蕨类原丝体液体培养育苗方法技术领域
本发明属于蕨类植物种苗的培育方法，具体地，涉及一种蕨类原丝体液体培养育苗方法。
背景技术
蕨类是地球上现存最早出现的维管植物。许多蕨类因株形优美而极具观赏价值；同时，大量的蕨类具有药用或食用价值，深受广大消费者的喜爱。然而，由于长期、大量的无限制掠夺式采挖，加之生态环境恶化，野生蕨类资源遭到严重破坏，即使在原产地，很多野生蕨类分布也急剧减少，甚至灭绝，自然繁殖的蕨类植物已无法满足人们的需求。因此，生产中开始对具有重要经济价值的蕨类植物进行人工繁育和栽培。
目前，蕨类植物人工繁育主要采用营养体繁殖、孢子繁殖及组织培养等方法。
营养体繁殖是利用蕨类的根、根状茎、叶等部位产生无性芽孢，或通过顶端分生组织产生新的植株。这种方法简单、易行，技术要求不高，但增值速率小，需挖取野生苗株，对资源破坏很大，从长远角度综合考虑，此法有较大局限，并非最佳的蕨类种苗繁育方法。
组织培养技术是一种快速、有效的蕨类繁育方法，外植体用量少，对自然资源不造成破坏，增殖系数高，在种质资源保存、大规模现代化商品苗生产中优势显著。但是，目前通过组织培养成功繁育的蕨类较少，每种蕨类需要适宜的培养基及培养条件，筛选工作量大，培养基通用性不强，繁育周期长、种苗移栽成活率不高，需建立组织培养系统，设备、场地成本较高，操作技术要求严格，一般生产单位难以开展相关工作。因此，蕨类组织培养育苗技术也受到一定限制。
孢子繁殖是利用蕨类产生的孢子在固体基质中萌发后形成孢子体，再通过孢子体产生的配子体获得种苗。该方法具有成本低、技术要求不高、操作简便易行、繁殖量大等优点，尤其适于一般种植户使用，但这种繁育方式易受孢子萌发率、播种基质、播种密度、培养条件等因素影响，未萌发孢子易发生霉变，对配子体形成极为不利，而孢子组织培养相对复杂、繁琐。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有简单易行、且能有效避免未萌发孢子易发生霉变的孢子繁殖培育蕨类植物种苗的方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：
蕨类原丝体液体培养育苗方法，包括
孢子萌发步骤：将采收的孢子加到洁净清水中浸泡，去除水面的漂浮物和水分后，选择性地冻存预定时间以促进孢子萌发，加入适量洁净清水并用赤霉素处理以促进孢子萌发，处理后的孢子浸泡于水中培养，在培养初期选择性地使用杀灭或抑制外源性微生物生长的药物（如，选择性地使用抗菌剂以处理有细菌滋生的情况发生，或选择性地使用原生动物杀灭剂以处理有原生动物滋生的情况发生）；培养过程中在孢子沉淀区有气泡产生则表明孢子已萌发，原丝体开始生长，培养过程中若有孢子团块浮升于水面，应采用预定手段以使孢子团块沉降。
本发明中使用的赤霉素是广谱性植物生长调节剂，分布广泛，功能多样，可解除休眠，促进种子萌发，适当浓度的赤霉素可提高蕨类植物孢子萌发率。现有技术中通常将采收后的孢子播种于固体基质（通常为处理后的土壤）中培养、萌发，而土壤表层中的霉菌为好氧、异养型。液体内部环境中的含氧量较土壤表面低得多；同时本发明采用的是水培养环境，有机质含量极低(未萌发孢子释放的有机质很少，培养过程中通过换水可便捷快速地降低有机质含量)，无法满足异养型霉菌生长所需。故此，可防止蕨类孢子萌发及原丝体生长过程中发生霉变。
其中，在所述孢子萌发步骤中，冻存的温度为0至－20℃，冻存的时间为一周至一个月。
其中，在所述孢子萌发步骤中，是否需要冻存孢子是根据蕨类所生长的地区是否属于冬季室外温度在冰点以下的地区来进行选择的，具体为：当蕨类所生长的地区属于冬季室外温度为冰点以下的地区，则应进行冻存操作；若蕨类所生长的地区属于冬季室外温度为冰点以上的地区，则可选择不进行冻存的操作。
其中，在所述孢子萌发步骤中，所述漂浮物主要指的是漂浮于水面的孢子、孢子囊、和/或其他杂物。
其中，在所述孢子萌发步骤中，所述赤霉素的终浓度为100～300ppm，所述赤霉素处理时间为15分钟至24小时。
其中，在所述孢子萌发步骤中，所述处理后的孢子浸泡于水中培养时的条件为：15～20℃、自然光照，且培养容器具有能够避免外源性微生物或其它种类孢子进入培养容器从而导致污染的覆盖保护物。
其中，在所述孢子萌发步骤中，所述孢子浸泡于水中培养的过程中，需要定期或不定期地添加水，以保持培养容器中水的体积基本不变。
其中，在所述孢子萌发步骤中，所述抗菌剂优选农用链霉素，所述农用链霉素的终浓度为0.01~0.1％，所述原生动物杀灭剂优选替硝唑，所述替硝唑的终浓度为0.05~0.5mg/mL。
其中，在所述孢子萌发步骤中，所述预定手段可以为任何能够使孢子团块沉降的手段，具体地，如可以通过搅拌棒搅拌或者是晃动培养容器等方式实现。
其中，由于本发明为一种蕨类植物种苗的培育方法，因此，对使用的水应满足一定的细胞培养用水或植物培养用水的要求，都以避免外源性微生物对孢子造成污染为要求，具体地，本发明中所使用的水可为无污染的洁净河水、井水、或自来水，其中，深井水可直接使用；河水需要煮沸30分钟以上，以便使所含微生物和孢子灭活；自来水需要曝晒3天以上，同样需要煮沸30分钟以上。而对本申请所特别限定的洁净清水，最佳为灭菌水或经煮沸处理后的水，以避免杂菌污染。
其中，所述育苗方法还可以包括：
原丝体培养步骤：当孢子经过所述孢子萌发步骤培养至原丝体出现时在自然光照条件下继续培养，在培养物中按叶面肥剂量加入尿素和磷酸二氢钾，以促进原丝体的生长，培养过程中应采用预定手段（如前文所述，可采用搅拌等手段）以避免原丝体聚集、缠绕形成团块从而降低增值率，当培养容器中原丝体含量高于预定值时，采用扩大培养的方式继续培养。
蕨类原丝体可进行光合作用，液体培养在适当程度上提高了光照强度，促进了原丝体生长，加之培养过程中可适时扩大培养，故提高了原丝体的增殖效率。由于原丝体是在透光的玻璃容器中进行培养的，可随时换水、施肥，一旦出现霉变、染菌或滋生原生动物无法处理时，即可将污染组剔除，同时可根据原丝体生长情况适时扩大培养。因此，培养过程中可控性较孢子直接播种于土壤中要强得多。
其中，所述扩大培养的操作具体是：搅拌培养物后，按原液∶新液为（1～5）∶10的体积比接入新的培养容器，继续扩大培养。
其中，所述原丝体培养步骤中，原丝体含量高于预定值的判断可通过原丝体的状态进行，如当原丝体产生团块状时，可判定原丝体含量过高，高于预定值，为提高培养效率，可采用扩大培养的方式继续培养。
其中，所述育苗方法还可以包括：
配子体培育步骤、孢子体培育步骤、孢子体(幼苗)移栽步骤。
其中，所述配子体培育步骤为：选取无污染的腐殖土，pH6.0～7.0，阳光下曝晒，干透，粉碎，去除杂质，取适量作为基质并装盆至容积的2/3~4/5，另取上述处理后的腐殖土过50目筛网后覆于培养盆土表，厚度1~5cm，并通过预定方式使盆中土壤浸润，将经所述原丝体培养步骤获得的原丝体淋洒于培养盆土壤表面，并保证原丝体80％以上连片，置于光照环境中室温培养，培养的过程中应保持土壤湿润以及保持不利于异养型真菌滋生的温度（即，应避免低温），培养至配子体露出土壤表面。
其中，所述配子体培育步骤中，使盆中土壤浸润的预定方式可以将盆置于托盘中，向托盘中注水，从而可实现使盆中土壤浸润的目的。
其中，所述配子体培育步骤中，为增加幼苗得率，在将原丝体淋洒于培养盆后，若土壤表面仍有多处空白——无原丝体，可适时在土壤表面无原丝体空白处再次接种，也可直接采取多次接种的方式，以保证原丝体80％以上连片。
其中，所述孢子体培育步骤为：配子体露出土壤表面后，保持土壤湿润以使精子与卵子结合形成受精卵，继续培养直至出现孢子体幼苗。
若所述配子体培育步骤中接种原丝体时，培养盆内的原丝体100％连片，继续培养则可生成约20-50株/cm2孢子体幼苗。
其中，所述孢子体(幼苗)移栽步骤为：当孢子体长出3～4片叶后按4cm×4cm株行距进行第一次移栽，采用常规土壤作为基质，室内培养，第一次移栽7～15天小苗成活后，按株行距6cm×10cm移植到室外苗床上，继续培养，待小苗长至符合要求高度(10～15cm)后，于当年秋季或翌年春季按适当株行距定植于生产田中。
其中，所述育苗方法还可以包括：
田间日常管理操作：小苗移栽定植于生产田中后按常规要求进行操作。注意避免强光直射，适时施肥、浇水、除草，及时松土并清除病苗、死苗，防止病虫害。
其中，所述育苗方法还可以包括
孢子采集步骤：在孢子成熟时(不同蕨类在不同地区成熟季节不同)，待孢子叶由绿色变为黄褐色时(孢子散发前)，剪下孢子叶，干燥，室温贮藏或低温(低于4℃)贮藏以延长孢子活性，粉碎孢子叶，过100-200目筛网筛出孢子和孢子囊。
其中，所述孢子采集步骤中，所述孢子叶干燥后，根据蕨类所生长的地区是否是属于冬季室外温度在冰点以下的地区来选择是否进行冻存操作，具体为：蕨类所生长的地区属于冬季温度在冰点以下地区，孢子叶干燥后需在冻存一至三个月左右（冷冻温度约为－10℃至－20℃）以提高孢子萌发率，蕨类所生长的地区属于冬季温度在冰点以上地区，可选择不进行上述冻存的操作。
综上，本发明的有益效果是：
1、本发明利用液体环境培养孢子并促进其萌发成原丝体，可避免固体基质霉变造成的不利影响，通过冻存及赤霉素等多种方式提高孢子的萌发率。
2、原丝体液体培养体系可控性强，增殖效率高，同时避免固体基质霉变造成的不利影响，通过扩大培养可获得大量原丝体，在规模化育苗中意义很大。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所述的培育方法可适于各蕨类植物，包括但不限于以下所列举的几种具体的蕨类植物，主要是通过采用液体培养，可有效防止在孢子萌发及原丝体生长过程中发生霉变，提高原丝体的增殖效率，增强原丝体培养体系的可控性，以下实施例给出了不同蕨类植物种苗培育的示意性说明。
实施例1
1．孢子采集步骤：
在8月份以后，荚果蕨孢子成熟时，待孢子叶由绿色变为黄褐色时(孢子散发前)，选择连续晴天的下午(室外采集需待露水散尽后)，用干净剪刀将孢子叶剪下，置于干净光滑的纸袋中，风干干燥，室温贮藏或低温(低于4℃)贮藏以延长孢子活性，将上述所获孢子叶充分碾碎，100-200目筛网筛出孢子(及孢子囊)，去除杂质，获得孢子（含有孢子囊）。孢子叶干燥后需在冷冻室冷冻处理一个月左右（冷冻温度约为－20℃），以提高孢子萌发率。
2．孢子萌发步骤：
将获得的孢子用适量无污染洁净清水(最好是灭菌水或煮沸过的水，以避免杂菌污染)充分混匀并浸泡后，去除漂浮于水面的孢子、孢子囊、其他杂物和水分，于－20℃冻存一周以促进孢子萌发。加入适量洁净清水(要求同前述)，用终浓度100ppm赤霉素处理24小时左右，以促进孢子萌发。
处理后的孢子浸泡于水中(水质要求：无污染的洁净河水、井水、自来水。处理：深井水可直接使用；河水需要煮沸30分钟以上，以便使所含微生物、孢子灭活；自来水需要曝晒3天以上，同样需煮沸处理)，孢子悬浮液置于玻璃容器内，在15～20℃、自然光照条件下培养(培养容器可用纸张等覆盖物覆盖，避免外源性微生物或其它种类孢子落入，导致污染)。培养过程中注意经常添加处理后的清洁水，保持培养容器中水体积基本不变。
若培养初期有细菌大量滋生，可加入终浓度0.02％的农用链霉素处理；如果有大量原生动物滋生可加入终浓度0.1mg/mL的替硝唑处理。如果培养过程中在孢子沉淀区有气泡产生则表明孢子已萌发，原丝体开始生长，大量产生氧气泡时会将孢子团块浮升于水表，适当加以搅拌或其他可选的预定手段使孢子团块沉降至水底。
3．原丝体培养步骤：
培养约一周左右孢子开始萌发，2周后开始出现绿色原丝体。此时可在培养物中按叶面肥剂量加入尿素和磷酸二氢钾，以促进原丝体的生长。
培养过程中经常搅动，可避免原丝体聚集、缠绕形成团块而降低增值率。
当培养容器中原丝体含量过高时(即，出现团块)，可扩大培养，方法是：将培养物搅拌均匀，按原液∶新液为（1～5）∶10的体积比接入新的培养容器，继续扩大培养，增殖效率可达5倍以上。
4．配子体培育：
选取无污染的腐殖土(pH6.0～7.0)，阳光下彻底曝晒，干透，粉碎，去除杂质，取适量作为基质并装盆至容积的4/5，另取上述处理后的腐殖土过50目筛网，将所得细小腐殖土团粒覆于培养盆土表，厚度约5cm，然后置于托盘中，向托盘中注水，使盆中土壤充分浸润。
将培养所获原丝体混匀，淋洒于培养盆土表，使原丝体均匀分布，置于光照环境中室温培养，注意经常向托盘中注水，保持土壤湿润。避免低温，以防止异养型真菌的滋生。
培养约20天左右，土壤表面可见直径约1cm的绿色配子体。为增加幼苗得率，在配子体培育过程中，可适时在土壤表面无原丝体空白处再次接种，也可直接采取多次接种的方式，以保证原丝体最终80％以上连片。
5．孢子体培育步骤：
配子体出现后，保持土壤充分湿润，以使精子与卵子结合形成受精卵。继续培养直至开始出现孢子体幼苗。本实施例中，原丝体100％连片时可生成约20-50株/cm2幼苗。
6．孢子体(幼苗)移栽步骤：
当孢子体长出3～4片叶后按4cm×4cm株行距进行第一次移栽，采用常规土壤作为基质，室内培养。
第一次移栽7～15天小苗成活后，按株行距6cm×10cm移植到室外苗床上，继续培养。待小苗长至符合要求高度后(10～15cm)，于当年秋季或翌年春季按适当株行距定植于生产田中。
7．田间日常管理操作：
按常规要求进行。注意避免强光直射，适时施肥、浇水、除草，及时松土并清除病苗、死苗，防止病虫害。
实施例2
1．孢子采集步骤：
在8月份以后，蹄盖蕨孢子成熟时，待孢子叶由绿色变为黄褐色时(孢子散发前)，选择连续晴天的下午(室外采集需待露水散尽后)，用干净剪刀将孢子叶剪下，置于干净光滑的纸袋中，风干干燥，室温贮藏或低温(低于4℃)贮藏以延长孢子活性，将上述所获孢子叶充分碾碎，100-200目筛网筛出孢子(及孢子囊)，去除杂质，获得孢子（含有孢子囊）。孢子叶干燥后需在冷冻室冷冻处理三个月左右（冷冻温度约为－10℃），以提高孢子萌发率。
2．孢子萌发步骤：
将获得的孢子用适量无污染洁净清水(最好是灭菌水或煮沸过的水，以避免杂菌污染)充分混匀并浸泡后，去除漂浮于水面的孢子、孢子囊、其他杂物和水分，于－5℃冻存一个月以促进孢子萌发。加入适量洁净清水(要求同前述)，用终浓度300ppm赤霉素处理5小时，以促进孢子萌发。
处理后的孢子浸泡于水中(水质要求：无污染的洁净河水、井水、自来水。处理：深井水可直接使用；河水需要煮沸30分钟以上，以便使所含微生物、孢子灭活；自来水需要曝晒3天以上，同样需煮沸处理)，孢子悬浮液置于玻璃容器内，在15～20℃、自然光照条件下培养(培养容器可用纸张等覆盖物覆盖，避免外源性微生物或其它种类孢子落入，导致污染)。培养过程中注意经常添加处理后的清洁水，保持培养容器中水体积基本不变。
若培养初期有细菌大量滋生，可加入终浓度0.01％的农用链霉素处理；如果有大量原生动物滋生可加入终浓度0.05mg/mL的替硝唑处理。如果培养过程中在孢子沉淀区有气泡产生则表明孢子已萌发，原丝体开始生长，大量产生氧气泡时会将孢子团块浮升于水表，适当加以搅拌或其他可选的预定手段使孢子团块沉降至水底。
3．原丝体培养步骤：
培养约一周左右孢子开始萌发，2周以后开始出现绿色原丝体。此时可在培养物中按叶面肥剂量加入尿素和磷酸二氢钾，以促进原丝体的生长。
培养过程中经常搅动，可避免原丝体聚集、缠绕形成团块而降低增值率。
当培养容器中原丝体含量过高时(即，出现团块)，可扩大培养，方法是：将培养物搅拌均匀，按原液∶新液为（1～5）∶10的体积比接入新的培养容器，继续扩大培养，增殖效率可达5倍以上。
4．配子体培育：
选取无污染的腐殖土(pH6.0～7.0)，阳光下彻底曝晒，干透，粉碎，去除杂质，取适量作为基质并装盆至容积的2/3，另取上述处理后的腐殖土过50目筛网，将所得细小腐殖土团粒覆于培养盆土表，厚度约1cm，然后置于托盘中，向托盘中注水，使盆中土壤充分浸润。
将培养所获原丝体混匀，淋洒于培养盆土表，使原丝体均匀分布，置于光照环境中室温培养，注意经常向托盘中注水，保持土壤湿润。避免低温，以防止异养型真菌的滋生。
培养约20天左右，土壤表面可见直径约1cm的绿色配子体。为增加幼苗得率，在配子体培育过程中，可适时在土壤表面无原丝体空白处再次接种，也可直接采取多次接种的方式，以保证原丝体最终80％以上连片。
5．孢子体培育步骤：
配子体出现后，保持土壤充分湿润，以使精子与卵子结合形成受精卵。继续培养直至开始出现孢子体幼苗。本实施例中，原丝体100％连片时可生成约20-50株/cm2幼苗。
6．孢子体(幼苗)移栽步骤：
当孢子体长出3～4片叶后按4cm×4cm株行距进行第一次移栽，采用常规土壤作为基质，室内培养。
第一次移栽7～15天小苗成活后，按株行距6cm×10cm移植到室外苗床上，继续培养。待小苗长至符合要求高度后(10～15cm)，于当年秋季或翌年春季按适当株行距定植于生产田中。
7．田间日常管理操作：
按常规要求进行。注意避免强光直射，适时施肥、浇水、除草，及时松土并清除病苗、死苗，防止病虫害。
实施例3
1．孢子采集步骤：
在6月份以后，盆栽铁线蕨孢子成熟时，待孢子囊由绿色变为黄褐色时(孢子散发前)，选择连续晴天的下午(室外采集需待露水散尽后)，用干净剪刀将孢子叶剪下，置于干净光滑的纸袋中，风干干燥，室温贮藏或低温(低于4℃)贮藏以延长孢子活性，将上述所获孢子叶充分碾碎，100-200目筛网筛出孢子(及孢子囊)，去除杂质，获得孢子（含有孢子囊）。
2．孢子萌发步骤：
将获得的孢子用适量无污染洁净清水(最好是灭菌水或煮沸过的水，以避免杂菌污染)充分混匀并浸泡后，去除漂浮于水面的孢子、孢子囊、其他杂物和水分。加入适量洁净清水(要求同前述)，用终浓度200ppm赤霉素处理12小时，以促进孢子萌发。
处理后的孢子浸泡于水中(水质要求：无污染的洁净河水、井水、自来水。处理：深井水可直接使用；河水需要煮沸30分钟以上，以便使所含微生物、孢子灭活；自来水需要曝晒3天以上，同样需煮沸处理)，孢子悬浮液置于玻璃容器内，在15～20℃、自然光照条件下培养(培养容器可用纸张等覆盖物覆盖，避免外源性微生物或其它种类孢子落入，导致污染)。培养过程中注意经常添加处理后的清洁水，保持培养容器中水体积基本不变。
若培养初期有细菌大量滋生，可加入终浓度0.1％的农用链霉素处理；如果有大量原生动物滋生可加入终浓度0.5mg/mL的替硝唑处理。如果培养过程中在孢子沉淀区有气泡产生则表明孢子已萌发，原丝体开始生长，大量产生氧气泡时会将孢子团块浮升于水表，适当加以搅拌或其他可选的预定手段使孢子团块沉降至水底。
3．原丝体培养步骤：
培养约一周左右孢子开始萌发，2周以后开始出现绿色原丝体。此时可在培养物中按叶面肥剂量加入尿素和磷酸二氢钾，以促进原丝体的生长。
培养过程中经常搅动，可避免原丝体聚集、缠绕形成团块而降低增值率。
当培养容器中原丝体含量过高时(即，出现团块)，可扩大培养，方法是：将培养物搅拌均匀，按原液∶新液为（1～5）∶10的体积比接入新的培养容器，继续扩大培养，增值效率可达10倍以上。
4．配子体培育：
选取无污染的腐殖土(pH6.0～7.0)，阳光下彻底曝晒，干透，粉碎，去除杂质，取适量作为基质并装盆至容积的3/4，另取上述处理后的腐殖土过50目筛网，将所得细小腐殖土团粒覆于培养盆土表，厚度约3cm，然后置于托盘中，向托盘中注水，使盆中土壤充分浸润。
将培养所获原丝体混匀，淋洒于培养盆土表，使原丝体均匀分布，置于光照环境中室温培养，注意经常向托盘中注水，保持土壤湿润。避免低温，以防止异养型真菌的滋生。
培养约20天左右，土壤表面可见直径约1cm的绿色配子体。为增加幼苗得率，在配子体培育过程中，可适时在土壤表面无原丝体空白处再次接种，也可直接采取多次接种的方式，以保证原丝体最终80％以上连片。
5．孢子体培育步骤：
配子体出现后，保持土壤充分湿润，以使精子与卵子结合形成受精卵。继续培养直至开始出现孢子体幼苗。本实施例中，原丝体100％连片时可生成约20-50株/cm2幼苗。
6．孢子体(幼苗)移栽步骤：
当孢子体长出3～4片叶后按4cm×4cm株行距进行第一次移栽，采用常规土壤作为基质，室内培养。
第一次移栽7～15天小苗成活后，按株行距6cm×10cm移植到室外苗床上，继续培养。待小苗长至符合要求高度后(10～15cm)，于当年秋季或翌年春季按适当株行距定植于生产田中。
7．田间日常管理操作：
按常规要求进行。注意避免强光直射，适时施肥、浇水、除草，及时松土并清除病苗、死苗，防止病虫害。
如上所述，可较好的实现本发明。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。