检测E种肠道病毒抗体的诊断抗原VP1及试剂盒技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及检测E种肠道病毒抗体的诊断抗原及检测E种肠
道病毒抗体的试剂盒。
背景技术
牛肠道病毒（Bovineenterovirus,BEV）属于小RNA病毒科肠道病毒属中的成员,
分为E、F两个病毒种，所引起的感染给养牛业造成严重经济损失。本病自上世纪50年代首次
由Moll等报道以来，许多国家也相继报道了本病。申请人从吉林省多个地区暴发的临床上
以呼吸道和消化道症状为主要特征、发病率和致死率高达50%的牛群中分离鉴定出一种新
的肠道病毒-E种肠道病毒。E种肠道病毒感染在国内为新发传染病，严重威胁着养牛业的健
康发展，其诊断试剂、诊断方法和防治缺乏研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测E种肠道病毒抗体的诊断抗原。
一种E种肠道病毒基因VP1，它的碱基序列如序列表SEQIDNO.1所示；
所述的一种E种肠道病毒基因VP1为人工合成。
一种E种肠道病毒蛋白VP1，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。
一种用于检测动物血清中E种肠道病毒抗体的间接ELISA试剂盒，它的包被抗原
为氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示的蛋白VP1。
本发明提供了一种E种肠道病毒基因VP1，它的碱基序列如序列表SEQIDNO.1所
示，表达的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示的蛋白VP1作为包被抗原制备的一种用于
检测动物血清中E种肠道病毒抗体的间接ELISA试剂盒，安全、灵敏度高、特异性强、操作
简便快速、成本低。
本发明的优点
1、具有生物安全性。试剂盒所用的E种肠道病毒VP1抗原为纯化的基因工程表达产物，
不含牛肠道病毒，不存在潜在散毒危险；
2、灵敏度高、特异性强。通过免疫印迹技术，证实VP1蛋白、牛源高免血清具有良好的反
应原性、免疫原性，保证了该检测试剂盒的高度灵敏性。该试剂盒只检出E种肠道病毒抗体，
而牛病毒性腹泻、牛结核、牛口蹄疫、流行热阳性血清反应均呈阴性，表明该试剂盒具有特
异性；
3、操作简便快速。试剂盒4h即可报告结果，使用方便，一般技术人员按说明书即可操
作，条件一般实验室均可进行；
4、成本低，投资少。该试剂盒成本在2-3元/头份，成本低，投资少，见效快。
附图说明
图1pGEX-4T-1-VP1重组质粒酶切鉴定（泳道2、3：pGEX-4T-1-VP1；泳道1：pGEX-
4T-1质粒阴性对照；泳道4：DNA分子marker）；
图2重组VP1蛋白的SDS-PAGE检测结果（泳道3：pGEX-4T-1-VP1重组菌未诱导总蛋白；
泳道2：pGEX-4T-1-VP1重组菌诱导后总蛋白；泳道1：蛋白分子marker）；
图3纯化重组VP1蛋白的SDS-PAGE检测结果；
图4试剂盒各组分（（1）96孔抗体检测ELISA板，（2）样品稀释液，（3）10×浓缩洗涤
液，（4）封闭液，（5）HRP标记兔抗牛IgG工作液，（6）显色液A，（7）显色液B，（8）终止液，（9）阳
性样品对照，（10）阴性样品对照）。
具体实施方式
实施例1E种肠道病毒结构蛋白VP1原核表达重组质粒的构建
1、引物设计
根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增VP1基因的引物，上下游分别含有BamHI、
EcoRI酶切位点。引物序列如下：
E-VP1-FCGCGGATCCGAAACAAGCGTGGAGA（BamHI）
E-VP1-RCCGGAATTCGTACGAGGTGAGGCT（EcoRI）
2、基因扩增
常规Trizol法提取E种肠道病毒的基因组RNA，采用市售常规反转录试剂盒，按照说明
操作获得cDNA，并以其为模板分别扩增了VP1基因，PCR反应体系：
PCR运行条件：94℃预变性2min；94℃变性1min、54℃退火30sec、72℃延伸30sec，共30
个循环；72℃再延伸5min。反应结束后，取1μL进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测；
3、目标基因与pGEX-4T-1的连接、转化
采用分子生物学领域中的常规酶切、连接等技术，构建重组质粒pGEX-4T-1-VP1，并采
用CaCl2法将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态中。利用含100μg/mL氨苄霉素的LB培养平
板筛选阳性克隆，并进行常规增菌培养，收获菌体，提取质粒，进行BamHI/EcoRI双酶切鉴
定，如图1所示。
实施例2VP1重组蛋白的表达及纯化
将鉴定的阳性重组质粒pGEX-4T-1-VP1转化BL21(DE3)感受态细胞后，挑取单个菌落
接种到3mL含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中培养过夜，然后取1mL上述培养物
接种到200mL含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中37℃振摇培养至对数生长期
(OD600=0.6~0.8)，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，20℃诱导培养3h，经SDS-PAGE检测，获得
了重组目标蛋白VP1，如图2所示。离心沉淀菌体，超声破碎后以尿素纯化包涵体方法获得高
纯度的重组蛋白，如图3所示。
实施例3间接ELISA方法的建立及标准化
本发明以原核表达系统表达的VP1蛋白作为包被抗原，建立检测E种肠道病毒抗体的间
接ELISA与诊断试剂盒，通过以下步骤实现。
1、反应条件的建立
（1）方阵确定抗原包被浓度及酶标二抗最佳稀释倍数
采用方阵滴定法，确定包被抗原和酶标二抗最佳工作浓度。将制备的重组VP1抗原进行
稀释，分别以0.2、0.3、0.4和0.5μg/孔包被反应板，每个稀释度设8个重复孔，每孔100μL，
同时设置8个空白对照孔，每孔加入100μL包被液，置于4℃包被过夜。取出后用PBS-T洗涤3
次，每次5min。用5%脱脂奶粉37℃封闭30min，洗涤同上。加入用PBS-T稀释800×的阳性血
清及阴性血清样品，每孔100μL，37℃作用30min，洗涤同上。HRP标记羊抗牛IgG分别以
2000×、3000×和4000×稀释，37℃作用60min，洗涤同上。然后，向各孔加入新鲜配制的
OPD-H2O2底物显色液50μL，37℃避光显色10min。最后每孔加入50μL2mol/LH2SO4终止
液，轻轻混匀，在酶标仪上测定OD490值，计算出阴、阳性比值（P/N值），以P/N值最大所对应的
抗原浓度和HRP酶标二抗稀释度作为最优工作浓度。确定最佳抗原浓度为0.3μg/孔，而最
佳酶标二抗稀释倍数为1：3000（见表1）；
（2）将抗原包被于酶标板后，分别进行4℃过夜，37℃感作60min，37℃感作120min，按
上述方法进行实验，测定OD490值并分析P/N比值变化情况，由于后两种条件结果差异不显
著。确定抗原的最佳包被条件为37℃作用60min（见表2）；
（3）最佳封闭液及最佳封闭时间的确定
在上述确定的条件下，本实验分别以5%马血清、5%脱脂奶粉、2%BSA和1%BSA作为封闭
液，测定OD490值，并分析P/N比值变化情况，确定最佳封闭液为5%脱脂奶粉（见表3）。在5%脱
脂奶粉作为封闭液确定后，测定三种不同封闭时间（60min、90min、120min），确定5%脱脂
奶粉的最佳封闭时间为60min（见表4）；
P：阳性血清；N：阴性血清；P/N：为阳性血清与阴性血清OD490的比值
（4）HRP标记羊抗牛IgG最佳孵育时间的确定
在HRP标记羊抗牛IgG工作浓度确定的条件下，于37℃下将其分别作用30min、60min、
90min，测定OD490值，确定二抗最佳孵育时间为60min（见表5）；
P：阳性血清；N：阴性血清；P/N：为阳性血清与阴性血清OD490的比值
（5）最佳底物显色的确定
通过4组不同的OPD底物反应时间:5min、10min、15min、20min，用2MH2SO4终止液
终止反应，其他按步骤已优化条件进行，确定最佳底物显色时间为15min（见表6）；
（6）间接ELISA阴性和阳性判定标准的确定：
取18份采集的背景清洁牛血清样本，经中和试验方法检测为BEV抗体阴性后，用上述初
步建立的间接ELISA方法检测，以18份阴性血清的平均OD490值加减3倍标准差作为阴性和阳
性样品的临界值，大于该值为阳性，小于或等于该值为阴性。确定此临界值约为0.1；
（7）敏感性试验
本实验将24阳性血清样品及4份阴性血清样品进行适当稀释，应用间接ELISA方法对
上述样品进行检测，结果表明，间接ELISA方法敏感性为100%，敏感性极高（见表7）；
（8）ELISA的特异性试验
本实验应用建立的间接ELISA方法分别检测抗牛不同传染病的阳性血清包括牛病毒性
腹泻、牛结核、牛口蹄疫、流行热阳性血清。结果发现所建立的ELISA方法与牛其它传染病血
清有无交叉反应性，表明该方法具有高特异性（见表8）；
（9）重复性试验
板内、板间重复性实验：以建立的间接ELISA方法，分别应用同批次不同酶标板和不同
批次酶标板测定阳性血清及阴性血清的（各做4孔重复）OD490。.统计学分析显示板内阳性、
阴性血清检测百分率变异系数分别为3.8%、5.2%；板间阳性、阴性血清检测百分率变异系数
分别为4%、4.3%，均小于10%，说明检测方法重复性好（见表9）。
注：1、2、3、4为ELISA板编号。其中，板1、2为同一批次;板3、4为另一批次。
实施例4间接ELISA试剂盒组装
将建立好的间接ELISA方法中所用到的试剂盒材料：（1）96孔抗体检测ELISA板，（2）样
品稀释液，（3）10×浓缩洗涤液，（4）封闭液，（5）HRP标记羊抗牛IgG工作液，（6）显色液A，（7）
显色液B，（8）终止液，（9）阳性样品，（10）阴性样品。如图4所示。
将上述各组分分别用相应的广口瓶加以封装，贴上标签，组装成试剂盒，具体操作
如下：
（1）96孔抗体检测ELISA板：以pH9.5的碳酸盐包被液稀释重组VP1抗原，每孔加入300
μg，37℃感作2h；洗涤甩干后，以含5%脱脂奶粉的PBS-T溶液37℃封闭1.5h，洗涤后真空塑
封；
（2）样品稀释液（PBSpH7.4）：取NaCl8.0g；KH2PO40.2g；Na2HPO4·12H2O2.9g；KCl
0.2g溶于1000mL双蒸水，分装50mL/瓶；
（3）10×浓缩洗涤液：取NaCl80.0g；KH2PO42g；Na2HPO4·12H2O29g；KCl2g溶于
1000mL双蒸水;加入5mLTween-20，分装50mL/瓶；
（4）封闭液：取5g脱脂奶粉溶于100mLPBS，分装10mL/瓶；
（5）HRP标记羊抗牛IgG：由博奥森生物工程有限公司制备（北京）；
（6）显色液A：取OPD300mg溶于500ml双蒸水，10mL分装；
（7）显色液B：3%H2O210mL；
（8）终止液：取2mol/LH2SO444.5mL与双蒸水355.5ml混合，5mL分装；
（9）阳性血清样品对照：中和试验确定为E种肠道病毒的阳性血清按1:400稀释于样品
稀释液中，1mL分装；
（10）阴性血清样品对照：检测为E种肠道病毒的阴性血清按1:400稀释于样品稀释液
中，1mL分装。
实施例5间接ELISA试剂盒稳定性的确定
试剂盒4℃放置2、4、6、9九个月后，测定其特异性和敏感性。结果该试剂盒4℃保存6个
月后，检测效果与新包被ELISA方法无明显差异，表明该试剂盒4℃保存6个月后具有很好的
稳定性。
实施例6
人工合成碱基序列如序列表SEQIDNO.1所示的VP1基因，按实施例2方法表达蛋白
VP1，作为诊断抗原，制备的间接ELSA试剂盒，与实施例1的基因，效果相似。
<110>吉林大学
<120>检测E种肠道病毒抗体的诊断抗原VP1及试剂盒
<160>2
<210>1
<211>645
<212>DNA
<213>人工
<400>1
gaaacaagcgtggagagcttcttcggtaggtcagcactggttggcatgcccatccttgag60
aacggatcacgcgtcaccatgtggcgcattgacttcagggagtttgtccagctccgtgct120
aaaatgtcctggtttacttacatgagatttgacgtggagttcacaatcgtagcgaccaca180
gccaacacctccggttccgtcgaccagaacaatagattccaggtcatgtacgtccctccc240
ggggcaccacaaccggcagatcaagactcataccagtggcaatcgggctgcaacccctca300
gtgatagctgataccgaagggcccccggtgcaattctcagtgcctttcatgagcaccgct360
aacgcgtattccaccgtatacgatgggtacgcccggttcatgaacactgacccagacaag420
tatggtatattgcccagtaactttctcgggcttatgtactttaggtgccttgaggacacg480
catacccaaatgaggttccgtatctatgcaaagattaaacatacacagtgttggattccc540
cgagccccgagacaagcgccatataagaagagataccatcttgtgtttggtggcccaaac600
ttccaagacaagatctgcgctgacagggctagcctcacctcgtac645
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<211>215
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<213>人工
<400>2
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210215