无乳链球菌单克隆抗体及其制备方法和用途技术领域
本发明涉及一种无乳链球菌单克隆抗体及其制备方法和用途。
背景技术
罗非鱼是原产于非洲的热带鱼类，上世界七八十年代我国多次从国外引种，并选育出长势快、产量高、抗病力强的品种，此后迅速成功推广养殖。目前，我国不仅是世界上最大的罗非鱼养殖生产国，也是最大的罗非鱼出口国。国内罗非鱼养殖集中在广东、海南、广西、福建等南方地区。2009年开始在罗非鱼养殖密集区先后暴发罗非鱼“突眼症”，该病来势凶猛，发病率高达35％，发病鱼死亡率接近100％，且病害持续时间长，药物防治难以控制病情，养殖户损失惨痛。
及时准确的发现和诊断病原，是成功预防和治疗罗非鱼链球菌病的前提。目前，对于无乳链球菌的诊断，主要采用(1)分子生物学的方法，如PCR法进行诊断，该类方法依赖于贵重的仪器设备和专业的技术人员，检测时间长达4-6个小时，非常不利于在基层推广运用。(2)常规的分离培养法，依赖于专业操作人员的显微镜形态判断，容易造成误判，此类方法的培养时间长达18-24个小时，也不适用于无乳链球菌的快速检测。
发明内容
为了解决前述问题，本发明提供了一种新的无乳链球菌单克隆抗体及其制备方法。
本发明首先提供了一种产生无乳链球菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，它是由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的保藏号：CCTCCNO：C2015177的细胞株。
本发明表达单抗CE12的细胞株(分类命名为杂交瘤细胞株TWDB-WR-2)，于2015年10月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为：CCTCCNO：C2015177。
本发明提供了前述杂交瘤细胞株的方法，它包括如下步骤：
(1)以氨基酸序列如SEQIDNO.1所示重组蛋白为抗原，接种BALB/c小鼠，分离小鼠脾细胞；
(2)取小鼠脾细胞，与骨髓细胞融合，筛选，即可。
本发明提供了一种无乳链球菌单克隆抗体，它是由前述细胞株分泌的单克隆抗体。
本发明提供了前述单克隆抗体的方法，它包括如下步骤：
1)取前述杂交瘤细胞株，注射入BALB/c小鼠腹水中增殖；
2)收集腹水，使用ProteinGSepharose亲和层析柱纯化，即可。
本发明提供了前述无乳链球菌单克隆抗体在检测无乳链球菌中的用途。
本发明提供了前述无乳链球菌单克隆抗体在制备检测无乳链球菌的试剂中的用途。
本发明提供了前述无乳链球菌单克隆抗体在制备检测无乳链球菌的胶体金快速检测试纸中的用途。
优选地，待检样本为养殖水体或者鱼体。
采用本发明制备得到了无乳链球菌Sip单抗CE12，其本身的特异性强，仅与无乳链球菌结合，而与其他细菌无交叉反应，滴度高，结合能力强，采用该蛋白制备的无乳链球菌检测试纸灵敏度高、特异性强、重复性好，能准确检测实际样品，可以有效解决现有无乳链球菌检测存在复杂、不准确的问题，应用前景良好。
在本抗体制备的试纸成功研制之前，国际上尚无针对无乳链球菌的快速检测试纸的报道。从已有文献来看，研制该试纸所需要的生物材料非常难以制备和获取。因此，成功研制由本抗体制备的试纸在世界上尚属首次，处于世界领先水平。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本发明单抗的纯化结果；
图2水产常见细菌免疫印迹结果。1-A第一抗体：NC7b；1-B第一抗体：CE12；
图3试纸的结构，1：PVC底板；2：硝酸纤维素膜；3：胶体金垫；4：吸水垫；5：检测线；6：质控线；7：样品垫；
图4灵敏度检测结果。1：6×1010CFU/ml；2：6×109CFU/ml；3：6×108CFU/ml；4：6×107CFU/ml；5：6×106CFU/ml；CLine：质控线；TLine：检测线；
图5试纸条的特异性测试；
图6发病鱼组织及水体的检测结果。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照试剂盒说明书选择。
实验材料：
细菌：无乳链球菌TW3用于克隆和制备重组抗原，无乳链球菌(ATCC51487)、无乳链球菌C918(牛源)、无乳链球菌TW7(鱼源)、无乳链球菌TW10(鱼源)、鮰爱德华氏菌、粪肠球菌、海豚链球菌、豚鼠气单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、腐败希瓦氏菌、肺炎克雷伯氏菌、幽门螺杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、奇异变形杆菌、热带念珠菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌、弗氏柠檬酸杆菌、绿脓杆菌、溶血葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和淋病柰瑟氏菌由通威股份动物保健研究所保存。
实施例1本发明无乳链球菌Sip单抗NC7b的制备
1、杂交瘤制备
1.1重组抗原的制备
1)基因克隆。用Promega公司的DNA提取试剂盒提取无乳链球菌TW3的基因组DNA，根据无乳链球菌sip基因(罗非鱼源，HQ878436.1，Genbank)，设计如表1所示的引物，上下游引物分别包含BamHI和SalI限制性内切酶位点。采用设计的引物对扩增sip基因，扩增条件如下：DNA94℃预变性5min后，设置程序94℃、30s，55℃、35s和72℃、78s，共30个循环；然后72℃延伸10min。
2)转化、表达与纯化。将扩增后的sipDNA连接到pET32a载体上，该载体含有编码六聚组氨酸的序列。用pET32a-sip转化大肠埃希氏菌BL21。转化子在含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养。加入0.8mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并于37℃再培养5h，以表达带六聚组氨酸标签的重组Sip(rSip)。超声震荡提取含有rSip的可溶部分，然后使用IMAC亲和层析柱进行纯化和洗脱，并使用二喹啉甲酸检测试剂盒(Sigma-Aldrich)测定蛋白浓度。
表1用于表达sip基因的引物增子(～1302bp)
3)电泳和免疫印迹。对纯化的rSip进行SDS-PAGE电泳(凝胶浓度12％)，考马斯亮蓝染色或免疫印迹来显示蛋白质条，同时使用针对无乳链球菌的多抗，以检测rSip的活性。
用蛋白rSip作为生产单抗的免疫原和ELISA检测中的抗原，rSip的氨基酸序列(SEQIDNO.1)如下：
MEMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAQETDTTWTARTVSEVKADLVKQDNKSSYTVKYGDTLSVISEAMSIDMNVLAKINNIADINLIYPETTLTVTYDQKSHTATSMKIETPATNAAGQTTATVDLKTNQVSVADQKVSLNTISEGMTPEAATTIVSPMKTYSSAPALKSKEVLAQGQAVSQAAANEQVSPAPVKSITSEVPAAKEEVKPTQTSVSQSTTVSPASVAAETPAPVAKVAPVRTVAAPRVASVKVVTPKVETGASPEHVSAPAVPVTTTSTATDSKLQATEVKSVPVAQKAPTATPVAQPASTTNAVAAHPENARLQPHVAAYKEKVASTYGVNEFSTYRAGDPGDHGKGLAVDFIVGKNQALGNEVAQYSTQNMAANNISYVIWQQKFYSNTNSIYGPANTWNAMPDRGGVTANHYDHVHVSFN。
1.2免疫程序
用经弗式完全佐剂(Sigma-Aldrich)乳化(乳化方法：将抗原和弗氏完全佐剂等体积混合，吸入一支注射器内，取下注射器针头，用软管连接另一支注射器，扎带固定好软管，轮流推动两支注射器，使混合液通过软管在注射器之间来回流动，从而达到乳化目的)的25μg,50μg，100μg和150μgrSip蛋白分别腹腔注射雌性BALB/c小鼠(8周龄)。4和8周后，用经弗式不完全佐剂(Sigma-Aldrich)乳化的相同抗原再次注射(乳化及注射剂量同前)小鼠。第10周，最后单独腹腔注射rSip蛋白(注射剂量同前)一次。
1.3杂交瘤产生和针对Sip蛋白的单抗生产
最后一次加强注射后三天，获取免疫小鼠脾细胞(分离方法：取高免BALB/c小鼠，拉颈处死后，于75％酒精中浸泡3～5min，无菌操作打开腹腔，并小心取出脾脏至于平皿中，加入少量DMEM基础培养基漂洗2～3次，并仔细去除脾脏周围的结缔组织。然后在另一培养皿中倒入无血清将铜网盖于其上，取脾脏于铜网上，用研磨棒轻轻研磨，待细胞释放完全后，收集脾细胞，1000rpm离心10min)。根据Situ和Wu描述的方法：用50％(w/v)聚乙二醇4000(Sigma-Aldrich)，将脾细胞和骨髓瘤细胞S/P20以5:1的比例进行融合(细胞融合的步骤：S/P20细胞由成都中医药大学饶朝龙教授惠赠。融合步骤：取对数生长期的S/P20细胞与脾细胞按比例充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清液，用手掌轻击离心瓶底，打散沉淀的细胞。将离心瓶置于40℃水浴中，在1min内边旋转边加入1mlPEG4000，再加入15ml无血清RPMI-1640培养基终止融合，在90s内加完，由慢到快，前5s加1ml。室温静置10min，1000rpm离心10min，弃上清，将含HAT和15％胎牛血清的RPMI-1640培养基加到细胞融合物中，悬浮细胞，分配到已有饲养细胞的96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2的温箱中培养)，得到杂交瘤细胞。
筛选步骤1：
将得到的杂交瘤细胞在次黄嘌呤-氨蝶呤-胸苷培养基中培养，以5μg/ml的rSip作为包被抗原，用ELISA检测培养上清中的抗体，以筛选杂交瘤细胞，得到ELISA鉴定为阳性的杂交瘤细胞。
筛选步骤2：
将ELISA鉴定为阳性的杂交瘤细胞于BALB/c小鼠腹水中增殖。收集腹水，使用ProteinGSepharose亲和层析柱(GEHealthcareLifeSciences)纯化(纯化方法：用注射器穿刺吸取小鼠腹水，在4℃，12000g条件下离心15min除去较大的凝块。将处理好的腹水用0.02MpH7.0的PBS缓冲液稀释10倍，0.45μm滤膜过滤，然后上样流经0.02MpH7.0的PBS缓冲液平衡好的蛋白G亲和层析柱。用0.1MpH2.7的Gly-HCl为洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，并用1.0MpH9.0的Tris-HCl调pH至约7.0，最后透析脱盐并冷冻干燥)腹水中的rSip单抗。
将纯化的单抗(浓度2mg/ml)与胶体金液体结合，室温(RT)放置5min。加入5％PEG后，立即8000rpm离心30min。于12ml离心管中收集红色沉淀，用胶体金保护剂重悬，并稀释至工作浓度(通常OD532＝30-50)。然后将溶液置于4℃。
用0.1MPBS将另一单抗稀释至2mg/ml。用0.1MPBS将羊抗鼠IgG稀释至1.0mg/ml。前者用于包被NC膜上的检测线，后者用于质控线。然后将膜在37℃下保持24h。用BB缓冲液(ArtronBioResearchInc)封闭后，用WB缓冲液洗膜，然后室温干燥。
试纸条组装有样品垫、结合垫、反应膜和吸附垫。用自动切条机将试纸切成3mm小条。
将所有结合的-单抗与包被的-单抗配对，用于试纸条制备。将试纸条的样品垫插入无乳链球菌样品中，直至NC膜的一半浸入到液体中。室温下，3-10min后观察到质控线和检测线的形成。筛选对无乳链球菌显示出最强的阳性信号，对其它受试细菌显示出阴性结果的配对抗体。
细胞融合后共获得84个阳性细胞系。纯化所有84个单抗并用作试纸条组装的包被抗体/结合抗体。经过多次配对测试之后，找到NC7b-CE12配对显示出对无乳链球菌有最强信号，对其它细菌无信号。
将分别表达单抗NC7b和单抗CE12的杂交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株TWDB-WR-1和杂交瘤细胞株TWDB-WR-2，并于2015年10月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号分别为CCTCCNO：C2015178和CCTCCNO：C2015177。
2、单抗制备
取杂交瘤细胞株TWDB-WR-1和杂交瘤细胞株TWDB-WR-2分别按照如下方法制备单抗NC7b和单抗CE12：
取前述杂交瘤细胞株于BALB/c小鼠腹水中增殖，具体是将灭菌液体石蜡腹腔注射8周龄的BALB/c小鼠，0.5ml/只。7天后，将前述两株杂交瘤细胞株分别用无血清RPMI-1640培养基悬起，1000rpm离心5min，弃上清，洗去培养基中的血清，再用适量无血清RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，分别注射入小鼠腹腔，每只0.5ml(含约106个杂交瘤细胞。收集腹水(7天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水)，使用ProteinGSepharose亲和层析柱(GEHealthcareLifeSciences)纯化(纯化的具体步骤：用注射器穿刺吸取小鼠腹水，在4℃，12000g条件下离心15min除去较大的凝块。将处理好的腹水用0.02MpH7.0的PBS缓冲液稀释10倍，0.45μm滤膜过滤，然后上样流经0.02MpH7.0的PBS缓冲液平衡好的蛋白G亲和层析柱。用0.1MpH2.7的Gly-HCl为洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，并用1.0MpH9.0的Tris-HCl调pH至约7.0，最后透析脱盐并冷冻干燥)腹水中的rSip单抗。
纯化结果见图1所示，可以看出，本发明获得了纯品的单抗NC7b和单抗CE12。
3、单抗的鉴定
3.1免疫印迹
分别取步骤2制备得到的纯品单抗NC7b和单抗CE12rSip单抗，分别进行免疫印迹实验：免疫印迹实验中，测试了无乳链球菌和其它水产常见细菌。分别用三株抗无乳链球菌单抗作为免疫印迹的第一抗体。
结果如图2所示，单抗NC7b和CE12可特异性识别无乳链球菌，而与其它受试细菌无交叉反应。
3.2效价检测
请提供效价检测结果：
本发明制备得到表达无乳链球菌Sip单抗CE12的杂交瘤细胞株TWDB-WR-2，并制备得到了纯品单抗CE12，其特异性强，仅与无乳链球菌结合，而与其他细菌无交叉反应，同时，滴度高，结合能力强。
实施例2采用本发明无乳链球菌Sip单抗NC7b制备检测试纸的应用
1、检测试纸的制备
本发明试纸条为双抗体夹心法试纸条，试纸结构图图3所示：
胶体金制备：主要采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。在10mL体系氯金酸溶液中加入150μl柠檬酸钠，肉眼观察胶体金颗粒颜色均一，呈酒红色，有明显光晕，经电镜观察胶体金颗粒大小一致，颗粒直径在20nm左右。经紫外扫描金颗粒，其峰宽较窄，表明胶体金溶液分散性良好。
金标抗体的制备方法：取本发明单抗CE12(实施例1制备，浓度2mg/ml)，与胶体金液体结合，室温(RT)放置5min。加入5％PEG后，立即8000rpm离心30min。于12ml离心管中收集红色沉淀，用胶体金保护剂重悬，并稀释至工作浓度(OD532＝30-50)，4℃保存备用)。
将标记好的金标抗体包被于玻璃纤维膜上，制成胶体金垫：取金标抗体溶液加入到喷涂机的喷头储存瓶中，喷涂玻璃纤维膜，烘干，即为胶体金垫。
试纸组装(结构如图3所示)：PVC底板(1)上粘贴的硝酸纤维素膜(2)，样品垫(7)通过胶体金垫(3)与硝酸纤维素膜(2)一端连接，硝酸纤维素膜(2)另一端搭接有吸水垫(4)，所述硝酸纤维素膜(2)上靠近胶体金垫(3)的一侧固定有NC7b抗体作为检测区(5)，靠近吸水垫(4)的一侧固定有羊抗鼠IgG作为质控区(6)。
在胶体金垫上固定抗体的方法：取抗体，制成抗体溶液，加入到喷涂机的喷头储存瓶中，喷涂试纸，烘干，即可。
采用本发明试纸的测试方法：用本发明检测试纸的样品垫浸润待检样品，观察检测区和质控区是否显色，即可。其中，若试纸的检测区5和质控区6位置上均出现红色条带，则待检样品为检测阳性；若仅在质控区6位置上出现红色条带，而检测区5位置上无红色条带，则待检样品为检测阴性；若试纸条的质控区6位置上未出现红色条带，无论检测线位置上是否出现红色条带，检测结果都无效。
2、性质检测
2.1试纸条灵敏度测试
将无乳链球菌倍比稀释为6×1010CFU/ml至6×106CFU/ml，然后用试纸条测试以评估其最小检测数量。
2.2试纸条特异性测试
用试纸条测试无乳链球菌(ATCC51487)、无乳链球菌C918(牛源)、鮰爱德华氏菌、粪肠球菌、海豚链球菌、豚鼠气单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、腐败希瓦氏菌、肺炎克雷伯氏菌、幽门螺杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、奇异变形杆菌、热带念珠菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌、弗氏柠檬酸杆菌、绿脓杆菌、溶血葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和淋病柰瑟氏菌。
2.3试纸条重复性测试
分别用试纸条测试三个无乳链球菌样品和三个阴性样品，每个样品重复测试十次。
2.4实际样品测试
采集发病罗非鱼，解剖并取豌豆大小的待检组织(肝或脑)于1.5mlEp管中，捣碎后，加入1ml生理盐水，混匀后进行测试，同时无菌操作分离肝脏内的细菌，纯化后使用PCR体系进行检测，比较二者的检测结果。
3检测结果
3.1灵敏度测试结果
将无乳链球菌培养液10倍稀释至6×1010CFU/ml～6×106CFU/ml，以测试试纸条的灵敏度。当浓度为6×107CFU/ml时，可见微弱的T线，但当浓度继续降至6×106CFU/ml时，T线不会出现(图4)。图4显示该配对抗体的检测限为6×107CFU/ml。
表2无乳链球菌试纸条的检测限
无乳链球菌 血清型 分离源 检测限
TW3 Ia 鱼 6×107CFU/ml
TW6 Ia 鱼 1.1×107CFU/ml
TW7 Ia 鱼 1.3×107CFU/ml
TW9 Ia 鱼 1.1×106CFU/ml
TW10 Ia 鱼 1×107CFU/ml
TW31 II 牛源 阴性
3.2特异性测试结果
两个配对的快速检测试纸条对无乳链球菌具有高度特异性，与其它测试细菌无交叉反应(图5和表3)。
表3无乳链球菌试纸条的特异性测试
3.3重复性测试结果
阴阳性符合率均为100％(表4)。
表4重复性测试结果
3.4实际样品的检测
使用研发的无乳链球菌试制对发病罗非鱼及发病池塘的水体进行了检测，结果表明，发病鱼体内含有大量的无乳链球菌，而水体中没有检测到无乳链球菌(图6)，与PCR的检测结果一致，说明本发明方法检测结果准确。
试验结果说明，采用本发明单抗CE12制备的无乳链球菌检测试纸灵敏度高、特异性强、重复性好，可以准确检测实际样品。
综上，采用本发明制备得到了无乳链球菌Sip单抗CE12，其本身的特异性强，仅与无乳链球菌结合，而与其他细菌无交叉反应，滴度高，结合能力强，采用该蛋白制备的无乳链球菌检测试纸灵敏度高、特异性强、重复性好，可以准确检测实际样品，应用前景良好。