用于苦柯胺B质量控制中的参比化合物技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及三种用于苦柯胺B质量控制中的参比化合物及其制备工艺。
背景技术
苦柯胺B(KukoamineB)，化学结构下所示：
天然产物苦柯胺B(KukoamineB)是ShinjiFunayama等首次从地骨皮中分离提取的生物碱类化合物。苦柯胺B能有效拮抗导致脓毒症的细菌病原体相关分子—内毒素/脂多糖(endotoxin/lipopolysaccharide,LPS)和细菌DNA(CpGDNA)，对治疗脓毒症表现出良好活性，且作用明显优于阳性对照药物，因而具有良好的成药前景。
苦柯胺B在制备和放置过程中容易因为酸、碱、氧化等条件的改变而使得其有关物质增高。目前没有对苦柯胺B杂质的研究，也没有关于苦柯胺B杂质来源的详细研究报道。为了更好的研究苦柯胺B的药物性质，提高苦柯胺B的药物质量。实验人员对苦柯胺B的有关物质进行了分离、富集、分别收集，然后进行了结构确证。为了能够获得更大量的杂质样品，实验人员对其结构进行了分析，然后对其合成路线进行了研究。
实验过程中我们发现，苦柯胺B较不稳定，在无保护的水溶液情况下，极容易产生大量的杂质。如在较强酸性条件或酰胺水解酶的作用下极容易造成酰胺键断裂，从而造成多个活性基团的结合，形成杂质化合物。
通过对这些杂质化合物的控制，进一步提高苦柯胺B的质量标准。
中国专利CN201010539028.4公开苦柯胺B的合成路线如下：
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种用于苦柯胺B质量控制中的参比化合物，其结构如下：
本发明还提供化合物1的制备方法，包括以下步骤：
具体的，本发明所述化合物1的制备方法，包括以下步骤：
将化合物A5和三乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，将CBZCl用干燥二氯甲烷溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应，直至反应完全，浓缩二氯甲烷，加入稀盐酸、乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品，柱层析，得纯品化合物A6；
将化合物A6溶于四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液和RaneyNi，排尽空气后，于高压釜中搅拌反应，直至反应完全，抽滤，浓缩得粗品，柱层析，得纯品化合物A7；
将化合物A7溶于四氢呋喃中，加入甲醇，钯/碳后，排尽空气，常压室温下反应，直至反应完全，过滤，真空干燥得终产物。
优选的，本发明所述化合物1的制备方法，包括以下步骤：
化合物A5(0.1mol)、三乙胺(0.22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中，将0.1molCBZCl用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应，直至反应完全，浓缩有机溶剂，加入稀盐酸500ml、乙酸乙酯400ml×3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品，柱层析(洗脱剂：石油醚：乙酸乙酯＝1:2)，得纯品化合物A6；
化合物A6(0.08mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液800ml和RaneyNi7g，排尽空气后，约3MPa的氢气压力下，于高压釜中50℃条件下搅拌反应，直至反应完全，抽滤，浓缩得粗品。柱层析，得纯品化合物A7；
化合物A7(0.06mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入700ml甲醇，4.8g10％钯/碳后，排尽空气，氢气常压下室温反应，直至反应完全，过滤，真空干燥得化合物1。
本发明的目的之二在于，提供一种用于苦柯胺B质量控制中的参比化合物，其结构如下：
本发明还提供化合物2的制备方法，包括以下步骤：
具体的，本发明所述化合物2的制备方法，包括以下步骤：
将化合物0和三乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，将3,4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应，直至反应完全，浓缩二氯甲烷，加入稀盐酸、乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品，柱层析，得纯品化合物B1；
将化合物B1溶于四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液和RaneyNi，排尽空气后，于高压釜中下搅拌反应，直至反应完全，抽滤，浓缩得粗品，柱层析得纯品化合物B2；
将化合物B2和三乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，将3,4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应，直至反应完全，浓缩二氯甲烷，加入稀盐酸、乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品，柱层析，得纯品化合物B3；
将化合物B3溶于二氯甲烷中，室温搅拌下缓慢加入饱和的盐酸乙醚溶液，冰浴下反应，直至反应完全，浓缩，抽滤，得产物化合物B4；
将化合物B4溶于甲醇中，室温搅拌下滴入含有丙烯腈的甲醇溶液(0.5mL/mL)，滴加结束后，室温反应，直至反应完全，浓缩得化合物B5；
将化合物B5和三乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，将CBZCl用干燥二氯甲烷溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应约，直至反应完全，浓缩二氯甲烷，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品，柱层析，得纯品化合物B6；
将化合物B6溶于四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液和RaneyNi，排尽空气后，于高压釜中搅拌反应，直至反应完全，抽滤，浓缩得粗品，柱层析，得纯品化合物B7，
将化合物B7溶于四氢呋喃中，加入甲醇，钯/碳后，排尽空气，氢气常压下室温反应，直至反应完全，过滤，真空干燥得终产物。
优选的，本发明所述化合物2的制备方法，包括以下步骤：
化合物0(0.1mol)、三乙胺(0.22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中，将3,4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应约1h，直至反应完全，浓缩有机溶剂，加入稀盐酸500ml、乙酸乙酯400ml×3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品，柱层析，得纯品化合物B1。
化合物B1(0.08mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液800ml和RaneyNi4.3g，排尽空气后，约3MPa的氢气压力下，于高压釜中50℃条件下搅拌反应，直至反应完全，抽滤，浓缩得粗品，柱层析，得纯品化合物B2。
化合物B2(0.7mol)、三乙胺(0.22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中，将3,4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应约1h，直至反应完全，浓缩有机溶剂，加入稀盐酸500ml、乙酸乙酯400ml×3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。柱层析，得纯品化合物B3；
化合物B3(0.1mol)溶于600ml二氯甲烷中，室温搅拌下缓慢加入300ml饱和的盐酸乙醚溶液，冰浴下反应，直至反应完全，浓缩，抽滤，得产物化合物B4；
化合物B4(0.08mol)溶于400ml甲醇中，室温搅拌下滴入含有丙烯腈的甲醇(100ml)溶液，滴加结束后，室温反应，直至反应完全。浓缩得化合物B5；
化合物B5(0.06mol)、三乙胺(0.22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中，将0.06molCBZCl用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应，直至反应完全，浓缩有机溶剂，乙酸乙酯400ml萃取，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。柱层析，得纯品化合物B6；
化合物B6(0.06mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液800ml和RaneyNi4.3g，排尽空气后，约3MPa的氢气压力下，于高压釜中50℃条件下搅拌反应，直至反应完全，抽滤，浓缩得粗品，柱层析，得纯品化合物B7；
化合物B7(0.01mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入700ml甲醇，2g10％钯/碳后，排尽空气，氢气常压下室温反应，直至反应完全，过滤，真空干燥得化合物2。
本发明的目的之三在于，提供一种用于苦柯胺B质量控制中的参比化合物，其结构如下：
本发明还提供化合物3的制备方法，合成路线如下：
具体的，本发明所述化合物3的制备方法，包括以下步骤：
将化合物B7和三乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，将3,4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应，直至反应完全，浓缩二氯甲烷，加入稀盐酸、乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品，柱层析，得纯品化合物C1；
将化合物C1溶于四氢呋喃中，加入甲醇，钯/碳后，排尽空气，氢气常压下室温反应，直至反应完全，过滤，真空干燥得终产物。
优选的，本发明所述化合物3的制备方法，包括以下步骤：
化合物B7(0.06mol)、三乙胺(0.22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中，将0.06mol3,4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应，直至反应完全。浓缩有机溶剂，加入稀盐酸500ml、乙酸乙酯400ml×3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品，柱层析得纯品化合物C1；
化合物C1(0.01mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入700ml甲醇，2g10％钯/碳后，排尽空气，氢气常压下室温反应，直至反应完全，过滤，真空干燥得化合物3。
本发明的目的之四在于，提供本发明所述的三种化合物在苦柯胺B质量检测中的应用。
本发明的目的之五在于，提供一种苦柯胺B质量检测方法。
以本发明所述的三种化合物作为杂质对照品，对苦柯胺B的质量进行检测。
本发明所述的质量检测方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：精密称取苦柯胺B适量，置100ml量瓶中，加溶剂70ml，超声10分钟并不断振摇使苦柯胺B溶解，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
对照品储备溶液：精密称取化合物1、化合物2和化合物3对照品各适量，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含45μg的溶液，作为杂质对照品储备溶液；
苦柯胺B对照品溶液：精密称取苦柯胺B对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含45μg的溶液，作为对照品储备溶液；分别精密量取杂质对照品储备溶液和对照品储备溶液各5ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
色谱条件：
照中国药典2005年版二部附录ⅤD高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L磷酸二氢铵溶液-乙腈(600：470，混匀后用磷酸调节pH值为2.4～3.5)为流动相，柱温:40℃,流速为1.0ml/min；检测波长为252nm，苦柯胺B峰与化合物1、化合物2和化合物3峰之间的分离度均应大于6；
流速:1.2ml/min；
精密量取对照品溶液与供试品溶液各15μl,分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的12倍，苦柯胺B峰与化合物1、化合物2和化合物3峰之间的分离度均应大于6。
本发明所述的检测方法中，还可以选择加入化合物4作为对照品，对苦柯胺B的质量进行检测。
本发明所述的化合物4的结构如下：
优选的，本发明的检测方法在实施例中。
本发明提供的化合物1、化合物2、化合物3和化合物4可以为苦柯胺B的定性和定量分析提供对照品，从而提高苦柯胺B的质量标准，为苦柯胺B的临床用药提供重要的指导意义。
对本发明中所出现的名词进行解释：
CBZCl：氯甲酸苄酯
RaneyNi：雷尼镍
本发明所述的化合物1、2和3，作为检测苦柯胺B质量的参比化合物，具有非常重要的意义，可以进一步提高苦柯胺B质量检测的准确度，提高产品的质量标准，保证药物的安全性。
经过测试我们发现，本发明的检测方法具有精准度高、稳定性好和重复性好等特点。
说明书附图：
附图1化合物1-化合物4及苦柯胺B在色谱图中的位置示意图
附图2化合物1-化合物4及苦柯胺B色谱图面积百分比报告
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为限制。
化合物0的合成制备与3,4-二苄氧基苯丙酰氯的合成制备：参照CN201010539028.4进行合成。
化合物A5的合成采用专利CN201010539028.4公开的合成方法得到。
实施例1、化合物1的制备
67.6g化合物A5(0.1mol)、31.4ml的三乙胺(0.22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中，将0.1molCBZCl用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应约1h，通过薄层层析监控反应终点(硅胶板：GF254，展开剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，紫外灯下检视)，直至反应完全。浓缩有机溶剂，加入稀盐酸500ml、乙酸乙酯400ml×3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。柱层析(洗脱剂：石油醚：乙酸乙酯＝1:2)，得纯品化合物A6，1HNMR(400MHz,DMSO)：7.19(20H)，6.61(1H)，6.57(1H)，6.52(1H)，5.34(4H)，5.20(4H)，3.33(2H)，3.20(2H)，2.96(6H)，2.83(2H)，2.67(2H)，2.51(2H)，1.81(2H)，1.55(4H)。
64.8g化合物A6(0.08mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液800ml和RaneyNi7g，排尽空气后，约3MPa的氢气压力下，于高压釜中50℃条件下搅拌反应12±2h，通过薄层层析监控反应终点(硅胶板：GF254，展开剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，紫外灯下检视)，直至反应完全。抽滤(硅藻土助滤)，浓缩得粗品。柱层析，得纯品化合物A7，黄色油状物，1HNMR(400MHz,DMSO)：7.19(20)，6.61(1H)，6.57(1H)，6.52(1H)，5.34(4H)，5.20(4H)，3.33(2H)，3.20(2H)，2.96(8H)，2.83(2H)，2.65(2H)，2.51(2H)，1.81(2H)，1.55(4H)。
49g化合物A7(0.06mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入700ml甲醇，4.8g10％钯/碳后，排尽空气，氢气常压下室温反应15±2h，通过薄层层析监控反应终点(硅胶板：GF254，展开剂：正丁醇：水：醋酸＝4:1:1，紫外灯下检视)，直至反应完全。过滤,真空干燥得化合物1，1HNMR(400MHz,DMSO)：6.51(2H)，6.42(1H)，5.00(2H)，2.83(2H)，2.65(2H)，2.55(8H)，2.51(2H)，1.41(4H)，1.67(4H)。
实施例2、化合物2的制备
24.1g化合物0(0.1mol)、31.4ml的三乙胺(0.22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中，将3,4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应约1h，通过薄层层析监控反应终点(硅胶板：GF254，展开剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，紫外灯下检视)，直至反应完全。浓缩有机溶剂，加入稀盐酸500ml、乙酸乙酯400ml×3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。柱层析(洗脱剂：石油醚：乙酸乙酯＝1:2)，得纯品化合物B1，1HNMR(400MHz,DMSO)：7.19(10H)6.61(1H)，6.57(1H)，6.52(1H)，5.20(4H)3.57(2H)，3.20(2H)，2.83(2H)，2.67(2H)，2.51(2H)，1.55(4H)，1.40(9H)。
46.8g化合物B1(0.08mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液800ml和RaneyNi4.3g，排尽空气后，约3MPa的氢气压力下，于高压釜中50℃条件下搅拌反应12±2h，通过薄层层析监控反应终点(硅胶板：GF254，展开剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，紫外灯下检视)，直至反应完全。抽滤(硅藻土助滤)，浓缩得粗品。柱层析(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1)，得纯品化合物B2，黄色油状物，1HNMR(400MHz,DMSO)：7.19(10H)，6.61(1H)，6.57(1H)，6.52(1H)，5.20(4H)，3.20(4H)，2.96(2H)，2.83(2H)，2.65(2H)，2.51(2H)，1.81(2H)，1.55(4H)，1.40(9H)。
41.2g化合物B2(0.7mol)、31.4ml的三乙胺(0.22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中，将3,4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应约1h，通过薄层层析监控反应终点(硅胶板：GF254，展开剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，紫外灯下检视)，直至反应完全。浓缩有机溶剂，加入稀盐酸500ml、乙酸乙酯400ml×3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。柱层析(洗脱剂：石油醚：乙酸乙酯＝1:2)，得纯品化合物B3，1HNMR(400MHz,DMSO)：7.19(20H)，6.61(2H)，6.57(2H)，6.52(2H)，5.20(8H)，3.20(6H)，2.96(2H)，2.83(4H)，2.51(4H)，1.81(2H)，1.55(4H)，1.40(9H)。
93.3g化合物B3(0.1mol)溶于600ml二氯甲烷中，室温搅拌下缓慢加入300ml饱和的盐酸乙醚溶液，冰浴下反应6±2h，通过薄层层析监控反应终点(硅胶板：GF254，展开剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，紫外灯下检视)，直至反应完全。浓缩，抽滤，得产物化合物B4，1HNMR(400MHz,DMSO)：7.19(20H)，6.61(2H)，6.57(2H)，6.52(2H)，5.20(8H)，3.20(6H)，2.65(2H)，2.83(4H)，2.51(4H)，1.81(2H)，1.55(4H)。
66.6g化合物B4(0.08mol)溶于400ml甲醇中，室温搅拌下滴入丙烯腈(13.6ml,0.20mol)的甲醇(100ml)溶液，滴加结束后，室温反应5±2h，通过薄层层析监控反应终点(硅胶板：GF254，展开剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1)，直至反应完全。浓缩得化合物B5，1HNMR(400MHz,DMSO)：7.19(20H)，6.61(2H)，6.57(2H)，6.52(2H)，5.20(8H)，3.20(6H)，2.92(2H)，2.83(4H)，2.55(2H)，2.53(2H)，2.51(4H)，1.81(2H)，1.55(2H)，1.41(2H)。
53.2g化合物B5(0.06mol)、31.4ml的三乙胺(0.22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中，将0.06molCBZCl用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应约1h，通过薄层层析监控反应终点(硅胶板：GF254，展开剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1)，直至反应完全。浓缩有机溶剂，乙酸乙酯400ml萃取，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。柱层析，得纯品化合物B6，1HNMR(400MHz,DMSO)：7.19(25H)，6.61(2H)，6.57(2H)，6.52(2H)，5.20(10H)，3.33(2H)，3.20(6H)，2.83(4H)，2.67(2H)，2.51(4H)，1.81(2H)，1.55(4H)，1.41(2H)。
46.8g化合物B6(0.06mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液800ml和RaneyNi4.3g，排尽空气后，约3MPa的氢气压力下，于高压釜中50℃条件下搅拌反应12±2h，通过薄层层析监控反应终点(硅胶板：GF254，展开剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，紫外灯下检视)，直至反应完全。抽滤(硅藻土助滤)，浓缩得粗品。柱层析(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1)，得纯品化合物B7，黄色油状物，1HNMR(400MHz,DMSO)：7.19(25H)，6.61(2H)，6.57(2H)，6.52(2H)，5.20(10H)，2.96(4H)，3.20(6H)，2.83(4H)，2.65(2H)，2.51(4H)，1.81(4H)，1.55(4H)。
10.2g化合物B7(0.01mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入700ml甲醇，2g10％钯/碳后，排尽空气，氢气常压下室温反应15±2h，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。过滤，真空干燥得化合物2，1HNMR(400MHz,DMSO)：6.51(4H)，6.42(2H)，2.83(4H)，3.20(6H)，2.83(4H)，2.65(2H)，2.55(4H)，2.51(4H)，1.81(2H)，1.55(2H)，1.41(2H)。
实施例3、化合物3的制备
61.2g化合物B7(0.06mol)、31.4ml的三乙胺(0.22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中，将0.06mol3,4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴反应约1h，通过薄层层析监控反应终点(硅胶板：GF254，展开剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，紫外灯下检视)，直至反应完全。浓缩有机溶剂，加入稀盐酸500ml、乙酸乙酯400ml×3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。柱层析(洗脱剂：石油醚：乙酸乙酯＝1:2)，得纯品化合物C1，1HNMR(400MHz,DMSO)：7.19(35H)，6.61(3H)，6.57(3H)，6.52(3H)，5.20(14H)，2.96(4H)，3.20(8H)，2.83(6H)，2.51(6H)，1.81(4H)，1.55(4H)。
13.68g化合物C1(0.01mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入700ml甲醇，2g10％钯/碳后，排尽空气，氢气常压下室温反应15±2h，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。过滤，真空干燥得化合物3，1HNMR(400MHz,DMSO)：6.51(6H)，6.42(3H)，3.20(8H)，2.83(6H)，2.55(4H)，2.51(6H)，1.81(2H)，1.67(2H)，1.55(2H)，1.41(2H)。
实施例4、化合物4的制备
在产品的制备中存在3,4-二苄氧基苯丙酰氯遇水水解，带入下一步反应氢化后得到化合物4。
实施例5、化合物1、化合物2、化合物3和化合物4作为对照品在检测苦柯胺B药物中的应用。
供试品溶液的制备：精密称取苦柯胺B适量(约为0.15g)，置100ml量瓶中，加强酸溶液70ml，超声10分钟并不断振摇使苦柯胺B溶解，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
对照品储备溶液：精密称取化合物1、化合物2、化合物3和化合物4对照品各适量，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含45μg的溶液，作为杂质对照品储备溶液；
苦柯胺B对照品溶液：精密称取苦柯胺B对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含45μg的溶液，作为对照品储备溶液；分别精密量取杂质对照品储备溶液和对照品储备溶液各5ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
色谱条件：
照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录ⅤD)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L磷酸二氢铵溶液-乙腈(600：470，混匀后用磷酸调节pH值为2.4～3.5)为流动相，柱温:40℃,流速为1.0ml/min；检测波长为252nm。苦柯胺B峰与化合物1、化合物2、化合物3和化合物4峰之间的分离度均应大于6。
流速:1.2ml/min。
精密量取对照品溶液与供试品溶液各15μl,分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的12倍。苦柯胺B峰与化合物1、化合物2和化合物3峰之间的分离度均应大于6。
实施例6、化合物1的合成路线
实施例7、化合物2的合成路线
实施例8、化合物3的合成路线