原料之一是秸秆例如玉米秸秆、水稻秸秆或小麦秸秆等其量大价廉易得，主要生产原料之二蚯蚓粪，营养丰富，成本低廉。固体基质按一定比例配合，可完全满足溶磷真菌固体发酵生产的营养需求，且生产成本较常规发酵下降30％-50％，有利于溶磷微生物菌肥的推广应用。
(6)利用溶磷真菌NJDL-03将秸秆粉、蚯蚓粪、麦麸、稻壳等废弃物开发成高附加值的微生物菌肥。实验结果表明，在石灰性土壤中施用本产品后，可提高土壤磷素利用率，对提高农作物产量，减少化学磷肥使用量，保护环境具有重要意义。
附图说明
图1为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)NJDL-03的分生孢子梗及分生孢子形态。
图2为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)NJDL-03修复铅污染，活化石灰性土壤磷素应用流程图。
具体实施方式
1、菌株的分离和鉴定
采集健康玉米植株根际土壤，在以Ca3(PO4)2为唯一磷源的选择性培养上分离溶磷真菌，首先以溶磷圈的大小作为初筛指标，接着用液体摇瓶实验检测其溶解Ca3(PO4)2的能力，发现溶磷真菌菌株NJDL-03在蒙金娜无机磷培养基中，培养4天可使Ca3(PO4)2溶液中可溶性磷浓度达到1200mg/L。对菌株NJDL-03进行生物学鉴定和保藏，经鉴定该菌株NJDL-03属于草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)，并于2015年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.11061。
溶磷真菌NJDL-03属于草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)，主要生物学特性为：在PDA培养基上最佳的生长温度28℃，培养4～5天，形成直径3～5cm的菌落，菌落呈青绿色，分生孢子梗呈扫帚状，分生孢子椭圆形，如图1所示。
试验表明，菌株NJDL-03在50mLPDA培养基中，培养4天对羟基磷灰石(Sigma-Aldrich标准羟基磷灰石样品，纯度大于99.9％)的最大溶解量为0.11g，即2.2g/L，而水中标准羟基磷灰石的溶解度为0.4ppm，即0.4mg/L，显著增加羟基磷灰石的溶解度，释放出的磷酸根离子(PO43-)与环境中Pb2+反应，生成极易沉淀且十分稳定的羟基磷灰石铅[化学式Pb10(PO4)6(OH)2]，其溶解常数Ksp＝10-76.8，羟基磷灰石因此基于该菌株的溶解能力，可以释放大量的含P离子，然后与环境中的铅结合产生羟基磷灰石铅(铅磷灰石)沉淀，用于降低铅在环境中的有效性，从而修复铅污染环境。
该溶磷菌株NJDL-03，具有较强的分解木质纤维素能力，在曼德尔液体培养基中培养5天，其纤维素滤纸酶活达到0.92U/mL。
另外，该溶磷菌株NJDL-03，具有一定的拮抗植物病原真菌的作用，如对枯萎病的病原菌(尖孢镰刀菌)的拮抗作用达30％。
2、游离铅固定实验
从固体培养基取10环草酸青霉菌NJDL-03的孢子悬浮于50ml离心管中，加入40ml无菌水，涡旋均匀，取1ml上述孢子悬液接种于50ml液体培养基，28℃，180rpm培养，取培养2天的菌悬液离心，获上清液，设置不接菌培养基做空白对照，取8ml上清液与1g磷灰石(200目)于紫外灯下灭菌6小时后置于28℃摇床，180rpm反应20小时，用直径为0.45μm的滤膜过滤，取0.5ml滤液与1ml0.015mol/LPb(NO3)2反应，充分反应后10,000g离心5min，取上清液，稀释后用ICP测定溶液中Pb2+浓度，Pb2+浓度为0.004mol/L，铅浓度减少了0.011mol/L，铅去除率为73％，其铅浓度降低绝对值满足常见铅污染水体的处理需求。
3、溶磷草酸青霉NJDL-03菌肥生产
(1)菌株NJDL-03液体种子培养：将菌株NJDL-03的分生孢子接种到液体种子培养基中，进行液体种子培养，其发酵生产条件为：从斜面上取2-3环真菌菌株NJDL-03的分生孢子，接种到200mL灭菌的液体种子培养基中，培养基初始pH范围为6.0～6.5，培养温度范围28～30℃，溶氧：通气量体积比范围为30％～100％，转速为180转/min，发酵时间48小时，3000rpm离心10min，菌丝体含量为20％～25％；所用培养液配制方法为PDA培养基g/L(以配制1L培养基为例)：马铃薯200g，葡萄糖20g，pH自然，121℃灭菌20min。
(2)用秸秆粉、蚯蚓粪、麦麸、稻壳原料生产溶磷微生物菌肥：将NJDL-03发酵种子液接种到由秸秆粉、蚯蚓粪、麦麸、稻壳组成的混合基质中进行固体发酵(所述的秸秆粉采用玉米秸秆粉)，将固体发酵原料秸秆粉、蚯蚓粪、麦麸和稻壳按8:8:2:1(w/w)干物质重量比混合均匀，调节含水率55％～60％，装入50升不锈钢固体发酵罐中，调节pH至6.0～6.5，经121℃，30min灭菌后，冷却至30℃，按15％(w/w)的比例接入真菌的液体种子，控制罐温28～30℃，通气量1～3m3/h，罐压0.01～0.05Mpa，间隔6h搅拌一次，转速50～70rpm，搅拌10～15min，发酵5～6天结束。经活菌计数，生产出的溶磷菌NJDL-03孢子总数达1010个/g以上，获得NJDL-03的固体发酵微生物菌肥(如图2所示)。
4、铅污染土壤修复实验
采集南京郊区麒麟镇黄棕壤制备人工污染。所釆土样在干燥通风处自然风干，研磨过2mm孔径筛，混匀，污染Pb的添加浓度为2500mg/kg，以Pb(N03)2溶液的形式加入土壤后混匀，置通风处自然风干，老化60天后过2mm孔径筛，并充分混匀，土壤中Pb含量为2509.4mg/kg。
分别称取过8目的风干土样200g于500mL三角瓶中，加入10g羟基磷灰石(100目)，接种10g草酸青霉NJDL-03菌肥(1010cfu/g)到三角瓶中，与土样充分混匀，用去离子水调节土壤含水量至20％～25％，于室温(20℃～25℃)培养，设置空白及不接菌肥对照，各处理设置三个重复。培养30天后，取样烘干，分别用二乙三胺五乙酸(DTPA)溶液浸提有效态重金属铅，振荡过滤，测定滤液中铅的浓度，计算铅的固定效率来评价修复效果。结果见表1，只加入5％羟基磷灰石的土壤有效态铅的去除率为20.1％，接入5％草酸青霉NJDL-03菌肥+5％羟基磷灰石处理的土壤有效态铅的去除率为86.7％。
表1草酸青霉NJDL-03菌肥修复铅污染土壤的效果
5、活化石灰性土壤磷素土培实验：
实验用土壤采自安徽凤阳的石灰性土壤，pH值为7.7，速效磷6.37mg/kg，全磷0.75g/kg。取200g过20目筛风干的石灰性土壤，转入500ml三角瓶中。用去离子水调节土壤含水量至20％～25％，取NJDL-03菌肥10g(1010cfu/g)加入到三角瓶中，混匀，于室温(20℃～25℃)培养，设置不接菌肥的对照，培养30天后，取样检测土壤中速效磷含量为18.56mg/kg，较不接种对照土壤提高191.4％。土培实验表明溶磷草酸青霉NJDL-03菌肥具有显著的活化石灰性土壤磷素的功能。
6、玉米促生盆栽实验
考察溶磷草酸青霉NJDL-03菌肥活化土壤磷素的能力。试验土为采自安徽凤阳的石灰性土壤，以玉米盆栽试验研究溶磷微生物NJDL-03菌肥的应用效果。设置菌肥处理与不施菌肥对照，每盆装石灰性土壤5kg，各处理重复5次，按2％(w/w)的接种量，将100g溶磷草酸青霉NJDL-03菌肥与5kg石灰性土壤混匀，备用。玉米种子(京甜紫花糯2号)经表面消毒催芽后播种，每盆玉米种子4粒，7d后间苗，每盆留2株。50d后收获玉米植株，并采集盆栽土壤。测定玉米植株生物量，玉米植株磷含量，土壤速效磷含量，结果见表2。从表2可以看出溶磷微生物NJDL-03菌肥可以促进玉米植株生长，用NJDL-03菌肥处理后，玉米的茎粗、植株高和鲜重分别较CK增加29.5％、31.2％和62.7％，植株地上部磷素积累量及土壤速效磷分别较CK增加67.1％和49.5％。
表2草酸青霉NJDL-03菌肥活化土壤磷素及对玉米苗期生长的影响