一种仿过氧化物酶材料及其应用技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体包括一种仿过氧化物酶材料及其应用。
背景技术
过氧化氢(H2O2)是生命过程中重要的化合物之一，其水溶液称为双氧
水。在许多酶催化反应、抗原-抗体相互作用、蛋白质聚集过程中也伴随着
H2O2的生成和消耗，在临床医学、环境科学中H2O2是一种重要的活性中间
体。H2O2是人体内的必需物质，但是过量的H2O2会引起细胞死亡、组织的
损伤、新陈代谢紊乱，从而威胁健康，引起多种疾病，如帕金森病、心脏
病、老年痴呆症和肿瘤等。H2O2常在食品、医疗领域用作消毒剂，已被广
泛应用，然而其残留问题一直备受重视，它可以与淀粉生成具有致癌作用
的环氧化物。它还是一种重要的漂白剂、化工原料、化学促进剂，已被广
泛用于纺织、造纸、冶金、制药、精细化工、军工等领域，而工艺流程中
及工业废水中的H2O2含量需要有一定的控制。因此H2O2的检测在临床、
医药、食品、工业和环境监测领域中具有重要的意义。
目前，H2O2的定量检测方法主要有：滴定法、色谱法、分光光度法、
化学发光法、荧光分析法、电化学传感法等。滴定法(主要为高锰酸钾滴
定法)目测确定终点，操作简单，适应于常量分析，但耗时长，样品消耗
量大，灵敏度低，选择性差。化学发光法背景干扰低，线性范围广，灵敏
度高，检出限低，便于连续自动化操作，但此法设备昂贵，对操作人员的
技术要求高，难于在实验室普及化。电化学传感法操作简单，选择性好，
成本低，分析快速，灵敏度高，便于连续自动化操作，但是该方法的电极
修饰制作工序繁琐，并且若H2O2氧化电位过高时会引起其他电化学活性物
质的干扰。另外，该方法多采用酶传感器，而酶的制备较为复杂且不稳定，
长期放置后活性损失较大。分光光度法操作、设备简单，成本低，选择性
高，检测快速，灵敏度高，检出限低，，已在各领域得到广泛的利用。此法
常以辣根过氧化氢酶(HRP)为催化剂催化过氧化氢与显色指示剂反应，
然而酶易失活，稳定性差，因此限制了其在H2O2定量检测中的应用。为了
克服了这一缺陷，人们利用具有仿过氧化氢酶活性的无机催化剂(简称仿
酶)来替代HRP，然而这些仿酶材料的最适活性pH在弱酸性(pH3.5-4.5)，
不利于中性样品的检测，故不能完全替代在近中性或中性pH下(pH
5.5-7.4)具有催化活性的HRP。
葡萄糖是一种重要的生命物质，是生物的主要供能物质和新陈代谢的
关键中间产物。人体血液中的葡糖糖(血糖)含量的相对恒定对维持人体
的正常生理机能有着重要意义。糖尿病是一种高血糖症，严重威胁着人类
健康，血糖值低于2.8mmol/L时可诊断为低血糖，多见于甲状腺功能低下、
肾上腺皮质功能低下、肝功能低下、慢性腹泻等患者。因此，血糖的测定
及早期诊断对相关疾病的防治有着深远的意义。另外，食品加工、发酵工
业中葡萄糖含量的过程监控也是非常重要的。
目前，葡萄糖的定量分析方法主要有：高效液相色谱法、电化学生物
传感法、分光光度法等。高效液相色谱法应用广泛，但设备成本高且不易
携带。电化学生物传感法、操作简单线性范围宽、灵敏度高，但其电极修
饰过程繁琐，重现性定，稳定性差。分光光度法成本低，操作简单，检测
快速，可靠性强，已得到广泛应用。常规检测葡萄糖的分光光度法大致可
分为两种：葡萄糖氧化酶(GOx，EC1.1.3.4)法，葡萄糖在GOx催化下生
成葡萄糖酸和H2O2，再通过上述的分光光度法测定分析H2O2含量，从而实
现对葡萄糖的间接定量检测；己糖激酶法，葡萄糖和ATP在己糖激酶催化
下生成葡萄糖-6-磷酸(G6P)和ADP,G6P于NAD+在G6P脱氢酶催化下生成
6-磷酸葡萄糖葡萄糖内酯及NADH，对NADH进行分光光度法测定，NADH
与葡萄糖浓度呈正比。这两种方法中，GOx法操作简单、成本低、应用范
围广。
综上所述，采用分光光度法及GOx法进行对H2O2和葡萄糖定量分析
方法的开发。
发明内容
本发明的目的是提供一种仿过氧化物酶材料及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种仿过氧化物酶材料的应用，所述仿过氧化物酶材料AuAgNRs
可作为催化剂的应用。
优选是，所述仿过氧化物酶材料AuAgNRs可作为定性/定量分析的
催化剂。
进一步的优选，所述仿过氧化物酶材料AuAgNRs作为H2O2或葡萄
糖定性/定量分析的催化剂对H2O2或葡萄糖进行检测。
更优选是，所述仿过氧化物酶材料AuAgNRs在中性或近中性条件下
作为具有过氧化物酶活性的催化剂，用于对H2O2或葡萄糖进行定性/定量检
测。
所述检测H2O2或葡萄糖时加入有机显色剂；
所述有机显色剂为2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐
(ABTS)或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。
同时，所述检测葡萄糖时还加入葡萄糖氧化酶(GOx，EC1.1.3.4)。
所述仿过氧化物酶材料AuAgNRs为将氯金酸、聚二烯丙基二甲基
氯化铵(PDDA)、硝酸银加入到乙二醇(EG)溶液中，反应结束后离心洗
涤沉淀，即得到仿过氧化物酶(AuAgNRs)。制备过程的参考文献为：
Li,C.,etal.,One-potcontrollablesynthesisofAuAgheterogeneousnanorods
withhighlytunableplasmonicabsorption.ChemistryofMaterials,2013.25(13):
2580-2590。
具体的H2O2检测方法：
将待测样品与仿酶AuAgNRs、有机显色剂的水溶液在pH5.5-7.4下
混合，于一定温度下反应一定时间后，利用分光光度计或酶标仪检测反应
体系在特定波长下的吸光值，进而定性/定量地检测相应的待测物样品。
定量检测具体是，以不同浓度的H2O2标准液的反应吸光值绘制H2O2
标准曲线，再由待测样品的反应吸光值计算出待测样品的H2O2浓度。
所述的有机显色剂为2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐
(ABTS)或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。
具体的葡萄糖检测方法：
将待测样品与GOx、AuAgNRs、有机显色剂(ABTS或TMB)的水溶
液在pH5.5-7.4缓冲液混合，利用GOx和AuAgNRs分别催化的两个反
应相互耦联，在同一个反应体系下同时进行，于一定温度下反应一定时间
后，利用分光光度计或酶标仪检测反应体系的吸光值，进而定性/定量地检
测相应的待测物样品。
定量检测具体是，以不同浓度的葡萄糖标准液的反应吸光值绘制葡萄
糖标准曲线，再由待测样品的反应吸光值计算出其葡萄糖浓度。
本发明的效果是：
1.本发明利用一步法合成了具有过氧化物酶活性的AuAgNRs，并且
最适pH在6.5左右，在中性和近中性的pH下(pH5.5-7.4)表现出过氧化
物酶的活性，从而解决了多数仿酶无机材料仅在pH<5.5的条件下表现出过
氧化物酶活性的难题。
2.本发明将AuAgNRs应用于H2O2的定量分析，实现了在中性和近
中性的pH下(pH5.5-7.4)利用分光光度法对H2O2的定量检测。
3.本发明利用AuAgNRs及GOx实现了在中性和近中性的pH下(pH
5.5-7.4)利用分光光度法对葡萄糖的定量检测。该检测方法具有良好的选
择性，对其他糖(乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、蔗糖)无明显响
应。其应用于实际样品的测定，表现出良好的重现性、可靠性、准确性。
4.本发明的AuAgNRs具有较高的温度稳定性，100℃下孵育2小时
仍保留75％的活力。
5.本发明提供在中性和近中性的pH下发挥仿酶活性的材料，可用于
食品发酵、生物医药、化工、环境、生物技术等领域的定量分析和催化剂
等方面。
附图说明
图1为本发明实施例提供的AuAgNRs仿酶活性效果图；
图2为本发明实施例提供的AuAgNRs仿酶活性的pH优化效果图；
图3为本发明实施例提供的AuAgNRs在pH6.5和4.0处的催化活性
效果图；
图4为本发明实施例提供的H2O2的定量检测标准工作曲线；
图5为本发明实施例提供的葡萄糖的定量检测标准工作曲线；
图6为本发明实施例提供的AuAgNRs仿酶活性的温度优化效果图：
图7为本发明实施例提供的AuAgNRs仿酶活性的温度稳定性效果
图。
图8为本发明实施例提供的葡萄糖测定方法的选择性效果图。
具体实施方式
为了更清楚更深入地说明本发明的内容，下面将进一步列举一些实施
例，但本发明不局限于所列举的实施例。下列实施例中具体实验条件或方
法如未注明，均按本领域的常规条件或方法进行。
实施例1
仿过氧化物酶材料AuAgNRs的制备：
将0.6mmol/L(终浓度，下同)的氯金酸、30mmol/L的聚二烯丙基二
甲基氯化铵(PDDA)、6mmol/L的硝酸银加入到乙二醇(EG)溶液中，在
200℃下反应72小时后，离心洗涤沉淀(AuAgNRs)，用水将其重悬，
备用。
实施例2
AuAgNRs的仿酶活性：
实验体系a：催化反应体系为包含H2O2(5mmol/L)、上述实施例获得
的AuAgNRs(5μg)、有机显色剂ABTS(3mmol/L)的磷酸盐缓冲液(pH
6.5)。在室温(25℃)下反应10分钟后，利用酶标仪检测其390-550nm
内的吸光值。
另做两个对照试验：其中一个对照实验b的催化反应体系中不加
AuAgNRs，在与上述实验体系同样条件下反应10分钟后检测吸光值；另
一份对照实验c的催化反应体系为AuAgNRs(5μg)在磷酸盐缓冲液(pH
6.5)，在与上述实验体系同样条件下静置10分钟后检测吸光值；
如图1所示，实验体系a显示出明显的峰，说明AuAgNRs在pH6.5
处具有明显的仿过氧化物酶的活性；对照试验b在414nm附近无明显的峰，
说明若无AuAgNRs作催化剂将无明显反应；对照试验c在414nm附近
无明显的峰，说明实验体系a的峰不是AuAgNRs自身的响应峰。
实施例3
AuAgNRs仿酶活性的pH优化及pH6.5处活性的验证：
1.AuAgNRs仿酶活性的pH优化：催化反应体系为包含H2O2(5
mmol/L)、AuAgNRs(5μg)、有机显色剂ABTS(3mmol/L)的不同pH
的缓冲液(pH1.0-2.0，甘氨酸-盐酸缓冲液；pH3.0-6.0，柠檬酸-柠檬酸钠
缓冲液；pH6.5-8.0，磷酸盐缓冲液；pH9.0-10.0，Tris-盐酸缓冲液；pH
11.0-12.0，碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液)。在室温(25℃)下反应10分钟后，
利用酶标仪检测其414nm内的吸光值。如图2所示，AuAgNRs在中性
和近中性的pH下(pH5.5-7.4)表现出过氧化物酶的活性，并且最适pH
为6.5左右，从而解决了多数无机仿酶材料仅在pH<5.5的条件下表现出过
氧化物酶活性的难题。
2.AuAgNRs在pH6.5处活性的验证：催化反应体系为包含H2O2(5
mmol/L)、AuAgNRs(0或5μg)、有机显色剂ABTS(3mmol/L)的不
同pH的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.0或6.5)。利用酶标仪在室温(25℃)
下连续监测反应体系在414nm处吸光值的变化，吸光值随时间的变化速率
即代表催化活性。如图3的A图所示，无AuAgNRs时，近中性溶液(pH
6.5)中吸光值随时间无明显变化(曲线a)，而弱酸性溶液(pH4.0)中略
有变化(曲线b)，说明酸性环境本身具有一定催化效果；加入AuAgNRs
之后，pH6.5中(曲线d)的吸光值变化比pH4.0中(曲线c)的明显。将
A图中的加入AuAgNRs后的吸光值扣除无AuAgNRs时的吸光值后得
到的曲线中(如图3的B图所示)，pH6.5中(曲线b)的吸光值变化比pH
4.0中(曲线a)的明显，证明了AuAgNRs在pH6.5处较高的仿酶活性。
实施例4
H2O2的定量检测：催化反应体系为包含不同浓度的H2O2(0-20
mmol/L)、AuAgNRs(5μg)、有机显色剂ABTS(3mmol/L)的磷酸氢
二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.5)。在室温(25℃)下反应10分钟后，利用酶
标仪检测其390-550nm内的吸光值。由414nm处吸光值扣除空白对照后
绘制出H2O2标准工作曲线。如图4所示，线性范围0-10mmol/L。
实施例5
葡萄糖的定量检测：催化反应体系为包含不同浓度的葡萄糖(0-30
mmol/L)、GOx(2mg/mL)、AuAgNRs(5μg)、有机显色剂ABTS(3
mmol/L)的磷酸盐缓冲液(pH6.5)。在37℃下反应30分钟后，利用酶标
仪检测其414nm处的吸光值并绘制出葡萄糖标准工作曲线。如图5所示，
线性范围0-20mmol/L。
实施例6
实际样品中葡萄糖的测定：催化反应体系为包含实际样品(适当稀释
以使葡萄糖浓度在检测线性范围内)、GOx(2mg/mL)、AuAgNRs(5μg)、
有机显色剂ABTS(3mmol/L)的磷酸盐缓冲液(pH6.5)。在37℃下反应
30分钟后，利用酶标仪检测其414nm处的吸光值。利用葡萄糖标准工作曲
线求得实际样品中葡萄糖的含量，表现出良好的重现性、可靠性、准确性。
实施例7
AuAgNRs仿酶活性的温度优化及温度稳定性：
1).AuAgNRs仿酶活性的温度优化：催化反应体系为包含H2O2(5
mmol/L)、AuAgNRs(5μg)、有机显色剂ABTS(3mmol/L)的磷酸盐
缓冲液(pH6.5)。在不同温度(4-90℃)下反应10分钟后，利用酶标仪
检测其在414nm处的吸光值。如图6所示最适温度范围为20-40℃。
2).AuAgNRs仿酶活性的温度稳定性：AuAgNRs的水溶液在不同
温度(4-90℃)下孵育2小时。随后，将AuAgNRs加入到催化反应体
系中，检测其在414nm处的吸光值，如图7所示，40℃下孵育的AuAg
NRs几乎保留全部活力，而100℃下孵育的AuAgNRs也保留了75％的
活力。
实施例8
葡萄糖测定方法的选择性：催化反应体系为包含同浓度(5mmol/L)的
不同糖类物质(葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、蔗糖)、GOx
(2mg/mL)、AuAgNRs(5μg)、有机显色剂ABTS(3mmol/L)的磷酸
盐缓冲液(pH6.5)。在37℃下反应30分钟后，利用酶标仪检测其414nm
处的吸光值。如图8所示，该方法对其他糖无明显响应。