骨质疏松血清代谢标记物的测定方法及应用技术领域
本发明涉及绝经前后妇女骨质疏松血清中代谢标记物的测定方法及应用。具体涉及采
用气相色谱联用技术测定人血清中的代谢小分子物质，分析绝经前正常组(I组)及骨量减
少组(II组)、骨质疏松患者组(III组)和绝经后正常(IV组)血清之间的差异代谢物谱，
寻找与骨质疏松病理进程相关的差异代谢化合物，为骨质疏松早期及诊断提供技术支持。
背景技术
骨质疏松是一种以骨量减少，骨组织微结构发生破坏，骨脆性增加，骨折发生率增加的
代谢性骨病变。绝经后骨质疏松症是绝经后妇女的高发病症，为多因素性疾病：雌激素的缺乏、
遗传因素、营养状况、生活习惯、体格锻炼、月经周期紊乱、绝经早于40岁等均与发病有关，
但绝经后雌激素缺乏则是绝经后骨质疏松症发生的重要原因。在绝经后的妇女，第一个5～7年
中骨的丢失以每年1％～5％的速度递增。
目前，通过双能X线吸收技术对骨密度进行测定是骨质疏松早期发现和诊断的黄金标准，
此外还可通过对骨代谢生化指标，如BAP，OC，Tracp5b，PINP，NTX，CTX等进行测定来反
映骨代谢情况。骨密度检测可以在正常、较低以及骨质疏松情况下推测骨密度，并预测某些骨
折发生的风险。然而骨质疏松发生过程中是非常缓慢的，短时间内变化不明显，需要长时间的
观察和连续的检测，并且一旦发现骨质流失，骨密度降低则难以逆转，给临床病人的早期诊断
带来极大的困难。
代谢组学作为一门新兴热门的组学技术已在全球范围内引起了广泛的关注。目前，代谢
组学在疾病的生物标志物的筛选、早期的诊断等方面已经发挥了重要的作用。通过对机体内源
性小分子物质的检测，代谢组学可以直观反映不同病理状态下的代谢物变化，为骨质疏松早期
诊断及预防提供一种有力的技术支持，可为骨质疏松早期患者予以警示，一旦出现骨质疏松倾
向，便可结合具体的骨质疏松诊断技术进行骨密度测定，以达到预防的作用。GC-MS技术灵
敏度高，可同时检测几百个化学性质不同的化合物，包括有机酸，氨基酸，糖，糖醇，芳胺和
部分脂肪酸等小分子代谢物。
本发明采用GC-MS技术对正常和处于不同病理阶段的骨质疏松患者血清进行检测，实验
设计中考虑到雌激素对骨质疏松病理进程的影响，旨在发现与骨质疏松发展进程关联度高的血
清差异代谢物，为骨质疏松早期及诊断提供技术支持。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，通过GC-MS检测技术对血清生物样本进行检测，采集图
谱，将样本代谢物信息转化为可视多维矩阵，并通过对数据建模，鉴定不同病理组血清中差异
化合物，而后对鉴定出的差异内源性代谢物与骨密度进行关联性分析，并进行ROC曲线分析，
从而全面的反应随着骨量的逐渐减少血清中的代谢物变化情况。
本发明公开了一种骨质疏松血清代谢物的测定方法，采集不同病理组的血浆，离心得到血
清样本，加入3倍体积的含内标甲醇(内标：d27肉豆蔻，10μg/mL)提取，旋转蒸发仪挥干
后进行肟化和硅烷化处理，进GC-MC检测。再对数据的采集和处理，对不同病理组血清中内
源性小分子代谢物质进行PCA和PLS-DA计算，寻找不同病理组间的差异化合物。具体步骤
如下：
(1)收集血清样本，样本数量不少于382；
(2)将提供血清样本的病人按照骨质疏松进程分为绝经前正常组(I组)及骨量减少组(II
组)、骨质疏松患者组(III组)和绝经后正常(IV组)；
(3)采用GC-MS联用技术对血清样本进行分析；
(4)应用SIMCAP-11软件建立多维统计模型，寻找实验组别间的代谢差异化合物谱，所述
代谢差异化合物为骨质疏松病理进程中血清代谢标记物；
(5)采用关联分析及ROC曲线分析进一步确定与骨质疏松病理进程相关性较高的差异代谢
物。
本方法步骤(2)中根据骨质疏松的病理进程分组，分组考虑到激素的缺失与否以及骨量
缺失程度。
本方法步骤(3)中GC-MS分析条件如下：
色谱条件：色谱柱为石英毛细管柱Agilent19091S-433，325℃，30m*250μm*0.25μm，进
样量1μl，采用不分流进样模式，载气为氦气，流速为1ml/min，程序升温模式：70℃保持2
min，以10℃/min线性升温至300℃，300℃保持7min；
质谱条件：进样口温度为250℃，传输管温度250℃，离子源温度为150℃，采用全扫描
模式，离子扫描范围为50～550，扫描速度是2.91spectra/s，有300s的溶剂延迟，检测电压是
-1650V；
本方法步骤(4)采用SIMCAP-11软件对数据进行建模处理，寻找潜在差异代谢物，步骤
(5)采用关联分析及ROC曲线分析进一步确证所发现的血清代谢标记物与骨质疏松病理进程
的相关性及预测的准确性。
本方法步骤(5)中所述的骨质疏松血清差异代谢物有脂肪酸类化合物，包括油酸、亚油酸、
花生四烯酸、cis-11,14-二十碳二烯酸等,色氨酸和肌醇。
本发明的有益效果是：
本方法测定与骨质疏松病理进程有关的血清差异代谢物来体现患者骨质疏松程度，并考虑
到激素对骨质疏松病理进程的影响，测定方法简单，灵敏度高，对病人伤害小，可为临床骨质
疏松早期诊断及预防提供帮助和依据，对处于骨质疏松早期、大多生理生化指标尚不明确阶段
的患者予以警示。
附图说明
图1为全扫描模式下样本的总离子流图(横坐标—保留时间，纵坐标—峰强)。
图2为四组样本的PLS-DA得分图；A：绝经前骨量正常组与绝经后骨量减少组，
R2X＝0.235，R2Y＝0.638，Q2＝0.337；B：绝经前骨量正常组与绝经后骨质疏松组，R2X＝0.298，
R2Y＝0.664，Q2＝0.462；C：绝经前骨量正常组与绝经后骨量正常组，R2X＝0.254，R2Y＝0.618，
Q2＝0.375。黑色方块：绝经前正常组；黑色三角：绝经后骨量减少组；黑色星形：绝经后骨质
疏松患者；圆圈：绝经后骨量正常组。
图3为血清中差异代谢物的ROC曲线分析图；A：绝经前骨量正常组与绝经后骨量减少组；
B：绝经前骨量正常组与绝经后骨质疏松组；C：绝经前骨量正常组与绝经后骨量正常组。
具体实施方式
通过实施例对本发明进行详细描述。
(1)收集样品
参照世界卫生组织(WHO)推荐的诊断标准，骨密度值降低1～2.5个标准差为骨量减少
组，降低等于及大于2.5个标准差为骨质疏松组。基于以上标准，收集50～70岁年龄段绝经前
骨量正常及绝经后骨量正常、骨量减少和骨质疏松四个实验组血样。样本收集过程中，排除标
准如下：
a):已知影响钙或骨代谢疾病患者，如严重吸收不良综合征、炎症性肠炎、慢性肝病、酒
精性肝硬化、未得到有效控制的原发性甲状旁腺功能亢进者或甲状腺疾病、Paget’s骨病、骨
软化病等
b)：继发性骨质疏松症、类风湿性关节炎、痛风、多发性骨髓瘤等；
c)：严重心、肝(AST>正常上限的2倍)、肾疾病(血清肌酐浓度>177μmol/L)
d)：糖尿病患者(HbAlc>7.7％)
e)：1年内应用糖皮质激素(包括全身、外用、关节内、吸入)，雄激素，二膦酸盐，降
钙素，含钙或铝的抗酸剂，氟化物(不包括氟化水和局部牙科治疗)，雌激素，黄酮体，香豆
素累，肝素，抗惊厥药(苯二氮卓类除外)以及其他影响骨代谢的药物超过3个月；
f)：近3年有不良嗜好，如偏食，酗酒，吸烟，长期饮用咖啡因饮料。
(2)样品处理
取50μL血清，加入200μL内标甲醇(内标：d27肉豆蔻，10μg/mL)，震荡5min，
20000g*10min，转移150μL上清，减压挥干1.5小时。加入40mL甲氧胺吡啶溶液(15mg/mL，
将酮基或醛甲化)，涡旋振荡5分钟，37度放置16小时后，再加入40mL三甲基硅烷化
试剂(MSTFA+1％TMCS)衍生化，最后加入40μL甲基硬脂酸庚烷液(30μg/mL)，涡旋3
min，20000g*10min，转移90μL入GC进样小瓶待测分析样品。
(3)GC-MS测定
仪器：AgilentTechnologiesGC(7890)；MS(5975C)withTriple-Axisdetector；
色谱条件：色谱柱为石英毛细管柱(Agilent19091S-433；325℃；30m*250μm*0.25μm)；进
样量1μl，采用不分流进样模式，载气为氦气，流速为1ml/min，程序升温模式：70℃保持2
min，以10℃/min线性升温至300℃，300℃保持7min；
质谱条件：进样口温度为250℃，传输管温度250℃，离子源温度为150℃，采用全扫描
模式，离子扫描范围为50～550，扫描速度是2.91spectra/s，有300s的溶剂延迟，检测电压是
-1650V。
(4)差异代谢物鉴定
经GC/MS检测后，将谱图文件(图1)转化为由每个样品所得色谱图的保留时间，峰面
积的数据矩阵。采用内外标对数据进行矫正，并与NIST(mainlibandpublicinthenational
instituteofstandardsandtechnologylibrary2.0,2008)等数据库中标准化合物进行匹配及鉴定分
析，确证GC/MS检测出的化合物。使用SIMCA-P11软件进行多元数据的建模和分析，寻找
不同病理组间的差异化合物，用于骨质疏松早期发现与诊断。将实验样本作为观测变量，内标
标准化的峰面积作为响应变量建立数据矩阵，应用PCA及PLS-DA对数据进行降维处理，选
用几个主成分来描述组间或样本间的最大差异。PCA得分图可以观察样品的聚集、离散及离
散点。PLS-DA得分图可以观察组间差异，PLS-DA荷载图可计算造成这种区分的主要差异变
量，交叉验证法确定主成分的个数，R2X，R2Y，Q2Y为模型评价指标，分别表示所建模型对
响应变量的解释度，模型能够解释和预测的变量的程度，3个参数的范围从0到1，越接近1
表明模型解释或预测的能力越强。最后用t-test对上述差异变量进行统计分析，0.05为有显著
性差异，从而确定有显著性差异改变的变量，即为潜在的生物标志物。
(5)采用关联分析及ROC曲线分析进一步确定与骨质疏松病理进程相关性较高的差异代
谢物。
采用PCA分析，各组间区分不明显。
采用有监督模式的PLS-DA对数据进行计算(图2)，I组可与II、III组可显著性区分。从
模型拟合参数看出，随着骨质疏松疾病的发展，与正常组之间的代谢差异逐渐扩大。考虑雌激
素对组间代谢差异的影响，我们还设立了一组绝经后骨量正常组(IV)，I组可与IV组显著性
区分，表明激素缺失后，体内代谢发生急剧改变，但此时骨量并没有降低，这表明体内代谢物
的变化优先于骨量的变化，为骨质疏松的早期诊断提供技术支持。
通过PCA和PLS-DA分析，及t-test检验，鉴定出影响组间差异的比较重要的内源性代谢
物，详见表1。将这些差异代谢物与脊椎及腰椎骨密度进行Pearson相关性分析，表2中列出
了与脊椎或腰椎骨密度关联性较高的化合物，包括雌激素，二十碳五烯酸，油酸，cis-9-十六
烯酸，亚油酸，cis-11,14-二十碳二烯酸，花生四烯酸，肌醇，L-异亮氨酸，苯乙醇胺，色氨酸。
随后对这些与骨密度关联性高的化合物进行ROC曲线分析，结果见图3和表3。结果表明，
与绝经前骨量正常组相比，油酸、亚油酸、花生四烯酸、cis-11,14-二十碳二烯酸、色氨酸、肌
醇及苯乙醇胺在绝经后骨量减少组和骨质疏松患者血清中发生了显著的改变，与骨质疏松病理
发展过程相关度高，可为骨质疏松早期及诊断提供技术支持。随着骨质疏松病理进程有不同程
度的变化，其中油酸、亚油酸、花生四烯酸、cis-11,14-二十碳二烯酸在血清中浓度呈上升趋势，
而二十碳五烯酸呈下降趋势。色氨酸及苯乙醇胺在血清中浓度在雌激素缺乏而骨量未发生显著
改变时出现显著的升高，随着骨量逐渐减少，升高趋势变小、减缓。综上所述，血清中脂肪酸，
包括油酸、亚油酸、花生四烯酸、cis-11,14-二十碳五二烯酸，及肌醇，色氨酸的变化与骨质疏
松病理进程关联度高，可为绝经前后妇女的骨质疏松病理发展起到监测作用，为骨质疏松早期
及诊断提供有力技术支持。
表1各内源性小分子化合物的VIP、倍数改变及P值
“-”：VIP<1.